서론

포유류의 미각은 수용성 물질을 인지하는 화학감각으로 주로는 음식물의 성질과 특성에 대한 중요한 정보를 제 공한다. 미각전달은 주로 혀 유두에 위치한 맛봉오리의 미각세포에 존재하는 미각수용체와 미각물질의 결합으로 이루어진다 . 다양한 수용체들과 이온통로에 의해 미각수 용체가 받은 정보들이 맛 감각을 지배하는 뇌의 미각구 역으로 전달된다 . 미각 수용체는 G-단백결합 수용체로서 T1R수용체와 T2R수용체로 구분되어 있다 . T1R수용체는 단맛과 감칠맛을 느끼는데 관여하며 T2R수용체의 지금 까지 알려진 기능은 잠재적으로 해로운 물질인 쓴맛 물 질의 인지이다.

사람에서는 25개의 쓴맛 수용체가 존재하며 설치류는 35개의 쓴맛 수용체를 발현한다 [1,2]. 이전의 연구들에 의 하면 미각세포가 구강 내뿐만 아니라 다른 조직 예를 들 어 위장관계의 신경내분비세포 [2,3], 흰쥐의 비강내의 상 피세포[4], 흰쥐의 뇌 [5], 타액선 [6], 사람의 기도세포 [7,8] 에서 발현한다는 것이 밝혀졌으며 그들의 생리적인 역할 에 대한 연구가 활발히 진행 중이다 . 

비강내 점막은 그 위치에 따라 호흡상피 또는 후각상피 로 나뉜다 . 호흡상피는 섬모성 중층원주상피이며 , 술잔세 포(goblet cell) 가 사이사이에 끼어있다 . 호흡시 코를 통해 숨을 들이마시면 비강의 점액층의 섬모는 콧속으로 들어 오는 공기 중의 미생물 , 독성물질 및 불순물 등의 유해물 질을 정렬된 움직임을 통하여 1차적으로 걸러주는 역할을 함으로써 몸을 보호하는 중요한 방어기전이다 . 하지만 이들 비강 점막 호흡상피세포가 어떻게 외부에서 들어오는 물질을 인지하는지에 대해서는 알려져 있지 않다 .

본 연구에서는 사람 비강내의 호흡상피에 쓴맛 수용체 로 알려져 있는 T2R 수용체가 발현한다는 것을 밝혔으며 또한 이들 수용체를 활성화시킬 수 있는 화합물을 처리 하였을 때 비강 점막 호흡상피세포의 섬모의 운동성이 증 가하는 것을 확인하였다 .

재료 및 방법

사람 정상 코점막 세포의 채취 및 배양

코막힘 , 비강내 조직검사 , 비성형술, 경비중격 -접형동 뇌 하수체 절제술로 수술받는 환자의 비강에서 수술과정 중 제거되는 점막 중에서 정상으로 보이는 점막을 채취하였 다. 환자조직채취는 아주대학교 의과대학 연구윤리위원회 의 승인을 받아 시행하였다 (AJIRB-05-184). 환자군은 모 두 비흡연자이며 천식의 과거력이 없었으며 최근에 약을 복용하거나 급성 상기도 감염이 없는 사람들을 대상으로 하였다. 한 명의 환자로부터는 한 개의 조직만을 채취하 였다. 대상환자는 모두 한국인 남성으로 평균나이는 42 세였다. 점막은 1% Pronase(type 14)가 포함되어 있는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY, USA) 와 Ham’s F12 nutrient mixture (F12, Invitrogen, Grand Island, NY, USA) 의 1:1 혼합용 액에서 37^oC, 5% CO₂, 100% 습도에서 배양하여 실험에 사용하였다 . 

Table 1. List of oligonucletides used for RT-PCR analyses of nasal respiratory epithelium

Table 1. (Continued) List of oligonucletides used for RT-PCR analyses of nasal respiratory epithelium

역전사중합연쇄반응

비강내의 호흡상피에서 총 RNA 는 Trizol 시약(Invitrogen, Grand Island, NY, USA) 을 이용하여 제조사의 지시대로 추출하고, 동량의 총 RNA(1 µg)를 SuperScript III RT 효 소(Invitrogen, Grand Island, NY, USA) 로 역전사시켜 cDNA 를 합성하였다 (n = 13). PCR 은 EF taq DNA poly­merase (Solgent, Daegu, Korea) 을 이용하여 처음 초기 변성은 94^o C에서 5분 동안 반응시키고 , 증폭과정은 변성 반응을 94^o C에서 30초, 결합반응을 30초, 그리고 중합반 응을 72^o C에서 30초간 40주기를 반복하였고 , 마지막 중 합반응은 72^o C에서 10분 동안 반응시켰다 . 사람의 25개 의 쓴맛 수용체에 대한 primer 서열, 결합온도와 PCR 산 물의 크기는 Table 1 과 같다 . PCR 산물은 2% agarose gel로 전기영동하여 분리하였다 . 생성된 PCR 산물은 시퀀싱을 통하여 확인하였다 .

섬모운동횟수(CBF)의 측정

섬모 운동의 분석은 Kim 등이 기술한 optical flow tech­nique with a peak detection method 의 프로그램을 사용 하여 측정하였다 [9]. 채취한 조직을 12시간 안정화 시킨 후 섬모운동횟수 (ciliary beating frequency, CBF) 를 측정하 였다. 코점막 상피의 섬모세포들은 charged coupled device (CCD) 카메라가 연결된 400배의 도립현미경(Axiovert 40 CFL, Carl AEISS, Germany) 으로 확대하여 관찰하였다 . 이 디지털 카메라로 모니터에 보이는 섬모운동을 관찰하 여 가장 활발하게 움직이는 부분을 초당 50-100 프레임 으로 녹화저장 하였다 . 그후 , 자제 개발한 프로그램을 이 용하여서 저장된 이미지로부터 자동적으로 CBF를 측정하 였다. 안정화된 조직에 대조군으로는 생리식염수를 처치하 여관찰하였으며 , 실험군으로 쓴맛 물질인 denatonium, aristolochic acid, 또는 thujone 을 각각 처치한 후 5, 10, 20분동안 관찰하였으며 , 각 실험은 3회 반복하였다 .  

통계 분석

통계처리는 one way ANOVA 시행 후 Turkey's test 방법을 사용하였으며 , P < 0.05 의경우에서 통계적 유의성 이 있는 것으로 간주하였다 . 결과는 평균 ± 표준오차(SEM)로 표시하였다.

결 과

비강내 호흡상피세포에서 T2R 발현 분석

 사람의 호흡상피에 T2R의 발현여부를 RT-PCR 를 통하 여 확인하였다 . 13 명의 환자에서 정상 비강내 호흡상피를 적출하고 이 조직에서 RNA 를 추출하여 역전사반응을 통 하여 cDNA 를 합성하였다 . 이후 중합연쇄반응 분석을 통 하여 25개의 사람 T2R에 특이적인 primer 를 이용하여 발 현을 확인하였다 (Table1). 실험결과 T2R3, T2R4, T2R5, T2R10, T2R13, T2R14, T2R39, T2R43, T2R44, T2R45, T2R46, T2R47, T2R48, T2R49, 그리고 T2R50 의 mRNA 가 사람의 호흡상피에서 발현하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 1, Table 2). 하지만 발현 빈도는 모든 샘플에서 같 은 빈도로 발현하는 것이 아니라 T2R의 종류에 따라 그 발현 빈도가 다르게 나타났다(Table 2). 적게는 13개의 샘 플 중 4개의 샘플에서만 발현하는 T2R(T2R13, T2R39) 에 서 많게는 12개의 샘플에서 발현하는 T2R(T2R14, T2R47) 이 있었다 . T2R1, T2R7, T2R8, T2R9, T2R16, T2R38, T2R40, T2R41, T2R42, T2R60 은 조사한 13개의 샘플에 서 발현하지 않았다.

Fig. 1. Detection of hT2R1-hT2R60 mRNA by RT-PCR in human nasal epithelium. DNase I digested total RNA from human nasal epithelium was reverse-transcribed using the Oligo-dT primer and analyzed for the presence of hT2R1-hT2R60 mRNA using primers specific for each hT2Rs. For negative controls, reverse tran¬scriptase was omitted from the reactions, (-). M indicates 100-bp ladder DNA marker.

섬모운동 횟수 (CBF) 분석

호흡상피에 발현하는 T2R이 기능을 가지고 있는지를 본 연구에서 발현이 확인된 T2R 의 효현제를 처리하여 섬모 운동횟수가 증가하는지를 통하여 확인하였다 . T2R4, T2R8, T2R10, T2R13, T2R39, T2R43, T2R46, T2R47 의 효현 제인 danatonium, T2R14, T2R43, T2R44 의 효현제인 aristolochic acid, 그리고 T2R10 과 T2R14 의 효현제인 thujone 을 각각 0.1 mM 또는 1mM 를 처리하고 CBF의 변화를 약 20분간 측정하여 대조군과 비교하였다 . 각각의 효현제를 처리하였을 때 모두 대조군과 비교하여 시간이 지남에 따라 CBF 가 증가하였다 . 증가는 약 5분부터 관 찰되기 시작하였으며 10분 후에 최대반응을 보이고 20분 까지 지속적으로 유지되었다 (Fig. 2). 다만 Danatonium 과 aristolochic acid 는 0.1 mM 을 처리하였을 때 반응이 약 물 처치 후 10분에 최대반응을 보이고 점차 감소하였다 . 효현제에 의한 CBF 는 1mM 농도가 0.1 mM 농도의 약 물을 처리하였을 때 보다 증가하였다 . 대조군과 비교하여 최대반응은 danatonium 은약 44%, aristolochic acid 은약 46%, 그리고 thujone 는약 42%가 증가하였다 .  

Table 2. Expression frequency of hT2R1- hT2R60 from 13 human nasal respiratory epithelium

Fig. 2. Bitter compounds increase ciliary beat frequency in nasal epithelium. Ciliary beat frequency in human nasal epithelium was measured responding to denatonium (A), aristolochic acid (B), and thujone (C). Two different concentrations of each chemicals were tested and the responses were compared with those of control. The error bars indicate SEM. n = 4 -8.

고 찰

본 연구에서는 사람 비강내의 호흡세포에 쓴맛을 감지하는 T2R 의 발현과 기능을 섬모의 운동성을 통하여 분석 하였다 . RT-PCR 방법을 이용하여 사람의 비강내 호흡상피에는 25개의 T2R 중에서 15개의 T2R, 즉 T2R3, T2R4, T2R5, T2R10, T2R13, T2R14, T2R39, T2R43, T2R44, T2R45, T2R46, T2R47, T2R48, T2R49, 그리고 T2R50의 발현을 확인할 수 있었다 . 그중 T2R10, T2R14, T2R43, T2R47, T2R49, 그리고 T2R50은 13개의 조직 중 9개 이상의 조 직에서그발현을 확인할 수 있어 그 발현 빈도가 높았 다. 그리고 10개의 T2R(T2R1, T2R7, T2R8, T2R9, T2R16, T2R38, T2R40, T2R41, T2R42, T2R60) 는 본 연구에서 발현을 확인하지 못 하였다 . 이는 모든 T2R 수용체가 비 강 호흡세포에 발현하는 것은 아니라는 것을 암시한다 . 

T2Rs 의 발현과 기능은 처음으로 미뢰에 있는 미각세포 에서 확인되었지만 이들 미각수용체와 그 하위 신호전달 물질은 설치류에서 위장관 [3] 과 기관지 호흡상피세포 [10], 뇌[5], 타액선 [6]를 포함하여 몸 전체의 많은 세포에서도 존재한다고 보고되었다 . 사람에서는 기도 상피세포 [7] 와 비강내 호흡상피 [11] 에서 발현됨이 보고되었다 . 이러한 결 과는 이들 미각 수용체가 맛감각을 느끼는 혀 이외의 조 직과 장기에서 기능을 할 가능성을 제시하여 준다. 본연 구에서는 비강내 호흡세포에 알려진 모든 사람의 T2R 수 용체의 발현 여부를 확인하고 이들의 기능을 규명하고자 하였다 .  

 미각신호전달은 효현제가 미각수용체에 결합한 후 , G­단백 α-gustducin 를 통하여 phospholipase Cβ2(PLCβ2) 를 활성화시켜 인지질 (phosphatidylinositol 4,5-bisphos­phate)를 분해시켜 inositol 1,4,5-triphosphate(IP₃ )와 di-acylglycerol(DAG) 을 만들고 IP3에 의하여 증가된 세포 내 칼슘에 의해서 transient receptor potential melastatin channel subtype 5(TRPM5) 을 활성화시켜 신호를 전달한다 .

 설치류 비강내의 solitary chemoreceptor cell(SCCs) 은 T2R 작용제인 denatonium 이 미각에서처럼 전형적인 T2R 신호전달기전인 PLC-연결 전달과정으로 세포 내 칼슘을 증가시키는 반응을 한다는 것을 보임으로써 SCCs 가쓴 맛 물질의 삼차신경 반응을 매개한다고 보고하였다 [12]. 또한 SCCs 는자극제나 호흡기관의 미생물 신호를 탐지 하는데 쓴맛 미각 신호를 이용한다 [13]. 본 연구에서는 이 들 미각 신호전달 물질 , 즉 α-gustducin, PLCβ2 그리고 TRPM5 가 비강내 호흡상피에서 발현하는지를 RT-PCR 로 확인하였으나 발현을 확인하지 못 하였다 . 이는 미각신호 전달물질의 발현이 매우 낮거나 또는 T2R 수용체 하위 의 신호전달계가 다를 가능성을 제시한다 .

 비강내 호흡상피에 발현되는 T2R이 생리적 기능이 있 는지는 CBF 분석을 이용하였다 . 쓴맛 물질인 danatonium, aristolochic acid, 또는 thujone 을 각각 처리하여 확인한 결과 CBF가 대조군에 비교하여 증가함을 확인하였으며 , 이는 발현되는 T2R이 생리적 기능이 있다는 것을 의미 한다 . 이 결과는 Shah 등의 사람의 기도 상피세포의 운 동성 섬모가 화학감각 기능이 있다는 보고와 일치한다 [7]. 쓴맛 물질에 의하여 미각수용체가 활성화되어 세포 내 칼 슘농도가 증가되어 섬모운동을 자극하는 것으로 보고 되 었으며 [14], 본 연구에서 사용한 비강내 호흡상피에서의 CBF 증가가 세포 내 칼슘 증가를 통한 것인지 확인하는 것이 비강내 호흡상피세포 미각수용체의 신호전달을 이 해하는데 필요하겠다. 

 본 연구의 결과로 비강내의 호흡상피에 있는 T2R 이유 해물질을 감지하여 섬모운동을 증가시킴으로써 일차적인 방어기전으로 역할을 함을 나타낸다.

감사의 글

이 연구는 연세대학교 치과대학 2009년도 연구비에 의하여 이루어졌습니다.