06.pdf5.64MB

서 론

직접치수복조술은 노출된 치아의 치수에 보호제를 적용 하여 치수를 회복시키고 생활력과 기능을 유지해주는 술식 으로 200년 이상 전부터 시행되어왔다 [1]. 1930 년 Hermann 이 성공적인 치수복조제로서 소개한 이후로 현재 수산화 칼슘은 직접치수복조제의 ‘gold standard’ 로 여겨지고 있 다[2]. 그러나 수산화칼슘은 직접치수복조술 , 치수절단술 , 천공된 치근의 수복 등 여러 임상적 상황에서 광범위하 게 사용되는 것에 비해 이상적인 재료는 아니다 . 수산화 칼슘을 이용한 직접치수복조의 주 실패 원인은 복조재의 하방에서 생성되는 상아질교가 다공성이고 , 수산화칼슘이 상아질에 접착되지 않으며 시간이 지날수록 용해되어 미 세누출을 장기적으로 막을 수 없다는 점에 기인한다 [3]. 또한 강한 알칼리성으로 인해 하방의 치수조직에 얇은 괴 사층을 형성하여 지속적인 염증을 일으키거나 어떤 경우 에는 남아있는 치수조직의 이영양성 석회화와 같은 퇴행성 변화를 일으킬 수도 있다 [4].

이와 같은 수산화칼슘의 단점들 때문에 보다 더 적합 한 재료를 찾기 위한 많은 연구들이 있었고 anti-oxidant agent, growth factors, bone sialoprotein, dentin sialo­protein, adhesive system 등을 사용한 실험들이 행해졌 으나 이전의 재료들에 비해 좋은 결과를 보이지 못하고 있다 [5-7]. 새로이 시도되는 재료들 중 mineral trioxide aggegate (MTA) 는 수산화칼슘과 비교하여 현저히 높은 빈도로 수복상아질을 형성하고 두께도 더 크며 염증을 덜 유발하는 것으로 알려져 있어 현재 수산화칼슘의 대체 재료로 치수복조 , 치수절단 및 근관치료의 여러 영역에서 사용되고 있으나 이 재료 역시 아직은 장기간의 예후에 대해서는 알려져 있지 않으며 사용상의 단점도 있다 [8-10].

삼차상아질 (tertiary dentin) 은 교모 (attrition), 우식 (caries), 수복 시술 같은 다양한 자극에 대한 반응으로 형성되며 , 치수복조 후에 생성되는 삼차상아질은 손상의 정도에 따 라 혹은 경조직을 만드는 세포의 종류에 따라 다르게 존 재한다 . 이미 존재하던 상아질모세포에 의해 침착이 이루 어지면 반응상아질 (reactionary dentin) 이라고 하며 새롭게 분화된 상아질모세포유사세포 (odontoblast-like cell) 에의 한 경우는 수복상아질 (reparative dentin) 로 나뉘어진다 . 수 복상아질의 경우 , 다수의 천공을 포함하며 완전하지 않기 때문에 상아질양 (dentin-like), 골양(bone-like) 으로도 표현 되어진다 [11-13]. 상아질을 형성하는 동안 상아모세포는 세포외기질로 아교질 과 몇몇 비아교성 바탕질단백질들 을 분비하게 된다 . 아교질은 I, II, III 형으로 구성되며 , 이들 중 I형 아교질은 무기질을 수용하는 뼈대로 작용하 는 것으로 알려져 있다 . 비아교성 바탕질단백질으로는Dentin phosphoprotein/phosphophoryn (DSPP), Dentin sialoprotein (DSP), dentin matrix protein (DMP) 등의 많 은 인자들이 알려져 있다 . 이중 DSP 는 sialic acid-rich glycoprotein 으로 Butler 에 의해 처음 기술되었으며 [14] 분자적 수준에서 상아모세포에 특별히 많이 발현되는 특 이적인 표지자로서 , 상아질의 무기질 침착 속도에 영향을 주는 것으로 알려져 있다 [15].

재료 및 방법

실험동물

5주령의 흰쥐 10마리의 상악 좌우 6개의 구치를 와동 형성 후 두 군으로 나누어 좌측 치아에는 광중합 수산화 칼슘 제제인 ultrablend plus (ultradent products, USA) 를, 우측 치아에는 mineral trioxide aggregate (ProRoots MTA, Dentsply, USA) 를 사용하여 복조하였다. 모든 실 험은 원광대학교 동물실험윤리위원회의 규정에 따라 행해 졌으며 (WKU09-117) 실험동물의 동통이나 불편감을 최 소화하기 위한 적절한 방법으로 시행하였다. 

와동 형성 및 치수 복조

마취를 위해 phenobarbital 40 mg 을 쥐의 복강내로 주사하여 전신마취를 유도하였다 . 치수를 노출하기에 적절한 와동 깊이를 결정하기 위해 쥐의 치아를 microCT 로 촬영 하여 구개면에서 치까지의 거리를 측정한 결과 법랑질과 상아질의 두께가 약 0.3 mm 이었다 (Fig. 1A). 와동형성 전에 쥐의 치아를 생리식염수를 묻힌 면구를 이용하여 닦아내고 우식이 없고 건전한 쥐의 구치 구개면에 0.25 mm 직경의 1/4 round bur (Komet Dia Bur FG801) 를 이용 하여 bur 의 shank 부분에 0.3 mm 를 표시한 후 그 깊이 대로 와동을 형성하였다 (Fig. 1B). 와동형성도중 열이 발생하는 것을 방지하기 위해 압축공기를 분사하면서 bur 를 간헐적으로 적용하였다 . 그 후 노출된 치수에 MTA 를 제조사의 지시대로 혼합하여 복조하였고 , 수산화칼슘은 광 중합형인 Ultrablend 로 복조한 후 Elipar Freelight2 (3M ESPE, USA) 를 이용하여 광중합 하였다 . 그 후 SE bond 레진 접착제를 적용 후 flowable resin 을 사용하여 와동을 충전하였다 .

광학현미경 관찰

치수복조를 마친 후 12시간, 2일, 7일, 14 일, 21일후 에테르 마취를 유도하고 희생하여 상악의 치아를 포함하는 악골을 절취하여 4%, PFA 용액에 24시간 침윤 고정하였다. 고정 후 EDTA 용액(pH 7.4, 4^o C)에서 약 한 달간 탈회하고 , 알코올 탈수 과정을 거쳐 xylene 에 투명한 후 파라핀 내에 포매하였다 . 포매된 조직에서 4 µm 내외의 시상 연속절편으로부터  치아 정중시상단면 표본을 얻어 hematoxylin-eosin 염색을 시행하고 광학현미경으로 관찰하였다.  

면역형광조직화학염색법

시편의 파라핀을 xylene으로 제거하고 PBS로 씻어낸 후, primary antibody 로 DSP antibody (Santa Cruz Bio­tech, Delaware, CA, USA) 를 사용하였고 normal serum 은 대조군을 위해 사용되었다 . 면역형광염색은 TSATM Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 을 이용하였다. 1% H₂ O₂ 를 사용하여 1시간 동안 endogenous peroxidase 를 block­ing한 후 시편을 16시간 동안 primary antibody 와 반응할 수 있도록 하고 그 후 1시간동안 HRP-conjugated second­ary antibody 에 반응시켰다. 그 후 tyramide working so­lution 에 10분간 반응하여 LSM 510 confocal laser microscope (Carl Zeiss, Germany) 으로 관찰하였다 . 

결 과

조직학적 소견

수산화칼슘

시술 후 12시간 경과 소견에서 와동 아래에 와동 형성 중에 떨어져 나온 상아질 삭편이 보이고 그 주위로 염증 세포들이 몰려 있으며 혈관이 증식된 양상을 보였다 (Fig. 2B). 염증세포 침윤이 덜한 주변부에서는 정상적인 상아 모세포들이 극성을 띄며 배열된 모습을 관찰할 수 있었다 . 2일 경과 후 혈관 증식이 더 두드러지게 보였으며 (Fig. 2E) 7일 후 상아모세포의 배열이 더욱 극성을 나타내었으며 이전의 표본에서 fibrodentin matrix 로 보이던 영역이 조금 더 확장된 양상으로 관찰되었다 (Fig. 2H). 14일 후 관찰한 대부분의 시편에서 수복상아질의 형성이 관찰되었으며 그 양상은 세관구조를 보이나 모양이 불규칙하고 연속성이 없으며 치수강 내의 상아질과 떨어진 부위에서도 경조직 형성이 존재하였다 (Fig. 2K). 21일후 먼저 형성된 부위의 상아질은 세포가 경조직 기질 안에 함입된 골양조직처럼 보였고 더 나중에 형성된 상아질은 규칙적인 세관을 형성하여 기존 상아질과 유사한 구조이나 그 양이 과도하여 치수강을 거의 폐쇄할 정도였으며 남아 있는 치수강에서도 석회화가 이루어지고 있는 것을 관찰하였다 (Fig. 2N).
 

MTA

 12시간 후 약간의 염증세포와 혈관들이 보였으며 (Fig. 2C) 2일후 혈관증식이 좀 더 증가한 양상으로 수산화 칼슘 복조군과 큰 차이는 없었으나 염증세포 침윤은 덜 하였다 (Fig. 2F). 7 일후 fibrodentin matrix 로 보이는 부 분이 두꺼워졌고 상아모세포층의 세포의 형태가 보다 길 어진 것처럼 보였다 (Fig. 2I). 14일후 균일한 두께의 뚜 렷한 수복상아질의 형성을 보였고 (Fig. 2L) 21 일후세 관구조가 명확하며 14일째 보다 더 두꺼워진 수복상아질 을관찰할 수 있었다 . 수산화칼슘에서 보였던 과도한 경 조직 형성으로 인한 치수강의 폐쇄는관찰되지 않았다 (Fig. 2O).

면역형광조직염색 소견

수산화칼슘

시술 12시간 후 상아세관내의 돌기 부위에서 DSP 항 체에 대해 약한 염색성이 관찰되었으나 전상아질 하방에 배열된 상아모세포층에서는 반응을 보이지 않았다(Fig. 3A). 2일후소견에서는 fibrodentin matrix 하방의 상아 모세포층이 잘배열된 상태로 반응하였다 (Fig. 3B). 7일 후소견에서는 광학현미경 관찰에서 전상아질과 구별되지 않았고 두께만 약간 증가되어 보였던 부분에서 수복상아 질의 생성이 뚜렷하게 확인되었다 (Fig. 3C). 21 일소견에 서는 광학현미경 관찰과 유사하게 과도하게 형성된 수복 상아질과 그 하방으로 상아모세포들에서 DSP가 강하게 발현되었다(Fig. 3D).   

MTA

12시간 후 수산화칼슘 복조군과 동일하게 치수 상부의 상아세관에서만 약하게 DSP 단백질이 발현되었고 전상아 질 바로 하방의 상아모세포층에서는 반응을 보이지 않았 다(Fig. 4A). 2일후 fibrodentin matrix 바로 하방의 얇 은 한 층에서 DSP 단백질이 발현되었고 (Fig. 4B) 7 일후 균일한 두께의 수복상아질과 그 하방 세포에서 발현되었 다(Fig. 4C). 21일 후는 형성된 수복상아질의 세관 내에 서도 DSP 단백질의 발현을 관찰할 수 있었다 (Fig. 4D).

고 찰

치수복조는 노출된 치수에 보호제를 적용하여 치수를 회복시키고 생활력과 기능을 유지하는 술식이다 . MeSH (Index Medicus: Medical Subject Headings) browser 의 검색 결과에 따르면 치수노출은 “우식병소 , 기계적 요인 혹은 외상에 의한 치아 경조직의 병리적 변화의 결과로 서 외부환경으로부터 세균의침투를 허용하게 된 상태”로 정의된다. 이러한 치수노출을 치유하기 위해서는 적합한 재료의 사용 및 처치를 통하여 치수복조 후, 노출된 치 수를 완전히 덮을 수 있는 새로운 경조직 , 즉 수복상아 질 형성 과정이 수반되어져야 한다 . 수복상아질이 생성되 는 동안 치수 노출부위에서는 기존의 상아모세포는 파괴 되고 새로이 분화된 상아모세포양 세포 (odontoblastic-like cell)들을 유도하는데, 이러한 치유 과정은 손상된 부위로 의 줄기/전구세포의 이주에 따라 그들의 증식과 분화를 포 함하여 이루어지는 것으로 알려져 있다 . 또한 , 수복상아질 형성은 fibrodentin matrix 로 불리는 구조의 생성으로 시 작되며 이것은 상아질세관이 없거나 불규칙한 모양을 나 타낸다. 더 길어지고 극성을 띄는 상아모세포양 세포에 의 해 만들어지는 세관구조의 상아질양 기질의 형성은 더 이 후에 일어나는 것으로 알려져 있다 [16-18]. 

 현재까지 치수복조 후 치수 내 일관되게 경조직이 형성 되는 것으로 알려진 재료들은 수산화칼슘 및 그것을 기 본으로 하는 제재들이다 . 그러나 수산화칼슘을 이용하여 치수복조를 받은 123개의 치아를 5년과 10년 후에 추적 조사한 연구에 따르면 5년후엔 44.5%, 10 년후엔 79.7% 의 치아에서 실패한 것으로 조사되었다 . 이들은 치아를 대 부분 전기치수검사, 타진및 촉진, 방사선검사 등을 통 해 평가하였으며 이러한 결과는 임상적 판단일 뿐 진정한 치수 상태를 반영하지 못하기 때문에 실패율은 더 증가 할 수 있는 가능성이 존재하고 있다 [19].

MTA 는 1990년대 초반 치근단 역충전 물질로 개발되기 시작하여 1993년 처음 치과 문헌에 언급되었다[20]. 그 이후로 MTA 는 수산화칼슘의 대체 재료로서 치수복조 , 치수절단, 괴사된 치수와 개방된 근단을 가진 치아의 치근 단장벽 형성, 치근단 수복 및 근관충전 등을 위하여 사 용되어져 오고 있다 [21]. 현재 사용되어지고 있는 제재들 중에서 MTA 는 생체 친화적인 경향을 띄며 좋은 밀폐력 또한 갖고 있어 치과적 적용에 적합한 재료로 사용되어 지고 있다 . 이와 관련하여 MTA 를 이용한 많은 증례보고와 임상적 실험들이 행해지고 있으나 MTA 를 이용한 치수복조 후 경조직 형성 및 치수 치유의 분자적 기전에 관하여는 많이 알려져 있지 않다 .  

 인간에서 행해진 치수복조술 후 경조직 장벽의 형성에 관하여 체계적으로 고찰하여 그 근거의 수준을 평가한 보고가 있다 [22]. 이 논문에 따르면 체계적 고찰을 위해 21 편의 원저와 review article 을 평가한 결과 높은 수준의 근거를 보이는 연구는 한편도 없었고 , 한편에서 중간 정도의 근거 수준을 보였으며 , 20편의 연구는 근거 수준을 낮다고 평가하였다 . 근거 수준을 낮다고 평가한 이유는 환자나 치아등 표본 수가 충분치 않고 , 실험을 재현할 수 있을 만큼 술식에 대해 자세히 기술하지 않았으며, 대조 군이 없거나 치료군과 대조군의 실험 시작 전의 상태가 동일하지 않고 , 자료가 후향적으로 수집된 점 등을 들었 다. 또한 동통이나 부종 등의 임상적 징후와 방사선학적 소견 등은 진정한 치수 상태를 표현하지 못하기 때문에 조직학적 소견이 필수적이며 조직 소견 또한 연속적으로 절단한 시편을 모두 분석할 것을 요구하였다 . 그러나 인간을 대상으로 한 연구에서는 충분한 표본 수의 확보, 실 험의 재현성 등의 조건을 만족시키는 것은 사실상 불가능하다 할 수 있다 .

 본 연구에서는 인간의 대구치와 유사한 백서 구치부 치아를 사용하여 치수 노출 후 MTA 와 수산화칼슘을 이용하여 치수를 복조하고 생성되는 수복상아질의 양상을 조직학적으로 비교하였다 . 또한 , 생성되는 수복상아질에 상아질모세포의 조절 변화 양상을 알아보고자 DSP 항체를 이용한 면역형광염색을 시행하였다 .

 와동형성 및 치수복조술을 진행하는 과정에 있어서 백서의 구강과 치아의 크기가 작아 와동을 형성하는데 다소의 어려움이 있었으나 임상적 상황 재현이 충분히 가 능하였다 . 수산화칼슘과 MTA 를 이용한 치수복조 후 치수 변화 양상을 알아보기 위하여 처치 후 12시간, 2일, 7일, 14일, 21 일 헤마토실린-에오신 염색을 시행하여 조직학적으로 관찰하였다 . 두군 모두에서 수복상아질의 형성을 보였으나 그 양상은 서로 달라 MTA 군에서 보다 더 규칙적인 세관구조를 갖는 균일한 수복상아질을 형성하였고 남아있는 치수에서도 과도한 석회화로 인한 치수의 기능저하를 보이지 않았다. 또한, 치수복조 후 12시간과 2 일 후에는 fibrodentin matrix 로 보이는 영역이 관찰되었으나 7일 후 부터는 세관 구조를 갖는 수복상아질과 그 하방에서 극성을 띄는 원추형 세포를 관찰할 수 있었다 . 

상아질형성을 위하여 상아모세포는 denin matrix 내로 많은 비교원성단백질들을 분비하는 것으로 알려져 있다 . 보고된 비교원성단백질들 중에서 DSPP 와 그 분해산물인 DSP와 DPP 는 치아에서만 특징적으로 발현된다고 믿어 져 왔으나 최근 연구에서는 상아질보다는 훨씬 적지만 치 아가 아닌 다른 조직들 (골, 백악질 , 그리고 석회화되지 않는 조직 )에서도 그 발현이 보고되었다 . 그럼에도 불구 하고 다양한 분자생물학적 연구를 통하여 DSP는 현재까 지 상아모세포의 특이적인 표지자로서 쥐의 절단된 치수 에서 DSP는 주로 전상아질에서 , DPP는 석회화된 상아 질에서 분포하는 것으로 알려져 있다 [23]. 본 실험에서도 DSP 는 fibrodentin 으로 보이는 영역과 상아모세포양 세포 그리고 세관 내에 남아있는 상아모세포 돌기에서 주로 발 현되었고 석회화된 수복상아질부위에서는 거의 발현되지 않아 이들의 주장과 일치하는 결과를 보였다 . 인간의 제 3대구치에 수산화칼슘과 MTA 를 이용하여 치수복조를 시 행한 후 DSP에 대한 면역조직염색을 시행한 이전의 연 구에서 수산화칼슘에 비해 MTA 에서 DSP의 발현이 더 강하였고 이것은 MTA 가 치수치유에 더 유리한 환경을 제공한다고 한 연구가 있었다 [24]. 그러나 본 연구에서는 수산화칼슘군과 MTA 군을 비교하면 두 군 모두에서 DSP 가 발현되었으며 과도한 석회화양상을 보인 수산화칼슘군 에서 상아모세포양 세포가 밀집되어있는 부위에서 더욱 강하게 발현되었다 . 이것은 본 실험에서의 치수 손상이 더 커서 치수의 반응이 더 강하게 유발됐기 때문으로 생각된다.  

최근 치수복조 , 치수절단 및 근관치료 등의 치과치료와 관련하여 생체 적합성이 좋으며 긍정적인 예후를 나타낼 수있는 다양한재료의 개발에 그관심이 증가되고 있다 . 이러한 재료의 검증은 대부분 세포배양을 통하여 이루어 지고 있는 바 , 생체에 직접적인 검증은 미흡한 실정이다 . 본 연구에서는 임상적으로 사용되는 재료인 MTA 와 수산 화칼슘을 이용하여 백서의 구치부에서 충분한표본 수의 확보할 수 있었으며 , 또한 실험의 재현을 통하여 임상적 인 상황을 검증할 수 있었다 . 향 후 새로운 재료의 생체 적합성 및 장단기 예후를 평가하기 위하여 백서의 구치부 에 치수복조술을 시행 할 수있으며이에 본 연구 결과 는 활용 되어 질수있을 것이다 .  

감사의 글

This paper was supported by Wonkwang university in 2011.