서 론

연쇄구균은 인간의 구강에 상주하는 미생물총을 구성 하는 세균 종류 중 한가지로 치아우식증과 세균성 심내 막염의 주된 원인세균이며[1,2] 그밖에 호중구 감소증 환자에서 균혈증과 폐혈증을 일으키는 원인이기도 하다 [3]. 테트라사이클린은 1940년대 처음으로 발견되었고, 광범위 스펙트럼 항생제로 1953년에 내성을 보이는 세 균이 처음으로 발견되었다[4-6]. 일반적인 작용기전은 미 생물 리보솜의 30S 소단위에 부착하여 aminoacyl-tRNA 가 부착되는 것을 방해함으로써 단백질 합성을 억제하 는 것이다.

연쇄구균에서 테트라사이클린 내성기전은 tet(K)와 tet(L)에 의한 능동수송(active efflux)으로 테트라사이클린 이 세포내로 유입되는 것을 억제하는 기전과 tet(M)과 tet(O)가 형성되는 리보솜을 보호하는 단백질(ribosome protection proteins)에 의해 테트라사이클린이 리보솜에 결합하는 것을 억제하는 기전에 의해 나타난다고 보고 되었다[7,8]. tet(M)은 많은 종류의 다른 구강 세균에서 발견되고 있으며[9], tet(O)는 그람 양성 세균에서 처음 발견되었고 그람 음성 세균으로 퍼지고 있는 양상을 보 이고 있다[10]. 테트라사이클린에 대한 내성을 가지는데 필요한 세균의 내성 유전자는 많은 종류가 발견되었지 만, tet(M)과 tet(O) 내성 유전자는 이미 여러 세균에서 광범위하게 발견되고 있다[11-13]. 연쇄구균의 테트라사 이클린 내성은 일반적으로 30S 리보솜 소단위에서 테트 라사이클린 내성을 부여하는 리보솜 보호 내성 유전자 인 tet(M) 또는 tet(O)에 의해 발현된다[10,14].

tet(M) 유전자의 대부분은 Tn916 및 Tn5253과 같은 트랜스포존에 위치하며, 이는 tet(M) 유전자가 여러 종 류의 세균에 널리 분포하는 이유이기도 하다[4]. 진화 과정에서 tet(M) 유전자 간의 재조합으로 부분적 염기 변이가 나타나게 되고, 이로 인하여 테트라사이클린 내 성은 다양한 양상을 보이게 된다[11,15].

본 연구 이전에 테트라사이클린 내성과 관련된 유전 자에 대한 연구가 많이 진행되어왔으나[14-16], 테트라사 이클린에 내성을 유발하는 유전자는 대부분 트랜스포존 에 위치하여 변이가 많고 세균간의 전달이 쉬워서 분포 의 변화가 많은 것으로 알려져 있다[17,18]. 이러한 이유 로 테트라사이클린 내성 유전자의 종류 및 분포는 각 나라별로 차이가 있는 것으로 보고되고 있다[9,13,18].

본 연구에서는 한국인의 치태에서 분리한 구강연쇄구 균을 대상으로 테트라사이클린 내성 관련 유전자 중에 서 연쇄구균의 내성에 주로 관여하는 것으로 알려져 있 는 tet(M)과 tet(O)의 분포를 조사하였다.

재료 및 방법

세균의 동정 및 배양 조건

본 연구에는 최근 2달 동안 항생제를 복용하지 않은 194명의 건강한 사람으로부터 제공받은 치태에서 분리한 구강연쇄구균을 사용하였다. 구강연쇄구균의 분리를 위하 여 지원자로부터 치태를 제공 받았으며, 지원자는 이 연구 의 목적과 과정에 대한 설명을 듣고 연구에 참여한다는 동의서를 제출하였다. 이 연구는 강릉원주대학교 치과병원 의 임상시험심사위원회의 승인을 받았다(IRB2011-2). 채취한 치태 샘플은 멸균증류수에 현탁한 후 멸균된 면봉을 이용 하여 Mitis Salivarius Agar (MSA) (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)에 도말하고 37°C CO₂배양기 에서 72시간 배양하였다. 각 지원자의 구강에서 채취한 치태 샘플을 도말한 MSA 배지에서 세균 집락 모양이 서 로 다른 3-4개의 집락을 무작위로 분리하여 각 콜로니를 Brain Heart Infusion Broth (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)에 접종하여 37°C CO₂배양기 에서 24시간 액체배양 하였다. 무작위로 분리한 세균은 Rapid ID-32 strep system과 Mini API reader (bioMerieux, Marcy-l‘Etoile, France)를 이용하여 9개의 특정 균종(Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis)으로 동정되었다.

항생제 감수성 검사

635개 균주에 대한 테트라사이클린(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)의 감수성을 조사하기 위해 액체배지 희석법으로 최소억제농도(minimum inhibitory concentration; MIC)를 측정하였다[19]. 감수성 여부의 농도는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)에서 권고하는 연쇄구균 의 표준 해석 방법에 의해 결정되었다. 테트라사이클린을 5,120 μg /ml 의 농도로 만들고 필터(0.22 μm )를 사용하여 멸균 하였다. 2.5% laked horse blood (Oxoid limited, Basingstoke, England)를 첨가한 Mueller Hinton II Broth (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)에 1,024 μg /ml 의 농도가 되도록 희석하였다. 96-well plate (SPL, Seoul, South Korea)에 Mueller Hinton II Broth (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)를 이용하여 농도가 0.0002 μg /ml 이 될 때까지 2배씩 단계 희석하였다. 세균은 혈액한천배 지(Komed, Seongnam, South Korea)에 도말하여 37°C CO₂배 양기에서 24시간 배양하고, 생리식염수를 이용하여 0.5 McFaland (1 x 10⁸ CFU/ml)로 현탁하고 각 well에 최종 세균 농도가 5 x 10⁵ CFU/ml이 되도록 접종하였다. 96-well plate를 37°C 일반배양기에서 24시간 배양하고 MIC를 측정하여 항 생제에 대한 감수성을 평가하였다.

Genomic DNA 추출 및 PCR 분석

테트라사이클린에 내성을 보이는 균주를 대상으로 DNA를 추출하였다. DNA 추출을 위해 Accuprep^® Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Daejeon, South Korea)를 사용하였으며 DNA는 -70°C 에 보관하였다. Bioneer HotStart Taq polymerase (Bioneer, Daejeon, South Korea)와 특정 primer를 이용하여 PCR을 시행하였다. 사용한 primer의 염기서열과 PCR 조건들은 표 1에 나열되어 있다. PCR product를 1.5% agarose gel에 전기 영동하였고 ethidium bromide로 염색 후 ultraviolet (UV) transilluminator (COREBIO, Seoul, South Korea)로 관찰하였다. tet(M) DNA 크기는 1862bp 이고 tet(O)는 559bp이다. PCR에 의해 발견된 유전자가 tet(M)과 tet(O)가 맞는지 확인하기 위해 각각 증폭된 DNA 한 개씩을 AccuPrep^® PCR purification kit (Bioneer, Daejeon, Korea)을 사용하여 정제하고 마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 얻었다. 염기서열은 Blastn (genome database of the National Center for Biotechnology Information)를 이용하여 분석하였다.

결 과

건강한 성인의 치태로부터 얻은 구강연쇄구균에 대하 여 액체희석법을 이용한 항생제 감수성 검사 결과 635 개의 분리균주 중에서 148개(23.3%) 균주가 테트라사이 클린에 내성을 나타냈다. 148개 테트라사이클린 내성 구 강연쇄구균을 대상으로 tet(M)과 tet(O)내성 유전자의 분 포를 조사하였다. 테트라사이클린 내성 유전자 tet(M)과 tet(O) primer를 이용하여 얻은 각각의 DNA를 1.5% agarose gel에 전기영동 시킨 결과는 Fig. 1과 같다.

tet(M)은 148개 내성 균주 중 68균주(45.9%), tet(O)는 3균주(2.0%)에서 발견되었다(Table 1). 분리된 균주 중에 서 테트라사이클린에 내성을 보이는 균주는 S. oralis(42 균주)와 S. mitis(37균주)가 가장 많이 나타났으며, tet(M) 유전자는 S. oralis에서 22균주(52.4%), S. mitis에서는 17 균주(45.9%)에서 발견되었다. 전체 내성 균주 중 tet(O) 는 S. anginosus 2균주, S. constellatus 1균주로 확인되었 다(Table 2). S. salivarius 7균주 중 4균주(57.1%)에서 tet(M)이 발견되었으며 S. sanguinis 20균주 중에서는 12 균주(60.0%)에서 tet(M)이 발견 되었다. tet(M)과 tet(O)를 동시에 가지는 균주는 없었다. 테트라사이클린에 내성을 보이는 균주 중에서 77개(52%)가 tet(M)과 tet(O) 유전자 를 나타내지 않는 것으로 확인되었다.

각각의 primer에 의해 증폭된 유전자의 염기서열은 Blastn 탐색 결과 tet(M)과 tet(O)로 확인되었다.

고 찰

테트라사이클린에 내성을 가지는 유전자의 분포가 지 역마다 차이를 보인다는 사실은 이전 몇몇 연구에서 밝혀 졌다[15,16,20]. Stapleton 등의 연구에서 런던의 22개 구강 연쇄구균 균주에 대한 조사 결과 14균주(63.6%)에서 tet(M)이 발견되었다[15]. 스페인의 구강연쇄구균에서 테 트라사이클린에 대한 내성은 35%를 나타내었으며, 36개 테트라사이클린 내성 균주 중에 28균주(77.8%)에서 tet(M) 이 발견되었고, 2균주(5.6%)에서 tet(O)가 발견되었다[16]. 벨기에에서 분리된 157개 구강연쇄구균 중에서 테트라사 이클린에 내성을 보이는 균주는 114개로 나타났으며, 이 중에 105개(92.1%)의 균주에서 tet(M)이 나타났고 2개 (1.8%)의 균주에서 tet(O)가 발견되었으며, 하나의 균주에 서 두 개의 유전자가 함께 발견되었다[20].

한국인에서 분리된 구강연쇄구균을 대상으로 한 본 연구에서는 635개 균주 중 148개의 테트라사이클린 내 성 균주에서 tet(M)은 68개(45.9%)의 균주에서 발견되었 는데, 이는 런던의 63.6%나 스페인의 77.8% 그리고 벨 기에의 92.1%보다 낮은 빈도였다. tet(O) 유전자는 본 연 구에서 2.0%가 발견되었고 스페인과 벨기에에서 각각 5.6%, 1.8%가 발견된 것과 같이 낮은 빈도를 나타냈다.

본 실험에 사용한 9개의 종(species)에 해당하는 구강연 쇄구균 중 S. constellatus와 S. intermedius를 제외한 모든 균주에서 tet(M)을 확인할 수 있었다. 조사한 균주 중에서 S. oralis 42개와 S. mitis 37개가 테트라사이클린에 내성을 보였으며, tet(M)의 관찰 비율이 각각의 세균에서 52.4%와 45.9%로 나타났다. S. anginosus와 S. sanguinis 에서 tet(M) 의 발견 비율은 각각 32%와 60%로 나타났다.

테트라사이클린에 내성을 보이는 균주 중에서 tet(M) 혹은 tet(O)를 지니지 않는 77개 균주에 대한 내성기전 은 아직 불확실하다. tet(M)과 tet(O) 이외의 테트라사이 클린 내성 유전자가 이들 77개의 균주에 존재할 가능성 이 있으나 이들 세균종의 테트라사이클린에 대한 내성 기전은 추가 연구를 통하여 밝혀져야 할 것이다.

한국의 전반적인 항생제 내성율은 증가하고 있지만 [21-23], 본 연구 결과 테트라사이클린에 대한 한국에서 분리된 구강연쇄구균의 내성율은 23.3%로 스페인의 35% 나[16], 벨기에의 72.6%[20]보다 낮은 것을 확인하였다. 이러한 차이점이 생기는 원인은 본 실험에서는 치태에서 분리한 세균을 대상으로 하였고, 스페인에서는 혈액배양 세균을 대상으로 하였으며, 벨기에에서는 구강 인두에서 채취한 세균을 대상으로 한 것도 이유 중의 하나일 것으 로 생각된다.

종합적으로, 한국인 치태에서 분리된 구강연쇄구균의 테트라사이클린에 대한 내성 빈도와 tet(M)의 발견비율은 영국, 스페인, 벨기에 등 다른 나라보다 낮았고, tet(O)의 발견 비율은 유사하게 관찰되었다.

본 연구를 통하여 얻은 항생제 내성 유전자에 대한 실 험 결과는 세균의 항생제 내성 기작에 대한 이해를 높여 새로운 항생제의 개발에 도움을 줄 수 있을 것이며, 세균 종간 항생제 내성의 확산 경로를 파악하는데 유용한 정보 를 제공할 것이다.