서 론

 Streptococci(연쇄구균)는 16S rRNA 유전자(16S rDNA) 핵산염기서열비교분석법에 의해 여섯 개 계통발생학적(phylogenetic) 군(mitis, mutans, anginosus, bovis, pyogenic 및 salivarius) 으로 나누어진다[1]. 구강 내 서식하는 anginosus 그룹 연쇄구균(anginosus group streptococci, AGS)에는 Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus 및 Streptococcus anginosus 등이 있다[1]. 이들 AGS들은 구강 및 전신의 여러 기회감염성 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다[2,3]. 특히 S. anginosus는 구강암 및 식도암과 관련이 있다고 보고되었다[4].

 세균을 종 수준으로 동정하는 데 있어 황금 기준은 DNADNA hybridization법과 16S rDNA 핵산염기서열비교분석법이다[5]. 하지만 임상에서 이러한 방법으로는 검체에서 AGS를 동정하는 데에는 경제적 및 시간적 제약이 있다. 이들 중 16S rDNA 핵산염기열비교분석법은 DNA-DNA hybridization법에 비해 유전자 클로닝법과 핵산염기서열 결정법의 발달로 비교적 쉽게 실행할 수 있다. 하지만 S. intermedius와 S. constellatus 표준균주들간의 16S rDNA 핵산염기서열 상동성이 98.5% 이기 때문에 이러한 방법으로는 두 세균 종을 동정하는 데 어려움이 있다. 현재까지 알려진 세균 동정 및 검출법 중에서 polymerase chain reaction (PCR) 법은 정확하고 신속하며 민감도가 높기 때문에 치면세균막과 같은 임상 검체에서 특정 세균의 검출에 널리 이용되고 있다[6,7].

 숙주-세균간의 상호작용 및 병인론 연구에 일반적으로 해당 세균 종의 표준균주를 이용하지만, 경우에 따라서는 독성이 강한 세균을 가지고 연구되고 있다. 그 한 예로 치주질환의 중요한 원인 균종인 Aggregatibacter actinomycetemcomitans의 경우 표준균주로 ATCC 33384가 있지만, 이보다 독력인 강한 ATCC 33384 (Y4) 또는 강력한 독력 인자인 leukotoxin을 가지고 있는 JP2 균주를 가지고 병인론 연구가 진행되기도 한다[8,9]. 이러한 결과들은 인종과 지역에 따라 구강 내 세균 분포가 다르며, 이들 균주에 따른 사람 구강조직세포에 대한 병원성의 차이가 있다는 것을 의미한다. 그러므로 임상에서 분리한 여러 균주들 특히, 한국인의 구강에서 분리된 임상균주를 가지고 병인론 연구가 진행되어야 할 것이다.

그러므로 본 연구에서는 한국인에서 분리되어 AGS로 분류되었지만, 종-수준으로 분류가 되지 않은 임상균주들을 분자생물학적 방법인 16S rDNA 핵산염기서열비교분석법과 PCR법을 이용하여 종 수준으로 분류하여 향후 이들 세균 종을 이용한 병인론 연구를 위한 균주 제공을 위해 시행하였다.

재료 및 방법

세균 및 세균 배양

 본 연구에서 사용된 균주들은 Table 1에 표기하였다. 이들 균주들은 ATCC (Type Culture Collection, USA) 및 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, Biological Resource Center, Daejeon, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 그리고, 한국인에서 분리된 AGS 균주들은 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology, Gwangju, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 한국인에서 분리된 균주들은 조선대학교 치과대학 병원에서 종 수준으로 동정이 되지 않은 상태로 KCOM으로 기탁되었고 본 연구에서 16S rDNA 핵산염기서열을 결정하여 AGS에 속하는 것들 만을 이용하였다.

16S rDNA 클로닝 및 핵산염기서열 결정

 세균의 게놈 DNA들은 G-spin^TM  Genomic DNA Extraction Kit (iNtRON Co., Seoul, Korea)를 이용하여 제조회사의 지시에 따라 추출하였다.

 16S rDNA 유전자는 Lane 등[10]이 보고한 27F 및 1492R 프라이머들을 이용하여 PCR법으로 증폭하였으며, 이들 프라이머들은 Bioneer사(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 제작하였다.

 PCR 증폭물은 pGEN-T easy vector(Promega Crop., Madison, WI, USA)에 제조회사의 지시에 따라 클로닝하고, E. coli DH5α에 형질전환 하였다. 재조합 플라스미드는 Accu- Prep^TM  Plasmid Extraction Kit (Bioneer)를 이용하여 제조 회사의 지시대로 추출하였다.

 16S rDNA 핵산염기서열은 Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 와 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) 를 이용하여 결정하였다. 이때 ChDC-GEM-F (5'-TTC CCA GTC ACG ACG TTG TAA AA-3'), ChDC-GEM-R (5'-GTG TGG AAT TGT GAG CGG ATA AC-3')과 Seq- F1 (5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3') 프라이머들을 핵산염기서열 결정에 사용하였다[11].

계통발생학적 분석(Phylogenetic analysis)

 16S rDNA 핵산염기서열의 상동성은 MegAlign 프로그램 (DNAStar Lasergene^TM  8.0, DNAStar, Inc., Madison, WI, USA)을 이용하여 측정하였다. 또한, 이들 16S rDNA 핵산염기서열은 MEGA version 5[12] 프로그램을 이용하여 Clustal W 법으로 정렬하고 neighbor-joining methods 법으로 계통도(phylogenetic tree)를 작성하였다. 이때 계통도의 신뢰도를 확인할 수 있는 bootstrap 값은 1,000회의 resampled data로부터 계산하였다.

PCR

 AGS 임상균주를 종 수준에서 동정을 위해 종-특이 PCR 프라이머들을 이용하여 PCR을 시행하였다. S. anginosus 특이 PCR 프라이머는 Cho 등[13]이 개발한 ChDC-Ang- F7/ChDC-Ang-R7 프라이머들을 사용하였다. 이때 PCR은 98℃에서 전변성(predenaturation)을 2분간 1회 시행하고, 98℃에서 변성(denaturation)을 10초, 70℃에서 결합(annealing) 및 증폭(extension)을 30초간 30회 반복 수행하고, 72℃에서 최종 증폭을 5분간 시행하였다.

 S. intermedius와 S. constellatus를 동정하기 위해서는 Takao 등[14]이 개발한 multiplex PCR 프라이머들(HYL-MIX-U/ HYL-INT-D/HYL-CC-D)을 사용하였다. PCR은 전변성을 95℃에서 2분을 1회 시행하고, 변성(98℃에서 10초), 결합(58℃에서 15초), 증폭(70℃에서 30초)을 30회 반복 수행하고 70℃에서 최종 증폭을 5분간 시행하였다.

 Neuraminidase 효소활성이 S. intermedius에만 있다는 보고[15,16]를 근거로 하여, S. intermedius JTH08 균주의 neuraminidase A 유전자 핵산염기서열(GenBank Accession no. AP010969)를 바탕으로 S. intermedius 종-특이 PCR 프라이머들(Sin-Sial-F1, 5’-TTG CCC AGA GTA AGA AAA ATC CA-3’; Sin-Sial-R1, 5’-ATC AAG CCG CGC ATA AAG AGT-3’)을 PrimerSelect 프로그램(DNAStar Lasergene^TM  8.0, DNAStar, Inc., Madison, WI, USA)을 이용하여 설계하였다. 이때 PCR 조건은 1회 전변성 (98℃, 2분) 1회를 시행하고, 변성(98℃, 10초), 결합(56℃, 10초) 및 증폭(72℃, 20초) 과정을 30 cycle 반복하였고, 최종 증폭(72℃, 5분)을 1회 시행하였다. PCR 증폭물 중 5 ㎕를 취하여 1.5% agarose gel에 100 V, 15분간 전기영동 하여 증폭물의 크기를 확인하였다. 이때 예상되는 PCR 산물의 크기는 439 bp였다.

결 과

16S rDNA 핵산염기서열의 비교 분석

 본 연구에서 사용한 56개 AGS 임상균주들의 16S rDNA 핵산염기서열을 결정하여 GenBank에 기탁하여 accession numbers를 받았다(Table 1). 이들 16S rDNA 핵산염기서열을 바탕으로 만들어진 계통도를 분석한 결과 S. constellatus 및 S. intermedius의 표준균주가 각각 포함된 그룹 (C1)과 S. anginosus 표준균주를 포함한 그룹(C2)이 형성되었다(Fig. 1). C1 그룹은 각각 S. constellatus 및 S. intermedius의 표준균주가 포함되는 C1-1과 C1-2의 2개의 그룹으로 분류되었다. S. anginosus 균주들(C2)의 16S rDNA 핵산염기서열은 AGS 종에 속하는 다른 균주들과 95-96.5%의 상동성을 보였다(Fig. 1). S. constellatus 및 S. intermedius 균주들간의 16S rDNA 핵산염기서열 상동성은 97.9- 99.4%로 비교적 높은 상동성을 가졌다(Fig. 1).

Table 1. The strains used in this study

Fig 1. Phylogenetic trees base on the partial nucleotide sequences of (A) 16S rDNA (about 1.4 kb) of type strains and clinical strains of AGS. The resulting tree topology was evaluated by bootstrap analysis of the neighbor-joining tree based on 1,000 resamplings. The scale bar (neighbor-joining distance) represents a 5% difference in nucleotide sequence.

종-특이 PCR primer를 이용한 PCR

 Cho 등[13]이 개발한 S. anginosus 종-특이 PCR 프라이머들(ChDC-ANG-F7/ ChDC-ANG-R7)를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 16S rDNA 핵산염기서열을 바탕으로 얻은 계통도에 S. anginosus 그룹(C2)에 속하는 균주들에서만 461bp 크기의 PCR 산물이 증폭되었다(Fig. 2A).

Fig 2. Specificity test of the (A) S. anginosus-specific PCR primers (ChDC-ANG-F7/ChDC-ANG-R7), (B) multiplex PCR primers (HYL-MIX-U/HYL-CC-D/HYL-INT-D) for simultaneously detecting S. constellatus and S. intermedius, and (C) S. intermedius-specific PCR primers (Sin-Sial-F1/Sin-Sial-R1) with 4 ng of each bacterial genomic DNAs. The PCR reaction products were electrophoresed on 1.5% agarose gels. Lanes: S, size marker (100 bp ladder); 1, (-), negative control (deionized distilled water); 2, S. anginosus ATCC 700231T; 3, S. anginosus KCOM 1348; 4, S. anginosus KCOM 1380; 5, S. anginosus KCOM 1396; 6, S. anginosus KCOM 1400; 7, S. anginosus KCOM 1409; 8, S. anginosus KCOM 1411; 9, S. anginosus KCOM 1417; 10, S. anginosus KCOM 1022; 11, S. anginosus KCOM 1026; 12, S. anginosus KCOM 1453; 13, S. anginosus KCOM 1827; 14, S. anginosus KCOM 1828; 15, S. anginosus KCOM 1830; 16, S. anginosus KCOM 1833; 17, S. anginosus KCOM 1834; 18, S. anginosus KCOM 1836; 19, S. anginosus KCOM 1467; 20, S. anginosus KCOM 1511; 21, S. anginosus KCOM 1515; 22, S. anginosus KCOM 1522; 23, S. anginosus KCOM 1537; 24, S. anginosus KCOM 1062; 25, S. anginosus KCOM 1069; 26, S. anginosus KCOM 1172; 27, S. anginosus KCOM 1063; 28, S. anginosus KCOM 1173; 29, S. anginosus KCOM 1065; 30, S. anginosus KCOM 1174; 31, S. constellatus ATCC 27823 T; 32, S. constellatus KCOM 1629; 33, S. constellatus KCOM 1631; 34, S. constellatus KCOM 1632; 35, S. constellatus KCOM 1650; 36, S. constellatus KCOM 1385; 37, S. constellatus KCOM 1662; 38, S. constellatus KCOM 1663; 39, S. constellatus KCOM 1664; 40, S. constellatus KCOM 1667; 41, S. constellatus KCOM 1039; 42, S. constellatus KCOM 1043; 43, S. constellatus KCOM 1046; 44, S. constellatus KCOM 1669; 45, S. constellatus KCOM 1670, 46, S. constellatus KCOM 1807; 47, S. constellatus KCOM 1831; 48, S. constellatus KCOM 1895; 49, S. constellatus KCOM 1896; 50, S. constellatus KCOM 1897; 51, S. constellatus KCOM 1534; 52, S. constellatus KCOM 1314; 53, S. intermedius KCTC 3268 T; 54, S. intermedius KCOM 1879; 55, S. intermedius KCOM 1880; 56, S. intermedius KCOM 1881; 57, S. intermedius KCOM 1873; 58, S. intermedius KCOM 1874; 59, S. intermedius KCOM 1545; 60, S. intermedius KCOM 1544.

 Takao 등[14]이 개발한 S. constellatus와 S. intermedius를 동시에 검출할 수 있는 multiplex PCR 프라이머들을 이용하여 PCR을 수행한 결과 16S rDNA 핵산염기서열을 바탕으로 얻은 계통도에서 S. constellatus (C1-1)와 S. intermedius (C1-2)에 속한 균주들로부터 각각 752bp와 428bp 크기의 PCR 증폭물을 얻을 수 있었다(Fig. 2B). 또한 S. anginosus (C2) 균주에서는 PCR 산물이 증폭되지 않았다 (Fig. 2B).

 Neuraminidase 유전자 핵산염기서열을 바탕으로 설계된 S. intermedius 종-특이 PCR 프라이머들을 이용하여 PCR을 시행한 결과 계통도에서 S. intermedius 표준균주가 포함된 cluster (C1-2)에 해당하는 균주에서만 439bp의 PCR 산물이 증폭되었다Fig. 2C).

고 찰

본 연구 결과 16S rDNA 핵산염기서열 결정법 및 PCR법 의해 AGS에 속하는 56개 한국인 유래 임상균주들을 종 수준으로 동정할 수 있었다. 16S rDNA 핵산염기서열비교결정법에서 세균을 종 수준으로 동정할 때, 표준균주의 16S rDNA와 98%이상 상동성을 보일 때, 같은 종으로 판정을 한다[5]. AGS에 속하는 3가지 세균 종 중에서 S. anginosus는 S. intermedius와 S. constellatus와 98% 미만의 상동성을 보이기 때문에 16S rDNA 핵산염기서열의 상동성 분석으로도 쉽게 종 수준으로 동정할 수 있었다. 하지만 S. intermedius와 S. constellatus는 서로 98% 이상의 상동성을 보여 단순한 상동성 분석만으로는 이들을 종 수준으로 동정하기 어려웠기 때문에, 계통도를 만들고 bootstrap 값을 1,000회로 하여 그 확률을 높였다. 그 결과 S. intermedius와 S. constellatus의 표준균주를 포함하는 각각의 cluster가 형성되어 이들을 종 수준으로 동정할 수 있었고, 이 때 bootstrap 값은 각각 99과 77이었다(Fig. 1). 그러므로 본 연구에서 16S rDNA 핵산서열비교분석법에 의해 동정된 AGS 임상균주들은 향후 병인론 연구 및 이들을 종 수준으로 동정할 수 있는 real-time PCR 프라이머를 개발하는데 이용될 수 있을 것으로 생각된다. 

 이러한 16S rDNA 핵산서열결정비교분석법은 임상에서 얻은 균주를 동정하는 데에는 시간적 제약이 있다. 현재 개발된 여러 세균 동정 및 검출법에 있어서 가장 신속한 방법이 PCR법이다. 그러므로 본 연구에서는 종-특이 PCR 프라이머들을 이용해 AGS에 속하는 3가지 세균 종을 동정 할 수 있는지를 검증하였다. 그 결과 Cho 등[13]이 개발한 S. anginosus 종-특이 PCR 프라이머들(ChDC-ANG-F7/ hDC-ANG-R7)에 의해 본 연구에서 16S rDNA 핵산염기서열비교분석법으로 S. anginosus로 동정된 균주들에서만 PCR 산물이 증폭됨을 알 수 있었다(Fig. 2A). Cho 등[13]의 연구에서 Takao 등[14]이 개발한 S. anginosus-특이 PCR 프라이머들(16S ANG-U/16S ANG-D)을 ChDC-ANG-F7/ hDC-ANG-R7 프라이머들과 비교하여 실험한 결과 동일한 민감도와 종-특이성을 보인다고 보고하였다. 그러므로 ChDC-ANG-F7/ChDC-ANG-R7와 16S ANG-U/16S ANG-D 프라이머들을 같이 사용할 경우 S. anginosus를 좀 더 정확하게 동정 및 검출할 수 있을 것으로 생각된다.

Takao 등[14]이 개발한 S. constellatus와 S. intermedius을 동시에 검출할 수 있는 multiplex PCR 프라이머들에 의해서 본 연구에서 사용된 AGS 균주들이 각각 종-특이적으로 검출됨을 확인하였다(Fig. 2B). Takao 등[14]은 S. constellatus를 검출할 수 있는 HYL-MIX-U/HYL-CC-D 프라이머들과 S. intermedius를 검출할 수 있는 HYL-MIX-U/ YL-INT-D 및 ILY-4DFw/ILY-WholeC Bw 프라이머[17]를 동시에 이용하여 한 번의 PCR로 S. constellatus와 S. intermedius를 검출할 수 있다고 보고 하였다. 또한 HYL-MIX- /HYL-CC-D 프라이머들에 의해 S. constellatus의 두 개의 아종(subsp. constellatus 및 subsp. pharyngis)을 PCR 산물의 크기로 구별 할 수 있다고 하였다. 본 연구자들도 Takao 등[14]이 제시한 방법으로 multiplex PCR을 시행하였지만 동일한 결과를 얻을 수 없었다(data not shown). 이러한 이유는 현재로써는 알 수 없지만 multiplex PCR의 민감도가 단일 PCR 법보다 떨어지고, 여러 개의 PCR 프라이머들을 사용하기 때문에 이들 프라이머들 간의 상호 반응에 의한 이유일 수 있을 것으로 생각된다. 본 연구에서는 multiplex PCR의 단점을 보완하기 위해 HYL-MIX-U/HYLC- D/HYL-INT-D 프라이머들만을 이용하여 실험한 결과 S. constellatus와 S. intermedius를 종-특이적으로 검출할 수 있었다(Fig. 2B). HYL-MIX-U/HYL-CC-D/HYL-INT-D 프라이머들을 이용한 PCR에서 430 bp의 증폭물이 보일 경우 S. constellatus subsp. pharyngis라고 보고 되었다[14]. 그러므로 본 연구에서 S. intermedius를 다른 AGS와 분류 시 시행하였던 생화학검사에서 S. intermedius에만 euraminidase 활성이 있다는 보고[15,16]에 착안하여 neuraminidase를 표적으로 하는 S. intermedius-특이 PCR 프라이머(Sinial- F1/Sin-Sial-R1)를 개발하였다. 이들의 종-특이성은 S. intermedius 이외의 13 세균 종(S. pneumoniae, S. oralis, S. sanguinis, S. parasanguinis, S. mitis, S. gordonii, S. sobrinus, Porphyromonas endodontalis, Capnocytophaga gingivalis, Leptotrichia buccalis, Actinomyces naeslundii, A. actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia) 표준균주를 이용하여 검증하였다(data not shown). 본 연구에서 Sin-Sial- 1/Sin-Sial-R1 프라이머를 이용하여 59개 AGS 균주를 대상으로 PCR을 시행한 결과 S. intermedius 균주에서만 PCR 산물이 증폭되었다(Fig. 2). Goto 등[14]의 연구에서 ily gene(intermedilysin)의 유전자 핵산염기서열을 바탕으로 개발된 S. intermedius-특이 PCR 프라이머를 이용하여 본 연구에서 사용된 모든 균주들을 대상으로 PCR을 시행하였다. 그 결과 본 연구에 사용된 S. intermedius-특이 PCR 프라이머들로 검증한 결과와 동일한 결과를 얻었다(data not shown). 이는 HYL-MIX-U/HYL-INT-D/HYL-CC-D 프라이머들을 이용한 PCR 결과 본 연구에서 사용된 모든 S. constellatus 균주들은 752 bp의 증폭산물을 보였기 때문에 S. constellatus subsp. constellatus 인 것으로 생각된다. 이러한 점들을 고려할 때 한 번의 PCR에 의해 여러 세균종을 검출할 수 있는 multiplex PCR의 장점은 있으나, 민감도나 특이성이 떨어지기 때문에 단일 PCR법을 이용하여 S. constellatus와 S. intermedius를 검출하는 것이 나을 것이라 생각된다.

 이상의 연구결과를 종합하면, 한국인 구강으로부터 분리된 56균주의 AGS에 속하는 연쇄구균들을 16S rDNA 핵산염기서열비교분석법과 종-특이 PCR법에 의해 종-수준으로 동정할 수 있었고, 향후 이들 세균 종을 이용한 병인론 연구에 이용할 수 있을 것으로 생각된다.

감사의 글

이 논문은 2010년도 정부(교육과학기술부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임 (No. 2010-0025411)