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서 론

 활성산소종 (reactive oxygen species; ROS) 은 과산화수 소(H₂O₂), superoxide 음이온 (O₂^·−), 수산기(hydroxyl radical;OH), 산화질소 (NO), 과산화질산염 (peroxynitrite; ONOO⁻) 을 포함하는데 조직손상이나 증가된 유해반응과 관련되 며[1-4], 최근에는 전사인자 활성 , 유전자 발현 , 세포 분 화와 증식 등 세포조절물질로서의 역할이 보고되고 있다 [5-7]. 일반적으로 ROS 의 생성과 생물학적 반응성은 super-oxide dismutase 나 catalase, glutathione peroxidase 와같 은 내재성 항산화 활성에 의해 정밀하게 조절 된다[8]. 그러나 활성산소의 생성이 증가하거나 항산화 방어가 감 소하면 산화자극을 유발하게 되고 [9], 이는 세포내 단백 질, DNA, 지질등의 손상을 초래 한다 [10,11].

신경조직에서 ROS 는 다양한 경로를 통해서 얻어지는 데 미토콘드리아의 산화적 인산화반응 과정에서 superoxide (O₂^·−)의 생성 , 아라키돈산 산화과정에 의한 phospholipase A₂의 활성 , xantine dehydrogenase 에서 xantine oxidase 로의 전환 , NO synthease 활성에 의한 NO 생성 등으로 부터 얻어진다 [12,13]. 이 과정 중에서 가장 대표적인 경 우는 미토콘드리아의 전자전달계 (electron transport complex; ETC) 과정 중 complex I과 III 에서 superoxide 를 방출 하는 것이다 [14].

척수후각 뉴론의 미토콘드리아에서 발생된 ROS 가통 증조절에 관여한다는 연구가 최근에 보고되고 있는데 , 척 수신경을 결찰하여 신경병증성 통증을 유발시킨 흰쥐와 [15] 피부내 capsaicin 투여로 통증을 유발시킨 생쥐에서 [16] 척수후각 뉴론의 미토콘드리아에서 superoxide 가증 가됨이 관찰되었고 , 척수에 전자전달계 억제제 투여에 의 해 superoxide 의 증가와 통증 행동반응의 증가를 나타냈 다[13]. 또한 superoxide dismutase (SOD) 유사물질인 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMPOL) 처치에 의해 몇 가지 만성통증 모델에서 통 증을 감소시켰는데  [17-19], 이는 척수후각 뉴론으로부터 발생된 superoxide가 만성통증을 발생시키는데 주요한 발생원이며 그것의 감소가 통증을 억제시켰다고 생각할 수 있다.

이와 같이 통증과 미토콘드리아에서 발생되는 ROS와의 밀접한 관련성이 있음에도 불구하고 발생된 ROS가 통증전달에 관여하는 세포에 작용하여 효과를 나타내는 직접적인 증거는 보고되지 않고 있다. 따라서 이 연구에서는 실제로 미토콘드리아에서 발생된 ROS가 통증조절에 관여하는지를 알아보고자 통각을 전달하는데 일차적 중계역할을 하는 척수후각의 아교질 신경세포에서 막전압과 전류를 기록하였고 여러 가지의 전자전달계 작용약물이 어떠한 효과를 나타내는지를 patch clamp 방법으로 조사하였다. 

재료 및 방법

척수절편 제작

생후 13일-20일 된 Sprague-Dawley 흰쥐를 암수 구별없이 사용하였으며 이 연구는 원광대학교 동물실험 윤리위원회에서 승인을 얻었다(WKU09-076). 흰쥐를 ether로 마취한 후 20% urethane (2 ml/Kg)을 복강 내 투여하였다. 흉추에서부터 천추까지 척추제거술(laminectomy)을 하여 척수를 노출한 후 요천수 팽대부(lumbosacral enlargement)에서 1 cm 정도 길이의 척수를 절단하였다. 조직절편기 (vibratome 752M, Campden, 영국)의 고정대에 agar block을 먼저 고정한 후 순간접착제를 이용하여 척수절편을 고정하였다. 95% O_²  -5% CO_² 를 공급하면서 두께 350 μm의 척수절편을 얻었는데, 절단 중 계속 온도 조절기(model 765, Campden, 영국)를 이용하여 용액의 온도를 1-2^o C 정도로 낮게 유지 시켰다. 척수절편은 32^oC의 인공 뇌척수액 용액에 1시간 정도 보관하여 정상상태로 회복시켰고, 이후에 실온에서 실험을 시행하였다. 기록은 척수절편을 현미경(BX50WI, Olympus, 일본) 위의 기록용기(1 ml)에 옮긴 후 치실로 만든 그물로 움직이지 않도록 고정한 후 시행하였고, 실험기간 동안 계속해서 95% O_² -5% CO_² 가 포함된 용액을 관류펌프(Minipuls 3, Gilson, 프랑스)를 이용하여 관류시켰다(2-3 ml/min).
 

실험용액

막전압을 기록하기 위한 세포외 용액의 조성은 117 NaCl,3.6KCl, 2.5 CaCl₂ , 1.2 MgCl₂, 1.2 NaH₂PO₄, 25 NaHCO₃,11 Glucose 이었고 95% O₂-5% CO₂를 공급하여 pH를7.4로 유지하였다. 세포내 용액은 150 K-Glu, 10 HEPES, 5 KCl, 0.1 EGTA, 5 MgATP, 0.3 Na GTP를 사용하였고, pH는 KOH를 첨가하여 7.3으로 조정하였으며, Ca²⁺ 농도를 높인 용액은 CaCl₂를 100 μM 추가하고 EGTA를 제거하였다. Rotenone은 DMSO (dimethyl sulfoxide; Sigma)에 먼저 녹인 후 최종농도로 세포외 용액에 희석하여 사용하였고, 그 외의 약물은 실험직전에 세포외 용액에 녹여 사용하였다. 세포에 대한 실험용액의 적용은 중력을 이용한 관류장치(BPS-4SG, Ala Scientific Instruments, 미국)를 이용하여 기록용기 내 용액을 교환하였다. 

전기생리학적 기록방법

막전압 기록은 gramicidin을 이용한 perforated patch clamp 방법을 사용하였다. 미세 유리전극 제조기(PP-830,Narishige, 일본)와 microforge (MF-830, Narishige, 일본)를 이용하여 외경 1.5 mm의 연질 유리미세관 (TW150-3, WPI, 미국)을 저항이 5-8MΩ이 되도록 기록전극을 제작하였다. Gramicidin (Sigma, 미국)을 먼저 DMSO에 2.5-5mg/ml의 농도로 녹인 후 세포내 용액에 2.5-5 μg/ml의 농도가 되게 희석시켜 사용하였다. 기록전극을 gramicidin 이 포함된 용액으로 채우기 전에 먼저 전극의 끝 쪽에 gramicidin이 포함되지 않은 용액으로 채워 세포와의 부착을 용이하게 하였다. 미세 전극조절기(ROE-200, Sutter,미국)를 이용하여 세포와의 gigaohm seal을 이루었다. Gigaohm seal을 이룬 후 15-20분 경과하여 막전압이 −45mV 이하로 안정되었을 때 기록을 시작하였다. 전압측정에는 Axopatch 200B 증폭기(Axon, 미국)를 사용하였고, 이 증폭기는 Digidata 1200B (Axon, 미국) AD변환기를 통하여 컴퓨터에 연결하였으며, pCLAMP software (version 9.0, Axon, 미국)를 사용하여 실험수행의 명령과 얻어진 전기신호의 저장 및 분석에 이용하였다. 발생된 전류는 low pass 8-pole Bessel filter로 2 kHz로 여과하였다. 모든 실험은 실온에서 시행하였다. 

실험자료의 분석

막전압의 분석은 Clampfit (version 9.0, Axon, 미국)을 이용하였다. 약물처리군 사이에 통계적으로 유의한 차이가 존재하는지의 여부는 independent t-test를 이용하였고, p < 0.05에서 통계적으로 유의하다고 판정하였다. 통계자료의 값은 평균값 ±표준오차(mean ± SEM)로 표시하였다. 

연구성적

척수 후각세포 흥분성에 대한 전자전달계 억제제의효과

척수후각 세포에 대한 전자전달계 작용약물의 효과를 조사하기 위하여 patch clamp 방법을 이용하여 막전압을 기록하였다. 전류기록법으로 지속적으로 막전압을 기록하면서 전자전달계 I 복합체 억제제인 rotenone 2 μM을 5-10분간 처리하였는데 약물 주입 후 1-3분부터 1-10 mV의 크기의 탈분극이 관찰되었다 (2.1 ± 0.7 mV, n = 8). III 복합체 억제제인 antimycin A 5 μM을 투여하였을 때는 1.7 ± 0.8 mV (n = 10)의 탈분극이 관찰되었고 IV 복합체 억제제인 sodium azide 2 mM을 투여하였을 때는 −0.3 ± 0.4mV로 막전압에 변화를 보이지 않았다(Fig. 1). 

Fig. 1. Effects of mitochondrial complex inhibitors on membrane potential of substantia gelatinosa (SG) neurons in patch clamp recording. (A) Application of rotenone (5 uM), a complex I inhibitor (a), antimycin A (5 uM), a complex III inhibitor (b), induced membrane depolarization. Sodium azide (2 mM), a complex IV inhibitor, did not induce membrane depolarization. (B) Bar graph showing complex inhibitors-induced membrane potential changes. Means ± SEM.

척수 후각세포 흥분성에 대한 전자전달 복합체 기질의 효과

전자전달계 복합체 억제제가 막전압을 탈분극 시키는 효과가 크지 않아 복합체의 기질(substrate)을 투여하여 막전압의 변화를 관찰하였다(Fig. 2). 복합체 I의 기질로 알려진 malate를 10 mM 투여하였을 때 5.5 ± 0.4 mV (n = 80)의 탈분극이 관찰되었고 그 중 일부의 세포에서는 약물 투여 후 활동전압이 발생되었으며 이는 약물이 포함되지 않은 용액으로 처리하였을 때 서서히 원상태로 회복되었다. 복합체 II의 기질인 succinate 10 mM을 투여하였을 때는 2.9 ± 0.5 mV (n = 14)의 탈분극이 발생하여 기질에 의한 효과는 malate가 succinate에 비하여 통계적으로 유의하게 큰 탈분극을 보였다(p < 0.001).

Fig. 2. Effects of mitochondrial substrates on membrane potential of SG neurons. (A) Application of malate (10 mM), a complex I substrate, applied for 5 min caused a reversible membrane depolarization and firing activity (a). The malate-induced reponses were not increased by the addition of rotenone (b) and antimycin A (c). Application of succinate (10 mM), a complex II substrate, induced membrane depolarization, but the membrane potential changes were less prominent than those of malate. (B) Bar graph showing membrane potential changes by mitochondrial substrates. # : Values are significantly different from the malate by paired t-test (p<0.01). * : Values are significantly different from the malate by independent t-test (p < 0.001). Means ± SEM.

복합체의 기질로 전자전달계를 활성화한 후 억제제를 투여하면 그 조합에 따라 활성산소의 방출이 증가되거나 감소된다[14,20]. Malate로 전자전달계를 활성화하고 rotenone과 antimycin A를 투여하였을 때 막전압은 각각 4.8 ±1.2 mV (n = 18), 3.3 ± 0.5 mV (n = 14)로 malate만 처리하였을 때 보다 오히려 감소하였다. 

Malate에 의해 유발된 탈분극에 대한 항산화제의 효과

주로 superoxide에 작용하여 항산화 작용을 나타내는 TEMPOL 1 mM, H₂O₂를 H₂O로 분해하는 catalase 1000 unit, 그리고 광범위 항산화제인 PBN 2 mM을 세포외액에 전 처리한 후 malate를 투여 하였을 때는 malate에 의한 탈분극이 각각 4.8 ± 1.4 mV (n = 7), 4.1 ± 1.5 mV (n =10, p < 0.05), 3.1 ± 0.5 mV (n = 11, p < 0.01)로 통계적으로 유의하게 억제되었다(Fig. 3). 따라서 malate에 의한 흥분성의 증가는 전자전달계 과정 중 발생된 활성산 소종에 의하여 발생하였음을 확인하였다. 

Fig. 3.Malate-induced membrane depolarization is suppressed by ROS scavengers. (A) The addition of TEMPOL (a), catalase (b) and PBN (c) effectively antagonized the malate-induced depolarization. (B) Malate-induced depolarization under control condition and pretreatment of antioxidants. ** : Values are significantly different from the malate by paired t-test (p < 0.01). Means ± SEM.

Membrane permeability transition pore (MPTP)가 막전압에 미치는 영향

미토콘드리아 내막에 존재하는 permeability transition pore는 분자량이 큰 물질도 통과시킬 수 있는 비선택성 양이온 통로이며 ROS와 기질의 칼슘양 증가에 활성화되어 ATP 생성을 감소시키고 더 많은 ROS를 발생시킨다[21].  

척수후각 세포에 MPT가 존재하는지를 확인하기 위하여 세포내 칼슘농도를 100 μM로 증가시킨 피펫으로 막전압을 기록하면서 malate를 투여하였다. 막전압 변화는 6.7 ±0.4 mV (n = 10)로 정상 세포내 농도인 0.1 μM 상태에서 기록한 값보다 유의하게 증가하였고(p < 0.05), 이때 CsA를 전처리한 후 malate를 투여하면 4.8 ± 0.9 mV (n = 6)로 막전압이 감소하였다. 또한, MPT를 활성화 시키는 약물인 suramin을 전처리하고 malate를 처리하면 7.0 ±2.4mV (n = 8)로 유의성은 없었으나 증가하였다. Malate에 의한 막전압 변화에 MPT가 작용했는지를 알아보기 위하여 MPT 억제제인 cyclosporin A (CsA) 4 μM을 전처리한 후 malate를 투여하였을 때 5.5 ± 1.1 mV (n = 7)의 탈분극을 보여 malate를 단독 처리한 대조군과 차이가 없었다(Fig. 4). 

고 찰

신경조직에서 ROS는 다양한 경로를 통해서 얻어지는데 가장 대표적인 경우는 정상적인 대사과정 동안에 미토콘드리아의 전자전달계(electron transport complex;ETC)에서 발생되는 것이다[14,22]. 미토콘드리아의 전자전달계는 I-V 복합체로 구성되는데, I 복합체는 NADH oxidoreductase라고 하고 glutamate, pyruvate, malate가 기질로 작용한다. I 복합체는 정상 생리적 기능을 유지하고 있을 때 주요한 ROS의 공급원으로 기질측에 위치한 flavin site와 막간강측에 위치한 quinone site에서 O2·−를 방출한다. II 복합체는 succinate dehydrogenase라고 하며 succinate가 기질로 작용한다[23,24]. III 복합체는 ROS 발생에 가장 중요한 장소로 막간강측에 위치한 Qo center와 내막에 위치하여 기질과 접하고 있는 Qi center로 구성되며 각각 막간강과 기질에 O_2^·− 를 방출한다[20,25]. IV 복합체는 cytochrome C oxidase가 매개하고 전자를 전달받아 산소와 결합하여 물을 형성하며, V 복합체는 ATP synthease를 가지고 있어 막간강측에 있는 H+ 이온이 기질로 들어올 때 ATP를 생산한다[14]. 

Fig. 4. Effects of mitochondria permeability transition pore (MPTP) on the ROS generation by malate. (A) When membrane potential was recorded using 100 μM of intracellular calcium concentration, malate-induced depolarization was greater than that of control, and it was suppressed by cyclosporin A (CsA), a MPTP inhibitor (a). Suramin (50 uM) increased malate-induced depolarization (b). Application of CsA (4 uM) did not increase the malateinduced depolarization in normal ICF solution (c). (B) Bar graph showing the membrane potential changes by MPT related drugs. * indicates significant differences from malate group by independent t-test (p < 0.05). # indicates significant differences from ICF Ca² 100 μM group by paired t-test (p < 0.05).

 Rotenone은 I 복합체 억제제로 quinone site에 주로 작용한다. I 복합체의 억제는 flavin site (NADH dehydrogenase site)의 환원을 증가시켜 ROS의 방출을 증가시키는 한편 I 복합체에서 III 복합체로의 전자의 전달을 차단하여 Qo center에서의 ROS 방출은 감소시켜, rotenone의 작용은 이 두 가지 효과의 균형에 의해 결정된다[26]. Antimycin A는 III 복합체의 Qi center를 억제하여 Qo center에서의 ROS 방출을 촉진한다[27]. Kim 등은[13] 척수에 rotenone과 antimycin A의 투여로 superoxide의 증가와 통증 행동반응의 증가를 보고한 바 있어 이 연구에서는 미토콘드리아 억제제가 실제로 척수세포에 흥분적으로 작용하는지를 확인하고자 아교질 세포의 막전압을 기록하면서 rotenone과 antimycin A를 투여하였다(Fig. 1). 그러나 rotenone과 antimycin A에 의해 발생된 전압변화는 각각 2.1 ± 0.7 mV, 1.7 ± 0.8 mV로 작아서 미토콘드리아의 통증에 대한 역할을 규명하기에는 확실하지 않았다.

 따라서 복합체 I, II의 기질인 malate와 succinate를 처리하여 전자전달계를 활성화 시켰는데 발생된 전류는 각각 5.5 ± 0.4 mV, 2.9 ± 0.5 mV의 탈분극이 관찰되었고 그 중 일부의 세포에서는 약물투여 후 활동전압이 발생되었으며 약물제거 후 원상태로 회복되는 가역적인 반응을 보였다(Fig. 2). 이는 통증에 관여하는 ROS의 작용은 영구적인 세포죽음을 일으키는 것이 아닌 정상적인 세포내 신호조절물질로써의 작용 혹은 경미한 산화자극에 의한 일시적인 기능변화를 일으킨 상태라 할 수 있다.
 

 Malate에 의해서 발생된 탈분극은 superoxide에 작용하여 항산화 작용을 나타내는 PBN, TEMPOL과 H₂ O₂를 H₂O로 분해하는 catalase에 의하여 유의하게 억제되었다(Fig. 3). 따라서 malate에 의한 흥분성의 증가는 전자전달계 과정 중 발생된 활성산소종에 의하여 발생하였을 것으로 추측할 수 있다. 미토콘드리아 I, III 복합체는 ROS의 주 발생원으로 주로 O^2 _.-  를 방출한다. 그러나 O_2^.-  는 세포막의 투과성이 낮아 미토콘드리아 막간강과 기질에 방출되면 세포질로 이동하여 막전압을 변화시키기 어려울 것으로 생각된다. O_2^.- 는 superoxide dismutase에 의해 H₂O₂로 전환되는데 이것은 세포막을 쉽게 확산으로 통과하며 막전압을 변화시킬 수 있으며[13,14,28], 다른 연구에서도 H₂O₂가 transient receptor potential (TRP) 통로를 활성화하거나[29], ATP 민감성 K+(K_ATP ) 통로의 열림을 조절하여[30] 막전압을 변화시킨다고 보고되었다. 이 연구에서도 O_2^.- 에 작용하는 PBN, TEMPOL과 함께 H₂O₂를 분해하는 catalase에 의하여도 malate에 의한 반응이 유의하게 억제된 것은 탈분극을 일으키는데 H₂O₂가 관여하였다는 것을 의미한다.

세포에 허혈(ischemia)과 같은 해로운 자극이 주어지거나 독성물질에 의해 전자전달계 사슬이 방해를 받으면 미토콘드리아는 산화적 인산화반응을 멈추고 세포는 해당작용을 증가시켜 젖산의 농도가 증가하여 산성이 된다. 세포는 산성화 방지를 위해 수소이온을 Na⁺ /H⁺ 교환기 기전에 의해 세포 밖으로 내보내고 이어서 Na⁺/Ca²⁺ 교환기가 작동되어 세포내 칼슘이 증가하면 미토콘드리아 Ca²⁺uniporter에 의해 미토콘드리아 내 칼슘이 증가하여 미토콘드리아 내막의 membrane permeability transition (MPT) pore를 열게 한다. ROS와 기질의 칼슘양 증가는 MPT의 조절자로서 MPT 개방을 유도하면 ATP 생성을 감소시키고 더 많은 ROS를 발생시키며 결국 세포 죽음을 초래한다[21]. 

척수후각 아교질 세포에 MPT가 존재하는지를 확인하기 위하여 세포내 칼슘농도를 100 μM로 증가시킨 피펫으로 막전압을 기록하면서 malate를 투여하여 발생한 탈분극은 정상 세포내 농도인 0.1 μM 상태에서 기록한 값보다 유의하게 증가하였고(p < 0.05), 이때 CsA를 전처리한 후 malate를 투여하면 막전압이 감소하였다. 또한, MPT를 활성화 시키는 약물인 suramin을 전처리하고 malate를 처리하면 유의성은 없었으나 증가하는 경향을 보였다. 이는 척수 후각세포에 칼슘농도가 높으면 MPT가 활성화 될 수있음을 의미한다. Malate에 의한 막전압 변화에 MPT가 작용했는지를 알아보기 위하여 MPT 억제제인 CsA를 전 처리한 후 malate를 투여하였을 때는 malate를 단독 처리한 대조군과 차이가 없어 세포내 칼슘농도가 정상일 때에는 MPT가 작용하지 않음을 확인하였다(Fig. 4).
 

결론적으로 이 연구에서 미토콘드리아에서 발생된 ROS는 척수후각의 아교질 세포를 탈분극 시키고 내향성 전류를 발생시킴에 의해서 흥분적으로 작용하여 통증을 증가시킬 수 있으며 이러한 점은 ROS가 이전의 역치하 입력 신호에 대하여 더 쉽게 활동전압을 발생시킬 수 있어 통증의 정보전달과정에 중요하게 관여할 수 있음을 시사한다.
 

감사의 글

이 논문은 2010년도 원광대학교의 교비지원에 의해서 수행되었음.