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서 론

 국소마취제는 신경세포에 존재하는 전압의존성 나트륨채널에 작용하여 활동전위의 생성에 의한 신경전도가 가역적으로 차단되어 신경말단의 흥분을 억제한다 [1,2]. 국소마취제의 한 종류인 QX-314(N-ethyl-lidocaine)는 리도카인(lidocaine)의 4가 유도체로서 리도카인의 아미노기에 N-ethyl기가 추가되어 양성하전된(positive charged) 구조를 가지고 있다. 이러한 구조적 특성상 QX-314를 단독으로 투여하면 생체 세포막을 통과하기 어렵기 때문에 [3,4] 생체에서 약물의 효용성을 연구한 보고는 부족한 실정이다. 최근 연구에서 QX-314를 capsaicin과 함께 투여하면 일반 감각과 운동 신경에는 영향을 주지 않으면서 강력한 진통작용이 발생한다는 것을 보고하였으며 [5], 이러한 진통작용은 capsaicin에 의해 열린 TRPV1 통로를 통하여 QX-314가 세포 내로 이동할 수 있기 때문에 나타난다고 알려져 있다 [5].

 측두하악관절 장애(temporomandibular disorder, TMD)는 측두골과 하악골을 이어주는 관절인 측두하악관절(temporomandibular joint, TMJ)에 염증이 생기거나 탈구와 같은 기능장애가 발생하면 유발될 수 있다. 측두하악관절 장애의 주요 증상은 턱관절에서 나는 소리와 하악의 움직임이 제한되어 나타날 뿐 아니라 관절에서 통증이 발생하기도 한다 [6-8]. 그러나 측두하악관절 장애 환자에서 발생하는 악관절 통증의 전도나 조절기전에 관해서는 아직 많이 알려져 있지 않다.

 현재까지 통증 치료는 국소마취제인 리도카인이나 마약성 진통제 또는 비스테로이드성(non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID)계 약물을 주로 사용하고 있지만 작용시간이 짧고 부작용이 발생하기 때문에 제한적으로 사용되고 있다 [9]. 최근 연구에서 리도카인의 유도체인 QX-314는 리도카인에 비하여 진통 작용시간이 오래 유지된다는 것을 보고하였다 [10]. 따라서 QX-314를 투여하여 측두하악관절 장애에서 발생하는 통증을 조절하는데 사용한다면 보다 효과적으로 사용될 수 있으리라 판단되지만 현재까지 QX-314가 측두하악관절 장애로 인해 발생되는 통증을 어떻게 조절할 수 있는지에 대한 연구는 거의 이루어지지 않고 있다.

 본 연구에서는 측두하악관절에 염증성 통증이 발생했을 때 QX-314를 투여하여 진통작용이 발생하는지를 확인하고, QX-314의 진통작용이 어떠한 기전을 통해 나타나는지 알아보고자 하였다. 이러한 목적을 위하여 실험동물 흰 쥐의 측두하악관절 내로 포르말린을 투여하여 염증성통증을 유발하였으며, 저농도 혹은 고농도의 QX-314를 측두하악관절 내로 처치하여 통증에 미치는 영향을 평가하였다. 또한 QX-314가 TRPV1 통로를 통해 작용하는지를 확인하기 위해 TRPV1 통로의 효현제인 capsaicin 혹은 TRPV1 통로의 억제제인 capsazepine을 QX-314와 함께 투여하여, QX-314를 투여하여 나타나는 진통작용에 TRPV1 통로가 어떠한 역할을 하는지를 평가하였다.

재료 및 방법

실험동물

 실험동물은 수컷 Sprague-Dawley계 흰쥐(220-280 g)를 사용하였고, 경북대학교 치의학전문대학원 동물실에서 일정한 온도와 12시간 주/야 빛의 순환주기를 갖는 환경에서 실험동물용 사료와 물을 자유롭게 공급하여 사육하였다. 본 연구는 경북대학교 치의학전문대학원 실험동물위원회의 승인을 얻었으며, 의식이 있는 동물의 실험에 관한 세계통증연구학회의 윤리적 규정을 준수하였다.

측두하악관절 내로 포르말린 주입

 실험동물은 스트레스를 최소화하기 위해 실험 전 30분 동안 관찰통에 놓아 적응시켰다. 적응기간이 지난 다음 실험동물을 3% isoflurane으로 마취하여 측두하악관절 내로 Hamilton 주사기를 이용하여 5% 포르말린 용액 50 μL를 주입하였으며, 대조군에는 생리식염수를 주입하였다.

포르말린에 의해 유도되는 통증 행위반응의 평가

 통증 행위반응 평가는 선행 연구방법 [11-18]을 토대로 포르말린을 주입한 직후에 나타나는 안면 부위를 자발적으로 긁는 행위반응(scratching)의 횟수를 5분 단위로 45분간 기록하여 정량화하였다. 일반적으로 포르말린에 의해 발생하는 통증 행위반응은 주입 직후 나타났다가 점차 감소하여 반응이 약해지다가 약 10분 후부터 다시 증가하는 이상성(biphasic) 형태를 보인다 [11-18]. 따라서 5% 포르말린 주입 직후부터 10분까지 나타나는 1차 반응(1st phase)과 10분에서 45분까지 나타나는 2차 반응(2nd phase)으로 구분하여 평가하였다.

QX-314 투여 농도에 따른 효과

 측두하악관절 내로 2.5% 또는 5% QX-314(25 μL)를 5% 포르말린(50 μL)과 같이 주입하였다. QX-314는 Sigma Aldrich사로부터 구입하여 생리식염수에 용해시켰다. 대조군은 QX-314의 용매인 생리식염수를 주입하여 평가하였다.

TRPV1이 QX-314 작용에 미치는 효과

 TRPV1 통로가 활성화되어 열릴 때 QX-314 진통작용이 증가하는지 알아보기 위하여 TRPV1 효현제인 capsaicin을 투여하여 평가하였다. capsaicin 1 μg을 2.5% 또는 5%의 QX-314와 포르말린과 같이 측두하악관절 내로 투여한 다음 포르말린에 의해 유도되는 통증행위에 미치는 영향을 평가하였다. 대조군으로는 capsaicin의 용매를 QX-314와 포르말린과 함께 측두하악관절 내로 투여하였다. 또한 고농도 QX-314(5%)의 진통작용에 TRPV1 통로의 역할을 구명하기 위하여 TRPV1 통로를 차단시키는 물질인 capsazepine을 투여한 다음 진통작용을 평가하였다. capsazepine 0.1 μg을 5% QX-314와 함께 측두하악관절내로 투여한 다음 포르말린에 의해 발생되는 통증행위에 미치는 영향을 평가하였다. capsaicin은 Sigma Aldrich제품을 사용하였고 10% ethanol, 10% Tween 80, 80%의 생리식염수에 용해시켰다. capsazepine은 Tocris사로부터 구입하였으며 10% dimethyl sulfoxide(DMSO)와 90%의 생리식염수에 용해시켰다.

염증확인

 포르말린이 측두하악관절 내로 정확하게 주입되어 염증반응을 야기하였는지 Evans' blue 염색시약을 이용하여 확인하였다 [12,16,20,21]. 통증행위반응을 관찰하는 실험이 끝난 후, 실험동물을 ketamine(40 mg/kg)과 xylazine(4 mg/kg) 혼합액으로 마취하고, Evans' blue 염색시약(0.1%, 5 mg/kg)을 우측대퇴정맥으로 주입하였다. 염색시약 주입 10분 뒤, 각 실험동물은 생리식염수로 관류시키고 관절조직을 적출하여 측두하악관절 내의 염색 유무를 확인하였다.

통계분석

 행위 반응 실험 결과의 통계분석은 반응 횟수의 유의성을 검증하기 위해 일원배치분산분석(ONE-WAY ANOVA)과 bonferroni의 사후 분석(post-hoc analysis)을 실시하였다. 통계적인 비교를 위해 통계적 유의성의 표준값은 P<0.05로 설정하였다. 모든 결과는 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표시하였다.

결과

 포르말린을 측두하악관절 내로 주입하면 안면을 긁는 통증 행위반응이 45분 동안 지속되었고, 이러한 반응은 주입직후부터 10분 동안 빠르고 즉각적으로 나타나는 1차 반응(1st phase)과 10-45분 동안 장기간에 걸쳐 지속적으로 나타나는 2차 반응(2nd phase)으로 구분되어 나타났다. QX-314를 측두하악관절 내로 투여하여 포르말린에 의해 나타나는 통증행위반응에 미치는 영향을 관찰하였다. 저농도인 2.5%와 고농도인 5% QX-314를 포르말린과 함께 주입하여 관찰한 결과를 그림 1에 나타내었다. 포르말린을 측두하악관절 내로 주입하면 대조군인 생리식염수를 주입했을 때에 비해 유의한 통증행위반응이 발생하였다. 저농도인 2.5% QX-314를 같이 처치하면 포르말린에 의해 유도되는 통증행위반응에 영향을 미치지 못하였지만, 고농도인 5% QX-314를 처치하였을 경우 포르말린에 의해 발생되는 안면을 긁는 통증 행위반응 횟수가 유의하게 감소하였다(Fig. 1, P<0.05).

Fig. 1. formalin-induced nociceptive behavior. Co-injection of low dose of QX-314 (2.5%) with formalin did not attenuate the formalin-induced scratching response. However, high dose of QX-314 (5%) significantly reduced the formalin-induced nociceptive behavior. There were 8 animals in each group. *P<0.05, saline-treated group vs. vehicle+formalin-treated group, # P<0.05, vehicle+formalin-treated group vs. QX-314+ formalin-treated group.

 TRPV1 통로를 활성화시키면 QX-314의 진통작용이 증가하는지를 확인하기 위하여 TRPV1 통로 효현제인 capsaicin을 QX-314와 함께 투여하여 통증에 미치는 영향을 관찰한 결과를 그림 2에 나타내었다. Capsaicin을 저농도인 2.5% QX-314와 함께 투여하면 QX-314를 단독 투여했을 때 나타나지 않았던 통증억제반응이 나타났다(Fig. 2, P<0.05). Capsaicin을 고농도인 5% QX-314와 함께 투여하면 5% QX-314를 단독투여 하였을 때 나타나는 진통작용과 비슷하게 나타났으며 capsaicin을 함께 투여 하더라도 5% QX-314의 단독투여로 발생하는 진통작용을 더 증가시키지는 못하였다(Fig. 2).

Fig. 2. Effects of TRPV1 receptor agonist (capsaicin, 1 μg) on the formalin-induced noxious behavioral responses in rats with co-administration of QX-314. Co-administration of capsaicin (CAP) with 2.5% QX-314 significantly reduced the number of scratches compared to the vehicle-treated group. However, co-administration of capsaicin with 5% QX-314 did not enhance anti-nociceptive effects in the formalin-induced nociceptive behavior. There were 8 animals in each group. *P<0.05, vehicle+formalin-treated group vs. vehicle+QX-314+ formalin or CAP+QX-314+formalin-treated group.

 고농도인 5% QX-314는 저농도 QX-314의 결과와 비교하여 볼 때 단독으로 투여하였을 때에도 유의한 진통작용을 보여주고 있다. 고농도의 QX-314 처치 시 나타나는진통작용에 TRPV1의 통로가 관여하는지 알아보기 위하여 TRPV1 통로 억제제를 5% QX-314를 함께 처치한 결과를 관찰하여 그림 3에 나타내었다. 고농도인 5% QX-314를 단독처치하면 포르말린에 의해 발생하는 통증행위반응을 유의하게 감소시켰다. TRPV1 통로 억제제인 capsazepine을 5% QX-314와 함께 처치하면 5% QX-314에 의해 나타나는 진통작용을 차단하지 못하였다(Fig. 3).

Fig. 3. Effects of TRPV1 receptor antagonist (capsazepine, 0.1 μg) on anti-nociceptive action of high dose of QX-314. Intra-articular injection of 5% QX-314 attenuates formalininduced noxious scratching behavior. However, co-administration of capsazepine (CZP) did not block anti-nociceptive action of 5% QX-314. There were 8 animals in each group. *P<0.05, vehicle+formalin-treated group vs. vehicle+QX-314+formalin or CZP+QX-314+formalin-treated group.

고 찰

 본 연구는 포르말린을 측두하악관절 내로 투여하여 발생하는 염증성 통증 반응을 실험모델로 이용하여 QX-314의 진통작용 기전을 연구하였다. 저농도인 2.5% QX-314는 진통작용을 나타내지는 못하였지만 고농도인 5% QX-314는 단독 투여로 유의한 진통작용을 보여 주었다. TRPV1 통로 효현제인 capsaicin은 2.5% QX-314 단독투여시 나타나지 않았던 진통작용을 보여 주었으나 5% QX-314의 진통작용은 더욱 증가시키지는 못하였다. 또한 TRPV1 통로 억제제인 capsazepine은 5% QX-314에 의해 발생된 진통작용을 차단하지 못하였다. 이러한 실험 결과는 TRPV1 통로가 QX-314의 진통작용 발생에 매우 중요하다는 것을 보여주고 있으나 고농도의 QX-314는 TRPV1 통로와는 상관없이 진통작용을 야기한다는 것을 알 수 있다. 이러한 실험결과는 QX-314는 농도에 따라 세포막을 통과하는 기전이 다를 수 있음을 보여준다.

QX-314의 진통작용

 QX-314는 리도카인의 친수성의 4가 유도체로서 세포내에 직접 처치하면 나트륨 통로를 차단시킬 수 있지만, 세포 밖에서 처치하면 세포막을 통과할 수 없다 [22,23]. 따라서 capsaicin에 의해 TRPV1 통로가 열리면 QX-314가 세포내로 유입되어 나트륨 통로를 차단시키고 통각수용기의 흥분을 억제한다 [5,24]. 최근 연구에서는 QX-314와 capsaicin을 함께 실험동물의 발바닥의 피하조직으로 주입하면 기계 자극과 열 자극에 대한 민감도가 감소하였고[5], QX-314와 capsaicin을 함께 좌골신경의 주위로 주입하면 좌골신경을 만성적으로 압박하여 발생한 신경병증성 통증에서 기계 자극과 열 자극에 대한 민감도가 감소하여 진통작용이 발생하였다 [25]. 또한 안면영역에 피하로 QX-314와 capsaicin을 함께 투여하면 capsaicin을 단독으로 투여한 그룹에 비해 열자극에 대한 민감도가 감소하였다[24]. 이러한 실험결과들을 볼 때 QX-314가 통증을 감소시킬 수 있다고 보고되었지만 아직까지 악안면 영역에서 발생한 염증성 통증에서의 관련한 연구는 부족하며 특히 측두하악관절에서 발생한 통증에 QX-314의 진통작용과 기전연구는 거의 없는 실정이다.

QX-314의 측두하악관절에서 발생되는 통증 조절 작용

 측두하악관절 장애는 측두하악관절과 저작근의 염증 등으로 기능장애가 발생하는 근골격성 질환으로서 [26] 일반적으로 만성적인 통증을 동반한다 [27]. 측두하악관절 장애로 발생하는 통증을 연구하기 위한 동물 실험 모델로는 측두하악관절 내로 포르말린 [12,16,19]이나 mustard oil[28] 그리고 complete Freund's adjuvant(CFA) [21,29] 등과 같은 화학 물질을 주입하여 통증을 유발시키는 방법이 있다. 측두하악관절 장애를 치료하기 위해 사용되는 약물로는 NSAID, opioid와 같은 마약성 진통제, corticosteroid, 항우울제, 리도카인 등이 있다 [30]. QX-314는 리도카인에 비하여 진통작용시간이 오래 유지될 뿐 아니라 [10], 감각신경과 운동 신경에는 영향을 주지 않으면서 진통작용을 발생하였다 [5]. 본 연구에서는 측두하악관절 장애로 인해 발생된 염증성 통증을 QX-314가 억제할 수 있다는 결과를 보여주었다. 이러한 실험 결과는 측두하악관절 장애 환자에게 발생하는 통증 치료에 QX-314가 효과적으로 사용될수 있는 근거를 제공해준다.

고농도에서 QX-314의 진통작용 기전

 저농도 QX-314를 단독으로 투여하면 포르말린 주입으로 발생하는 염증성 통증행위반응을 감소시킬 수 없었지만, capsaicin으로 TRPV1 통로를 열게 되면 통증이 유의하게 감소되는 것을 본 실험에서 확인할 수 있었고, 이와 같은 결과는 다른 연구자들에 의해 이미 보고되었다 [5,24,31]. 그러나 capsaicin을 처치하지 않은 상황에서 고농도의 QX-314를 단독으로 투여하였을 경우에도 포르말린으로 인해 발생되는 통증행위반응이 유의하게 감소하여 진통작용이 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 진통작용은 capsaicin을 같이 투여하여 TRPV1 통로를 열어도 진통작용이 더 증가하지는 못하였다. 또한 TRPV1 통로를 차단하는 capsazepine을 QX-314와 함께 처치했을 때에도 고농도의 QX-314에 의해 나타나는 진통작용을 억제하지 못하였다. 이러한 실험 결과는 저농도의 QX-314는 TRPV1의 통로를 통하여 진통작용을 나타내지만 고농도의 QX-314는 TRPV1 통로를 거치지 않고 다른 기전으로 막을 통과하여 진통작용을 나타낸다는 것을 의미한다. 또한 선행연구에서 고농도의 QX-314를 피하로 단독 처치 하였을 때 본 연구결과와 같이 진통작용이 발생하였는데 [10], 이러한 작용은 친수성 기전을 통해 QX-314가 천천히 세포 내로 이동할 수 있다는 것을 말하지만 정확한 진통작용 기전에 대해서는 추가적인 연구가 필요해 보인다.

 QX-314의 진통작용을 나타내기 위하여 사용하는 capsaicin은 TRP 통로를 활성화하기 때문에 capsaicin의 처치가 이미 통증을 유발시키거나 [24,32] 수용기를 탈감작 시킬 수 있다 [33]. 따라서 진통작용을 나타내기 위하여 capsaicin을 QX-314와 같이 투여하는 것에 대해서는 임상적인 검증이 필요할 것으로 보인다. 또한 리도카인을 QX-314와 함께 처치하면 지속적으로 국소 마취상태를 유지할 수 있다고 보고하였지만 [34,35], 리도카인은 감각신경 뿐 아니라 운동 신경까지 차단하기 때문에 진통제로서의 사용은 제한적일 수 있다. 따라서 고농도의 QX-314가 세포막을 통과할 수 있는 기전을 찾는 연구가 더 진행된다면 진통제로서 보다 효과적으로 사용할 수 있을 것으로 판단된다.

요 약

 이상의 실험 결과들을 요약하면, 포르말린을 측두하악관절 내로 주입하여 발생한 염증성 통증 행위반응은 QX-314의 투여로 감소할 수 있었다. 저농도의 QX-314의 진통작용은 TRPV1 통로를 이용하여 세포막 내로 이동하여 작용이 나타났으며 고농도의 QX-314는 TRPV1 통로와 무관하게 진통작용을 나타내었다. 이와 같은 결과는 측두하악관절 장애로 인해 발생되는 염증성 통증에 QX-314가 효과적인 치료제로 사용할 수 있다는 것을 말해주며, 특히 고농도의 QX-314가 세포막을 이동하는 경로에 대한 연구가 더 진행된다면 임상에서 QX-314가 진통제로서 사용할 수 있는 계기가 될 것으로 판단된다.

감사의 글

 이 논문은 2013년도 정부(미래창조과학부)의 재원(2012M3A9B6055414)과 2013년도 경북대학교 학술연구비와 특성화사업비 지원에 의하여 연구되었음.