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서 론

 Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)가 1961년 처음 보고[1]된 이후, MRSA 뿐만 아니라 여러 항생제에 대한 저항성을 갖는 다제내성 S. aureus의 출현이 증가하고 있다[2,3]. 이러한 MRSA 균주들은 일반 S. aureus처럼 세균 감염 증상을 보이지 않는 사람의 비강이나 피부에 존재하며, 공기를 따라 전파될 수 있어 원내 감염을 일으킬 수 있다[4]. 실제로 우리나라 3차 병원과 1, 2차병원 각각에서 분리되는 S. aureus의 70% 및 40% 이상이MRSA라고 보고 되었다[5,6]. 이러한 보고에 의하면 치과 병원의 환경이나 치과 의료인에 MRSA가 오염될 경우 치과 진료를 받은 환자들이 원내 감염에 의해 세균성 심내막염, 패혈증 및 골수염에 이환될 수도 있을 것으로 생각된다. 그러므로 치과 진료 환경이 MRSA에 오염되지 않도록 이에 대한 소독제 개발이 필요할 것으로 생각된다.

 일반적으로 항균제로 널리 사용되는 항생제는 내성을 유발하는 단점이 있기 때문에 천연물을 이용한 항균제 개발에 대한 연구가 많이 진행되고 있다[7-9]. 이러한 천연물들 중에서 에센셜 오일(essential oils)은 많은 식물의 잎이나 줄기의 이차 대사산물로 생산되는 향기를 갖는 기화성 물질로 항균능을 갖는 것으로 알려져 있다[10,11]. 특히, oxygenated monoterpenes 계통인 linalool과 monoterpene hydrocarbons 계통인 α-terpineol은 치주질환 원인 균인 Porphylomonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, Aggregatibacter actinomycetemcomitans 등과 우식원인 균인 Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus 등에 대해 항균능이 있음이 보고 되었다[10-13]. 일반적으로 천연물의 항균능을 조사할 때 표적 세균 종의 표준균주나 소수의 균주만을 사용하는 경우가 대부분이다. 하지만, 본 연구자의 선행연구 결과에 의하면, 균주에 따라 항균의 차이가 존재하는 것을 알 수 있었다[14,15]. 그러므로 본 연구는 치과 병원에서 치과 진료 의자(dental unit chair)나 핸드피스 등의 환자 몸과 접촉되지 않은 치과 진료기구소독에 사용할 항 MRSA 소독제 개발에 linalool과 α-terpineol을 사용할 수 있는지, 적정 농도는 얼마인지를 알아보기 위하여 시행하였다.

재료 및 방법

세균 및 배양조건

 본 연구에 사용된 MRSA 균주(KCOM 1588, KCOM 1589, KCOM 1590, KCOM 1591, KCOM 1592, KCOM 1593, KCOM 1594, KCOM 1595, KCOM 1597, KCOM 1598, KCOM 1599, KCOM 1600, KCOM 1601, KCOM 1602, KCOM 1603, KCOM 1604, KCOM 1605 및 KCOM 1606)들은 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology, Gwangju, KCOM)에서 분양 받아 사용하였다. 이들 세균들은 brain heart infusion (BHI, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) 액체배지 및 한천배지를 이용하여, 37℃ 세균배양기에서 1일간 배양한 후 다음 실험에 사용하였다.

Minimum inhibitory concentration (MIC) 및 minimum bactericidal concentration (MBC) 측정

 본 연구에서는 oxacillin과 ampicillin의 항생제를 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고 linalool과 α-terpineol의 에센셜 오일을 ACROS (NJ, USA)에서 구입하여 사용하였다. MRSA 균주들의 oxacillin에 의한 항생제감수성 여부 및 linalool과 α-terpineol의 항균능을 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) [16]에서 제시한 미세희석(micro-dilution) 법을 이용하여 MIC와 MBC 값을 측정하여 알아보았다. 각각의 MRSA 균주들을 BHI 액체배지를 이용하여 37˚C 세균배양기에서 24시간 배양한 후, 파장 600 nm에서 배양액의 흡광도를 측정하여 1 × 10⁶ CFU/ml 농도의 세균용액을 96-well plate에 100 μl씩 분주하였다. 여기에 반응 물질인 oxacillin (0.5, 1, 2, 4, 8, 16 and 32 μg/ml), linalool (0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.4 and 12.8 mg/ml)과 α-terpineol (0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2 and 6.4 mg/ml)은 각각 2배의 농도로 BHI에 희석한 후, 앞에서 준비한 96-well plate에 100 μl씩 첨가하여 37℃에서 24시간 동안배양하였다. 세균이 자라지 않는 well의 oxacillin, linalool과 α-terpineol 농도를 MIC 값으로 판정하였다. 이때 oxacillin은 물에 녹여 0.2 μm 기공의 필터로 여과하여 사용하였고, linalool과 α-terpineol은 dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma)에 희석하여 사용하였다. 음성대조군은 멸균된 물(oxacillin 실험)또는 DMSO (linalool과 α-terpineol 실험)를 세균배양액의 1%가 되도록 첨가하였고, 양성대조군은 ampicillin(100 mg/ml)를 세균배양액의 1%가 되도록 첨가하여 세균배양 하였다. MIC 값을 구하기 위해 배양하였던 각 well의 세균배양액을 10 μl를 취한 후, BHI 한천배지에 도말하고 37℃ 세균배양기에서 24 h 배양하여 세균이 자라지 않은 well의 농도를 MBC 값으로 정하였다. 모든 실험은 3번 반복하여 값을 구하였다.

결 과

 MRSA 균주들의 linalool과 α-terpineol의 항균능 실험결과 linalool은 한국인 유래 18개 MRSA 균주에 대하여 MIC/MBC 값이 각각 1.6 mg/ml-12.8 mg/ml로 넓은 범위의 값을 보였다. α-terpineol의 경우는 MIC/MBC 값이 0.8 mg/ml-6.4 mg/ml의 범위를 가졌다(Table 1). Linalool과 α-terpineol의 18개 MRSA 균주에 대하여 MBC₉₀ 값이 각각 >12.8 mg/ml 및 6.4 mg/ml의 값을 보여 α-terpineol이 linalool에 비하여 MRSA 균주에 대한 항균효능이 더 강한것으로 조사되었다(Table 2).

Table 1. Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) values of oxacillin, linalool, and α-terpineol against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)

Table 2. Antimicrobial effect of linalool and α-terpineol against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) isolated from Koreans

고 찰

 본 연구에서 사용한 MRSA 균주들은 MRSA 선택배지[17]에서 분리하여 VITEX II 장비로 생화학적 방법을 이용하여 동정된 것들이다(data not shown). 또한 methicillin저항 유전자인 mecA을 PCR 법으로 검출하여 그 존재를 확인하였다[18]. 본 연구에서는 이들 MRSA 균주들의 methicillin 저항성을 확인하기 위하여 oxacillin을 이용하여 MIC 및 MBC 값을 구하였다. CLSI에서는 oxacillin 4 μg/ml 이상의 농도에서 MIC 값을 가질 경우 methicillin에 저항성을 갖는 포도구균(MRSA)으로 정의하였다. 연구 결과 본 연구에서 사용한 모든 균주들이 모두 32 μg/ml 농도가 초과된 MIC 값을 가져 모두 MRSA인 것으로 판정되었다. 다만, 선행연구[18]에서 MRSA라고 생각되었던 S. aureus KCOM 1596 균주는 oxacillin 2 μg/ml 농도에서 MIC 값을 보여 MRSA가 아닌 것으로 판단된다(data not shown). 이러한 이유는 현재로써는 명확하지 않지만, 이 균주의 mecA 유전자(penicillin에 대한 결합력이 떨어지는 penicillin-binding protein)에 돌연변이가 생겨 penicillin에 대한 결합력이 회복되었기 때문일 것으로 생각된다. 하지만, 이에 대한 기전은 추후 연구에서 밝혀야 할 것으로 생각된다.

 에센셜 오일은 세균의 세포벽을 파괴, 세균 효소의 활성을 억제하거나, 특정 유전자 조절유전자의 단백질 발현을 억제하여 항세균 작용을 갖는 것으로 알려져 있다[19-21]. 그러므로, linalool과 α-terpineol들도 MRSA에 대해 이와 비슷한 기전으로 항세균 효능을 갖는 것으로 생각된다. 선행연구에서 사람유래 KB 세포주에 대한 세포독성실험 결과 linalool과 α-terpineol은 0.8 mg/ml 이상의 농도에서 99.8%세포가 사멸하는 것으로 보고되었다[13]. 그러므로 이들을 인체에 직접 사용하기는 어려울 것으로 생각된다. MRSA가 일반병원 및 치과병원 내 오염된 공기나 진료 장비를 통하여 환자들에게 감염될 수 있다[22]는 점을 고려한다면, 스프레이 형태의 소독제 개발에 이용될 수 있을 것이다. 즉, 치과 진료 의자(dental unit chair)나 핸드피스 등의 환자 몸과 접촉되지 않은 치과 진료기구 소독에 α-terpineol이 들어있는 소독제를 사용할 수 있을 것으로 생각된다.

 이상의 연구결과를 종합하면, MRSA에 대한 linalool과 α-terpineol의 MIC₉₀/MBC₉₀ 값은 각각 >12.8 mg/ml과 6.4 mg/ml로 α-terpineol이 linalool보다 MRSA에 대한 항균 효과가 더 뛰어남을 알 수 있었다. 그러므로, α-terpineol은 6.4 mg/ml 이상의 농도에서 치과 도구 및 치과진료의자 등의 소독을 위한 항 MRSA 소독제 개발에 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

감사의 글

 이 논문은 2012학년도 조선대학교 학술연구비의 지원을 받아 연구되었음.