서 론

성공적인 치근관 치료는 치근관 내 미생물의 수를 감 소시키는 것에 의해 좌우되는데, 치근관에 감염된 미생 물과 그 부산물을 효과적으로 제거하지 못한다면 증상 이 지속되고 치유에 방해가 될 수 있기 때문이다[1,2]. 따라서 치근관 내 미생물들을 제거하기 위해서는 항균 능력이 좋은 근관세척제의 사용이 중요하고[3], 현재 사 용되고 있는 대표적인 근관세척제로는 1~5.25% NaOCl (차아염소산나트륨)과 0.2~2% Chlorhexidine digluconate (클로르헥시딘) 등이 있다[4].

차아염소산나트륨은 1936년 Walker [5]에 의해 소개된 이후 치수조직 용해[6] 및 강력한 항균효과[7]로 현재까 지 가장 많이 사용되고 있는 근관세척제다. 그러나 차아 염소산나트륨은 염소 이온에 의한 기구 부식[8], 고농도 사용 시 괴사된 조직뿐만 아니라 생활 조직까지 용해시 키는 단점을 가지며[9], 치근단공을 통해 인접 주위조직 으로 빠져나가게 되면 심각한 조직 괴사나 동통, 부종, 감각이상 등이 올 수 있다[10].

클로르헥시딘은 대표적인 구강 항균용액으로 최근 근 관세척제 및 구강소독제 목적으로도 광범위하게 사용되 고 있다. 클로르헥시딘은 차아염소산나트륨과 비슷한 항 균효과를 가지면서 차아염소산나트륨에 저항을 보이는 세균에도 효과가 있는 것으로 보인다[11]. 그러나 클로 르헥시딘은 괴사된 조직을 용해시킬 수 없고[12], 장기 간 사용 시 치아나 보철물에 변색을 일으키며, 미각이상 및 구강점막의 작열감 등이 나타날 수 있다[13,14]

치근관 치료에 실패한 치아에서는 주로 1 ~ 2개 종류 의 그람 양성균이 나타나는데, 그 중에서도 Enterococcus faecalis가 가장 많이 발견되고 있다[15]. E. faecalis는 장 내세균으로 다양한 신체 부위에서 기회감염을 유발할 수 있다[16]. 구강 내에서는 위장관으로 이동하는 과정 중 일시적으로 나타나는데, 통상의 치근관 치료법에 의 해서 제거되지 못하고 살아남거나 치료과정 중 치근관 내로 침투한 경우 치근관 치료의 실패를 일으키는 것으 로 추정되는 세균 종이다[15,17]. E. faecalis는 2% 클로 르헥시딘이나 5.25% 차아염소산나트륨만으로는 완전하 게 제거하기 힘들다고 보고되었다[18].

Propionibacterium acnes는 그람 양성 혐기성 세균이며 감염된 치근관에서 치근관 치료 전·후로 검출됨이 보고 되었다[19]. 만성 치근단 치주염 병소를 갖는 20명의 환 자에서 분류된 세균 종 중 12명(16.2%)에서 검출되어 가 장 높은 빈도를 보였고[20], 치근단 치주염 증상이 없는 건전한 치근관을 2.5% 차아염소산나트륨으로 치근관세 척한 후 세균 종의 검출빈도를 비교한 경우에도 37%로 P. acnes가 가장 높게 검출되었다[21]. 이와 같이 구강 내에서 P. acnes가 자주 검출되는 것은 Streptococcus sanguinis와 같이 초기에 부착된 미생물과 함께 공동응 집 되어 biofilm을 형성하기 때문이라고 보고 있다[20].

따라서 성공적인 치근관 치료를 위해서는 치근관 감 염균에 대해 높은 항균효과를 지니면서 장기간 사용하 더라도 부작용이나 내성이 없는 안전한 항균 물질의 개 발이 필요하다. 최근 구강병 예방 및 치료보조제로 사용 할 목적으로 항생제나 부작용이 많은 화학합성 항균제 를 대체할 천연물에 대한 연구가 다양하게 진행되고 있 다[22-25]. 사포닌 유도체인 Oleanolic acid (3β -3-hydroxyolean-12-en-28-oic acid, OA)와 ursolic acid ((3 β)-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid, UA)는 항균 작용뿐만 아 니라 항염증 효과를 갖고 있는 것으로 보고되었다 [26-33]. 특히, OA와 UA는 세포독성이 적고 구강 내 그 람 양성 세균에 대한 항균력이 뛰어나고 치주질환 및 치근단 질환의 원인균종인 Porphyromonas gingivalis에 항균능이 있다고 보고되었다[29,33]. 최근 고삼에서 추출된 Sophoraflavanone G ((2S)-2-(2,4-dihydroxyphenyl)-5, 7-dihydroxy-8-[(2R)-5-methyl-2-(prop-1-en-2-yl)hex-4-en-1-yl]-2,3 -dihydro-4H-chromen-4-one)가 구강 내 그람음성 및 그람 양성 세균 종에 대한 항균능이 뛰어남이 보고되었다 [33,34].

그러므로 본 연구는 기존에 그람양성 세균에 항균능 이 우수하다고 보고된 OA, UA 및 sophoraflavanone G의 치근관 감염 병소에서 검출되는 E. faecalis와 P. acnes 균종에 대한 항균능을 알아보기 위하여 실시하였다. 본 연구 결과는 향후 이들 화합물을 이용한 치근관 치료 시 이용되는 근관세척제 개발에 기초적인 자료를 제공 할 수 있을 것으로 생각된다.

재료 및 방법

세균 및 배양

본 연구에서 사용한 E. faecalis KCTC 3206^T, E. faecalis KCOM 5289 (ChDC YE1), E. faecalis KCOM 5290 (ChDC YE2), E. faecalis KCTC 2011, E. faecalis KCTC 3195, P. acnes KCOM 1315 (ChDC KB81), P. acnes KCOM 1861 (ChDC B594), P. acnes KCOM 1466 (ChDC B638), P. acnes KCOM 1542 (ChDC B715) 균주 들은 한국구강미생물자원은행(KCOM, Korean Collection for Oral Microbiology, Gwangju, Korea) 또는 한국생명공 학연구원 생명자원센터(KCTC, Korean Collection for Type Culture, Daejeon, Korea)에서 분양 받아 사용하였다.

분양 받은 E. faecalis 균주들은 Todd Hewitt broth (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) 배지 에 접종해서 37°C, 10% CO₂ 세균 배양기로 배양하였다. P. acnes 균주들은 tryptic soy broth (Becton, Dickinson and Company)에 0.5% yeast extract, 0.05% cysteine HCl-H₂O, 0.5 mg/ml hemin 및 2 µg/ml vitamin K1가 포함된 배지에 접종하여, 37°C anaerobic chamber (Bactron I, Sheldon Manufacturing Inc., Cornelius, OR, USA)와 혐기성 조건 (10% H2, 5% CO₂, 85% N2)에서 배양하였다.

Minimum inhibitory concentration (MIC) 값 측정

MIC 값 측정은 NCCLS standard [35]에 따라 미세희석 (micro-dilution) 법을 이용하여 실시하였다. 세균들은 선 택배지를 이용하여 37°C 에서 24 시간 동안 세균배양기 에서 배양한 후 1×10⁶ CFU/ml가 되도록 희석하여 96-well plate에 분주하였다. OA (Sigma, St Louise, MO, USA)와 UA (Sigma)는 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 µg/ml가 되 도록, sophoraflavanone G는 0.5, 1, 2, 4, 8 µg/ml가 되도 록, 세균 배양액에 첨가(세균배양액의 1%가 되도록 첨 가)하였다. 본 연구에서 사용한 sophoraflavanone G는 선 행연구[34]에서와 동일한 방법으로 추출하여 사용하였 다. 이들 세 가지 화합물은 모두 dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma)에 녹여 사용하였다. 실험의 음성대조군 은 DMSO를 세균배양액의 1%가 되도록 첨가하였고, 양 성대조군은 100 mg/ml ampicillin (Sigma)를 세균배양액 의 1%가 되도록 첨가하였다. 이들을 96-well plate에 200 µl씩 분주한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 실험 군 및 대조군은 모두 3반복씩 실험하였다. 분주한 세균 배양액은 37°C 에서 24 시간 동안 세균배양기에서 배양 한 후 96-well plate상에서 육안으로 확인하였을 때 세균 성장이 없는 well의 농도 중 최소 농도를 MIC 값으로 결정하였다.

Sophoraflavanone G의 세포 생존율 평가

MIC 측정에 사용된 sophoraflavanone G의 농도 값을 참고하여, 0.5, 1, 2, 4, 8 µg/ml의 sophoraflavanone G 농 도에 따른 KB 세포주의 생존율을 MTT (3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a tetrazole) 분석법을 통하여 측정하였다. KB 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, Minimum Essential Medium (MEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)에 10% fetal bovine serum (PAA Laboratories, Etobicoke, Ontario, Canada), 100 U/ml penicillin과 100 µg/ml streptomycin (Gibco)이 혼합된 세포배양액을 이용하여 37°C에서 5% CO₂.가 첨가되고, 100% 습도가 유지되는 세포 배양기에 서 배양하였다. 24-well의 세포 배양접시에 분주된 세포 에서 배양액을 제거하고 각 농도의 sophoraflavanone G (세포 배양액의 1%가 되도록 첨가) 및 DMSO가 1% 함 유된 세포 배양액 1 ml씩(음성대조군)을 각각의 well에 분주하였다. 이들 세포들은 전술한 세포배양조건에서 24 시간 동안 배양 후 기존의 세포 배양액을 모두 제거하 고, 10% MTT 용액이 첨가된 배지를 각 well의 세포에 500 µl씩 첨가하여 전술한 세포배양 조건에서 3 시간 동안 배양시켰다. 그 후 반응액을 제거하고, Isopropanol (Sigma)을 각 well에 300 µl씩 첨가하여 형성된 formazan 결정을 용해시켜 배양접시를 잘 흔든 후 96-well에 200 µl씩 분주하여 파장 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 실험군 및 대조군은 각각 3 well씩 배당하였고, 이 를 독립적으로 3회 반복 시행하였다.

결과

E. faecalis 5 균주와 P. acnes 4 균주들에 대한 OA, UA 및 sophoraflavanone G 들의 항균능을 MIC 값으로 측정하였다(Table 1). E. faecalis KCTC 3206T과 E. faecalis KCOM 5289는 OA 및 UA에 대한 MIC 값은 다 른 균주보다 높은 농도인 64 µg/ml로 동일하게 나타났 고, sophoraflavanone G에 대한 E. faecalis 균주들의 항균 능은 E. faecalis KCOM 5290을 제외하고, 모두 8 µg/ml 에서 감수성을 보였다. P. acnes 균주의 OA에 대한 MIC 값은 P. acnes KCOM 1315와 P. acnes KCOM 1861은 32 µg/ml, P. acnes KCOM 1466과 P. acnes KCOM 1542 는 16 µg/ml로 나타났고, UA의 MIC 값은 OA보다 4배 정도 낮은 4~8 µg/ml 농도에서 세균성장 억제 효과를 보였으며, P. acnes 4 균주에 대한 sophoraflavanone G의 MIC 값은 모두 1 µg/ml로 나타났다(Table 1).

Sophoraflavanone G의 KB 세포주 생존에 미치는 영향 을 알아보기 위해 MTT 분석법을 실시한 결과 순수한 세포 배양 용액만을 이용한 대조군에 비해 최고 농도인 8 µg/ml에서 91.1%의 세포생존율을 보였다(Fig. 1).

고찰

본 연구는 치근관 치료 시 기존의 근관세척제로 완전 히 제거가 어렵거나 세균감염성 질환에서 빈번히 검출되 는 E. faecalis와 P. acnes에 대한 OA, UA 및 sophoraflavanone G의 항균력을 조사하기 위하여 시행하 였다. 연구 결과 OA, UA 및 sophoraflavanone G는 E. faecalis와 P. acnes 균주에 대하여 각각 16~64 µg/ml, 4~64 µg/ml 및 1~8 µg/ml 범위의 MIC 값을 보였다(Table 1). 선행연구 결과에 의하면, OA 및 UA는 치아우식증의 주요 원인균인 mutans streptococci 59 균주들에 대해서도 각각 4~8 µg/ml 및 2~4 µg/ml의 MIC 값을 갖는 것으로 조사되었다[31,32]. 치주질환의 발병 및 진행 또는 치주 치료 예후와 밀접한 연관성이 있는 P. gingivalis ATCC 33277^T 및 Prevotella intermedia ATCC 25611^T 균주에 대 해서도 16 µg/ml 및 64 µg/ml의 MIC 값을 갖는 것으로 보고되었다[33]. Sophoraflavanone G도 16균주의 mutans streptococi에 대해서 0.5~4 µg/ml 범위의 MIC 값을 갖고, 치주질환 원인균인 P. gingivalis ATCC 33277^T 및 P. intermedia ATCC 25611T에 대한 MIC 값도 1 µg/ml과 0.5 µg/ml로 OA 및 UA보다 항균능이 우수한 것으로 보 고되었다[33,36]. 이들의 결과에 의하면, OA, UA 및 sophoraflavanone G는 E. faecalis와 P. acnes 뿐만 아니라 치아우식증 및 치주질환 원인균종에 대해서도 항균력이 뛰어남을 알 수 있었다.

구강 내 세균 감염성질환을 예방 및 치료보조제로 사 용하기 위해서는 원인균종에 대한 항균력뿐만 아니라 구강조직 세포에 대한 세균 독성도 적어야 한다. 본 연 구 결과 Sophoraflavanone G는 E. faecalis와 P. acnes에 대한 최대의 항균력을 8 µg/ml에서 KB 세포주에 대해 세포생존율 91.1%로 조사되어 세포 독성이 거의 없는 것으로 조사되었다(Fig. 1). 또한, Sophoraflavanone G는 8 µg/ml 농도 이하에서 사람 정상 섬유모세포에 대해서도 세포 독성이 없는 것으로 보고되었다[34]. 일반적으로 OA는 UA보다 항균력은 떨어지지만, 세포에 대한 독성 은 매우 적은 것으로 보고되었다[31,32]. 선행 연구에 의 하면, OA는 32 µg/ml 농도에서 KB 세포주에 대하여 94.5%의 세균생존율을 보였지만[31], UA는 32 µg/ml 농 도에서 약 50%의 세균생존율을 보였다[32]. 이러한 결과 에 의하면, 사포닌 유도체인 OA 및 UA보다는 sophoraflavanone G가 KB 세포주에 대한 세포 독성이 적 기 때문에 임상에 우선적으로 적용할 수 있을 것으로 생각되며, 차 후 세포독성실험 결과에 따라 OA도 사용 가능할 것으로 생각된다.

이상의 결과에 의하면 OA, UA 및 sophoraflavanone G 는 치근관 감염병소에서 검출된 E. faecalis와 P. acnes에 우수한 항균효과를 가지며, 특히, sophoraflavanone G는 KB 세포주에 대한 세포 독성이 거의 없어 근관세척제 개발에 사용할 수 있을 것으로 생각된다.