서론

인체는 생명체의 구조적․기능적 기본단위인 세포로 이 루어져 있으며 각 세포마다의 성장특징으로 신생과 사 멸을 반복하고 있는데, 그 중에서도 평생 동안 재형성되 는 골조직과 같은 세포들이 있는 반면 한번 형성되면 다시 생기지 않는 치아의 법랑질 같은 세포들도 있다 [1]. 인체의 각 세포와 조직들이 성장하는 양식이 다르 며 각 세포들의 성장하고 사멸하기까지의 과정이 점차 밝혀지고 있으나, 아직까지 설명하지 못하고 있는 부분 도 많이 존재한다[2-3].

골의 재형성 과정은 기존의 뼈가 새로운 뼈로 전환되 는 골 생성 과정으로, 이러한 과정은 증식, 분화 및 세 포외 기질의 석회화유도 등의 단계를 거쳐 진행되며, 일 반적으로 골 형성과 흡수 과정은 조골세포(osteoblast)와 파골세포(osteoclast)의 상호작용에 의해 균형을 이루면서 뼈의 건강을 유지한다[1]. 그러나 이러한 조골세포와 파 골세포의 불균형이 생기면 골다공증과 같은 대사성 골 관련 질환이 유발될 수 있다[4-7]. 고령화 사회로 접어들 면서, 노년층 특히 여성에서 여성호르몬 저하에 의한 골 다공증 발병 문제가 더욱 부각되고 있다[4,8]. 골다공증 예방 및 치료에 사용되는 치료제는 대부분 골흡수를 억 제하는 작용을 하기 때문에 진행성 골소실은 완전히 회 복할 수 없어, 골다공증의 발생을 완전히 예방할 수 없 는 것이 현실이며, 따라서 골다공증의 예방과 치료를 위 한 골형성 증가에 관련된 몇 종류 천연물의 효능을 근 거로 다양한 천연물들의 골조직 재생능력에 미치는 영 향 등에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다[9-13].

골형성은 여러 단계의 분자생물학적 과정에 의하여 이루어지며, 골 관련 유전자들의 발현에 의하여 조절된 다[1,3]. 골형성 과정의 초기에 교원질이 침착되어 세포 외 기질을 형성한 후, 비교원성 단백질을 침착시키고 수 산화인회석으로 석회화된다[1,3]. 이 과정에 관여하는 유 전자는 세포외 β-glycerophosphate를 분리하는 alkaline phosphatase(ALP), 석회화를 개시하는 bone sialoprotein (BSP), 교원질 교차결합을 유도하는 procollagenlysyl hydroxylase-2(PLOD-2), 석회화 결절형성을 조절하는 osteonectin(ON), osteocalcin(OC) 및 osteopontin(OP) 등이 있다[1,3].

식물성 에스트로겐에는 isoflavone, coumestan, lignan 등이 있으며 이 중 isoflavone은 골대사와 관련하여 활발 히 연구가 진행 중인 대표적인 식물성 에스트로겐이다 [9,14]. 접골목(Sambucus sieboldiana)은 인동과 딱총나무 속에 속하고 산지의 습지 및 골짜기에 자라는 갈잎떨기 나무이며, 약용식물로 알려져 있다[15]. 그 종류로는 딱 총나무, 넓은잎 딱총나무, 털지렁구나무, 지렁쿠나무, 엘 더베리 및 덧나무 등이 있으며, 모두 접골목으로 사용할 수 있다[15]. 접골목은 풍습성관절염, 요통, 골절상 및 외상 출혈에 유효하다고 알려져 있다[16,17]. 또한 산후 의 어혈제거 및 타박상, 혈액순환 촉진, 타박상에 의한 부종 및 동통, 두드러기, 피부 가려움증에 쓰이며, 골절 유합 촉진에 현저한 반응을 나타낸다고 알려져 민간요 법으로 널리 사용되고 있다[16,17]. 그러나 접골목의 직 접적인 골유도 여부에 관해서는 아직 정확히 알려져 있 지 않으며, 골을 형성하는 데 중요한 요소인 조골세포의 증식과 분화과정에서 접골목의 생물학적 기능도 명확하 게 밝혀지지 않았다.

따라서 본 연구에서는 조골세포로서 생쥐 두개관 조골 세포주 MC3T3-E1의 증식과 분화과정에서 접골목에 의한 세포주의 특성변화를 분석하여, 골결손 질환의 치료 및 예 방을 위한 천연물 소재개발의 토대를 제공하고자 하였다.

재료 및 방법

실험재료

생쥐 두 개관 조골세포주 MC3T3-E1은 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입 하여 실험에 이용하였다. M-MLV reverse transcriptase와 RNasin® plus RNAse inhibitor 및 dNTP는 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하였으며, AccuPower® PCR premix는 Bioneer(대전, 대한민국)에서 구입하여 사용하 였다. 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide(MTT)는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하 였으며, TRI reagent kit는 Molecular Research Center, Inc.(Cincinnati, OH, USA)에서 구입하여 사용하였다. Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Green qRT-PCR master mix는 Agilent Technologies(Santa Clara, CA, USA)에서 구입하 였으며, Von kossa 염색을 위한 silver staining kit acc. to Von kossa와 nuclear fast red-aluminum sulfate solution은 Merck KGaA(Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하 였다.

접골목 에탄올 추출

건조된 접골목(Sambucus sieboldiana)을 Jeonnam Herbal Medicine Farmer's Cooperative(전남, 대한민국)에서 구입하 여, 흐르는 물을 이용하여 불순물을 제거한 다음 분쇄하 였다. 분쇄한 후 10배의 95% 에탄올을 이용하여 실온에 서 24시간 동안 침지하여 추출하였다. 추출물은 Advantec No. 2 여과지를 이용하여 여과한 후, rotary evaporator (N-1000V-W, Eyela, Japan)를 이용하여 감압 농축하였다. 농축된 추출물을 -40 °C에서 3일 동안 동결건조 하였으 며, 2°C에서 보관하였다. 접골목 추출물은 dimethyl sulfoxide에 녹인 후, 배지에 희석하여 실험의 시료로 사용 하였다.

세포배양

생쥐 두개관 조골세포주 MC3T3-E1은 10% fetal bovine serum(FBS, Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) 및 항생제(100u/ml penicillinm, 100µg/ml streptomysin)가 함 유된 37°C의 alpha-minimum essential medium(α-MEM, Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) 성장배지 하에서 배 양하면서 실험에 이용하였다. 세포분화와 석회화유도를 위하여 세포가 배양접시에서 충만하게 자란 후, 동일배지 에 ascorbic acid(50μℓ/ml)와 β-glycerophosphate(10mM)를 첨 가하여 배양하였다[18,19].

MTT 분석에 의한 세포증식 측정

접골목에 의한 생쥐 두개관 조골세포주 MC3T3-E1의 세포증식 효과를 관찰하기 위해, 24well plate에 4 x 10⁴ cells/well의 MC3T3-E1 세포를 접종하였으며, 37°C의 CO₂ 배양기에서 24시간 배양한 후 새로운 배양배지로 교체하였다. 접골목 추출물 1 ~ 300µg/ml을 첨가하여 24 시간 동안 배양하였으며, 세포증식 효과를 MTT 분석으 로 측정하였다. MTT 분석은 접골목 추출물을 처리한 MC3T3-E1 세포에 MTT 용액(MTT 최종농도 0.5μg/μℓ)을 37°C에서 4시간 처리한 후, MTT 용액을 제거하고 0.04N HCl이 함유된 isopropanol로 녹여내어 570nm에서 흡광도를 측정하여 시행하였다[20].

Von kossa 염색을 통한 골기질 형성 분석

조골세포주 MC3T3-E1의 석회화 결절을 확인하기 위 하여 Von kossa 염색을 시행하였다. 분화유도를 위하여 ascorbic acid(50μℓ/ml)와 β- glycerophosphate(10mM)를 첨가 하고, 접골목 추출물을 처리한 각 실험군의 MC3T3-E1 세 포를 PBS로 3회 세척한 후, 70% ethanol을 이용하여 10 분간 고정하였다. 증류수로 세척한 후, 5% AgNO3를 처 리하여 30분간 암실에 보관하였으며, 증류수를 이용하여 수회 세척하였다. 각 실험군의 MC3T3-E1 세포주에 자 외선을 15분간 조사한 후, NaHCO₃/formalin 완충액에 7 분간 반응시켰으며, 5% Na₂S₂O₃로 여분의 AgNO₃를 중 화시켰다. 각 실험군에 nuclear fast red 색소를 5분간 반 응시켰으며, 증류수를 이용하여 수회 세척한 후 색의 변 화를 관찰하였다. MC3T3-E1 세포주의 분화유무를 확인 하여 위하여 분화배지를 포함하지 않은 대조군을 함께 관찰하였다.

역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 분석

접골목 추출물을 처리하고 세포분화와 석회화가 유도 된 각 실험군의 MC3T3-E1 세포주에서 TRI reagent kit(Molecular Research Center, Inc., Ohio, USA)를 이용하 여 total RNA를 추출한 후, 자외선 분광기(UV spectrometer)를 이용하여 260㎚에서 흡광도를 측정, 추출 된 RNA의 농도를 계산하였다. cDNA를 합성하기 위하여 5μg의 total RNA를 reverse-transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)와 oligo(dT) primer를 이용하여 42°C에서 60분간 역전사 반응을 시행하였다. 합성된 cDNA를 alkaline phosphatase(ALP), osteonectin(ON) 및 osteocalcin(OC) 등의 primer(Table 1)를 primer 고안 프로그램(http://sg.idtdna.com) 을 이용하여 제작한 후, 중합효소연쇄반응(PCR)을 시행하 였다. PCR 반응 조건은 94°C에서 5분, 변성(denaturation) 반응을 94°C에서 15초, 결합(annealing)반응을 50~55 °C에 서 30초, 중합(extension)반응을 72°C에서 30초간 30주기를 반복하고, 마지막 중합반응은 72°C에서 10분간 연장하여 반응시켰다. 각 primer의 T_m 값을 고려하여 ON과 GAPDH 의 결합반응 온도는 55°C, ALP와 OC의 결합반응 온도는 50°C로 시행하였다. RT-PCR 후 1.5% agarose gel에서 전 기영동하여 각각의 PCR product를 확인하였다.

정량 PCR 분석

세포분화와 석회화가 유도된 각 실험군의 MC3T3-E1 세포주에서 OC의 mRNA 발현을 정량 PCR 분석으로 재 확인하였다. Brilliant Ⅲ Ultra-Fast SYBR® Green qRTPCR master mix(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 cDNA 1μg, 2X SYBR Green master mix 10μℓ, 각 primer 1μℓ, 100mM DTT 0.2μℓ 및 RT/ RNase block 1μℓ를 혼합한 후, 전체 부피가 20μℓ가 되도 록 DEPC를 처리한 물로 적정하였다. ExicyclerTM 96(Bioneer co., Daejeon, Korea)을 이용하여 95°C에서 15 분간 반응시킨 후, 94°C에서 15초, 55°C에서 30초, 70°C 에서 30초를 45회 반복하여 반응시켰다. 정량 PCR 결과 를 qcalculator 1.0 program(Institute of Pharmacology & Toxicology, University of Bonn, Bonn, Germany)을 이용 하여 Ct 값에 따른 mRNA양을 정량적으로 계산하여 분 석하였다. 정량을 위한 내부 대조군(internal control)으로 는 GAPDH를 이용하였으며, 정량 PCR 분석에 사용한 OC primer sequence는 RT-PCR에서의 경우와 동일한 것 을 사용하였다.

실험자료의 통계학적 검정

모든 실험성적은 최소 3회의 실험을 반복하여 mean ± SEM으로 나타내었고, 각 실험군 간의 유의성 검정은 Excel과 SPSS 프로그램을 이용하여 ANOVA 후에 Dunnett test를 하였으며, p value가 0.05 미만(p<0.05)의 경우에서 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

결과

접골목 추출물에 의한 MC3T3-E1 세포주 증식 효과

생쥐 두개관 조골세포주 MC3T3-E1 세포주에서 접골 목 추출물의 생존 및 증식에 미치는 효과를 알아보기 위해 MTT 분석을 실시하였다. 접골목 추출물 1~300µ g/ml을 24시간 처리한 결과, 접골목 추출물은 MC3T3-E1 세포주의 증식에 영향을 주지 않았으나, 가장 고농도인 300µg/ml에서는 MC3T3-E1 세포주의 증식을 약간 감소 시키는 경향이 있었으나 통계적 유의성은 없었다(Fig. 1). 따라서 이후 본 연구에서는 접골목 추출물 100µg/ml 을 이용하여 MC3T3-E1 세포주 분화에 미치는 여러 가 지 효과를 조사하였다.

MC3T3-E1 분화과정에서 세포외 기질형성에 미치는 접골목의 효과

생쥐 조골세포주 MC3T3-E1의 세포외 기질형성에 미 치는 접골목의 효과를 확인하기 위하여, MC3T3-E1 세 포주 분화과정에서 접골목 추출물 100µg/ml을 처리한 후 무기질이 침착된 기질을 갈색으로 표현하는 Von kossa 염색을 시행하였으며, 분화유도를 위하여 ascorbic acid(50μℓ/ml)와 β-glycerophosphate(10mM)를 첨가하였다. 분화유도 10일째에서부터 대조군과 접골목 추출물 처리군 에서 세포외 기질형성이 일어나기 시작하였으며, 분화유도 15일째까지는 대조군과 접골목 추출물 처리군에서 세포 외 기질형성의 차이는 없었다(Fig. 2). 그러나 분화유도 20일째와 21일째는 대조군에 비해 접골목 추출물 처리 군에서 세포외 기질형성의 증가를 확인할 수 있었다 (Fig. 2).

조골세포주 분화과정에서 분화 특이유전자들의 발현 에 미치는 접골목의 효과

생쥐 조골세포주 MC3T3-E1에 ascorbic acid와 β-glycerophosphate를 첨가하여 석회화 결절의 형성을 유도한 배양과정에서 접골목의 효과를 분석하기 위해, MC3T3-E1 세포주 분화과정에서 접골목 추출물 100µg/m을 처리한 후 ALP, ON 및 OC 각각의 primer(Table 1)를 이용하여 RT-PCR을 시행하였다.

ALP mRNA의 발현은 MC3T3-E1 세포주의 분화유도 과정에서 증가하였다(Fig. 3). 대조군에서는 배양 7일째 에 배양 0일째보다 6.66배의 ALP mRNA 발현을 보이기 시작하였으며, 15일째에서는 4.82배, 20일째에서는 5.14 배의 ALP mRNA 발현을 관찰할 수 있었다(Fig. 3). 접 골목 추출물 처리군에서는 7일째에 배양 0일째보다 12.51배의 ALP mRNA 발현을 보였고, 15일째에서는 11.90배, 20일째에서는 10.73배의 ALP mRNA 발현을 관 찰할 수 있었으며, ALP mRNA의 발현이 대조군에 비해 약 2배 정도 증가함을 확인할 수 있었다. 본 연구에서 MC3T3-E1 세포주에서 분화를 유도한 후 ON mRNA의 발현이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 4). 대조군 에서 ON은 배양 7일째에서 배양 0일째보다 0.77배의 발 현을 보였으며, 15일째에서 0.78배, 20일째에서는 0.80배 로 발현이 감소하였다(Fig. 4). 접골목 추출물 처리군에 서는 배양 7일째에 배양 0일째보다 0.70배의 ON mRNA 발현을 보였고, 15일째에서 0.45배, 20일째에서는 0.12배 로 발현이 감소하여 분화유도 시간이 경과할수록 ON mRNA의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다. OC mRNA의 발현은 MC3T3-E1 세포주의 화유도 과정에 서 증가하였다(Fig. 5). 대조군에서는 배양 7일째에 배양 0일째보다 1.21배의 OC mRNA 발현을 보이기 시작하였 으며, 15일째에서는 1.25배, 20일째에서는 1.18배의 OC mRNA 발현을 관찰할 수 있었다(Fig. 5). 접골목 추출물 처리군에서는 7일째에 배양 0일째보다 2.20배의 OC mRNA 발현을 보였고, 15일째에서는 1.95배, 20일째에서 는 1.52배의 OC mRNA 발현을 관찰할 수 있었으며, OC mRNA의 발현이 배양 7일째에는 대조군에 비해 약 2배 정도 증가함을 확인할 수 있었다.

조골세포주 분화과정에서 정량 PCR에 의한 분화 특이 유전자들의 발현분석

세포분화와 석회화가 유도된 각 실험군의 MC3T3-E1 세포주에서 OC의 mRNA 발현을 정량 PCR 분석으로 재 확인하기 위해, MC3T3-E1 세포주 분화과정에서 접골목 추출물 100 μg/m을 처리한 후 OC primer를 이용하여 정 량 PCR을 시행하였다. RT-PCR 결과에서 OC mRNA의 발현이 가장 많았으며 대조군과 가장 차이가 컸던 배양 7일째에서의 정량 PCR 결과, OC mRNA는 대조군에 비 해 접골목 추출물 처리군에서 그 발현이 2.10배 증가하 였으며(Fig. 6), 정량 PCR에 의한 mRNA 발현분석 결과 는 RT-PCR 분석결과와 일치함을 확인할 수 있었다.

고찰

골을 형성하는 데 관여하는 세포는 조골세포와 파골 세포로서, 이 두 세포에 의하여 골 형상이 유지되고 대 사되며[1], 조골세포와 파골세포에 의해 새로운 골이 형 성되고, 오래된 골은 분해되는 동적인 대사조직으로 두 세포간의 적절한 활성에 의해서 진행된다[2]. 골조직은 주로 수산화인회석(hydroxyapatite)의 결정구조와 아교질, 조골세포에 관여하는 비아교질성 단백질인 오스테오칼 신, 세포와 골기질 간의 결합을 촉진하는 단백질인 오스 테오폰틴, 골기질을 이루는 구조성 단백질인 시알로단백 질 및 프로테오글리칸을 포함한 다양한 종류의 세포외 기질 단백질로 구성되어 있다[1,3].

골다공증은 조골세포에서의 골형성 관련 국소인자의 발현저하 및 파골세포에 의한 골흡수 작용의 상대적인 증가에 의해 골밀도가 낮아지는 질환이다[4-7]. 노화과정 에서 파골세포 작용의 증가로 인하여 골다공증의 발병 율이 증가하며, 특히 여성의 경우 폐경 이후에 에스트로 겐 분비감소에 의해 골밀도의 감소 현상이 더욱 심하여 골다공증에 대한 발병률이 남성보다 현저히 높은 것으 로 알려져 있어, 이에 대한 연구가 매우 활발히 진행되 고 있다[4-7]. 최근 들어 골다공증 치료를 위한 에스트로 겐 투여의 여러 부작용을 보완하기 위해, 한약재 및 식 품 등 천연물의 활성성분을 이용한 대체 요법의 연구가 활발히 진행되고 있으며[9-13], 골다공증 예방과 치료를 위한 대체요법으로 식물성 에스트로겐(phytoestrogen)의 경구투여 또는 이를 다양 함유하고 있는 식품의 섭취가 시도되고 있다[14]. 접골목(Sambucus sieboldiana)은 인동 과 딱총나무속에 속하는 갈잎떨기나무이다[15]. 접골목 은 풍습성관절염, 요통, 골절상 및 외상 출혈에 유효하 다고 알려져 있으며, 특히 골절 유합 촉진에 현저한 반 응을 나타낸다고 알려져 있음에도 불구하고, 조골세포의 증식과 분화과정에서 접골목의 분자생물학적 기전은 아 직까지 명확히 밝혀져 있지 않다[16-17]. 따라서 본 연구 에서는 조골세포의 증식 및 분화과정에서 접골목의 효 과를 밝히기 위해, 생쥐 두개관 조골세포주 MC3T3-E1 에서 분화유도와 접골목 추출물을 처리한 후, MC3T3-E1 세포주의 특성변화를 분석하였다.

조골세포주 MC3T3-E1 세포주에서 접골목 추출물의 생 존 및 증식에 미치는 효과를 알아보기 위한 MTT 분석 결 과, 본 연구에서 시험한 농도(1~300µg/ml)의 접골목 추출 물은 MC3T3-E1 세포주의 증식에 영향을 주지 않았다(Fig. 1). 성장호르몬(growth hormone, GH), insulin like growth factor-I(IGF-I) 및 transforming growth factor-β(TGF-β) 등은 조골세포의 증식을 촉진하여 뼈의 성장을 촉진하는 성장 인자들로 알려져 있으며[21,22], platelet derived growth factor(PDGF)와 fibroblast growth factor (FGF) 같은 성장인 자들은 뼈의 세포외 기질에 저장되어 골의 미세환경에서 조상세포들(progenitors)의 증식을 촉진하는 국소기전을 제 공한다고 알려져 있다[21-23]. 한편 bone morphogenic protein(BMP)의 골 유도효과(osteoinductive effect)는 매우 다양하여 BMP의 아형이나 골조상세포의 표현형에 따라 각각 그 기능이 다르게 나타난다[24]. 본 연구에서 접골목 추출물은 MC3T3-E1 세포주의 증식에 영향을 주지 않았으 며, 이 결과는 접골목 추출물이 조골세포의 성장과 증식에 는 영향을 주지 않음을 시사한다.

본 연구에서 분화중인 조골세포주 MC3T3-E1의 세포 외 기질형성에 미치는 접골목의 효과를 확인하기 위하 여, MC3T3-E1 세포주 분화과정에서 접골목 추출물을 처리한 후 무기질이 침착된 기질을 갈색으로 표현하는 Von kossa 염색을 시행하였다. 분화유도 10일째에서부터 대조군과 접골목 추출물 처리군에서 석회화 결절형성이 일 어나기 시작하였으며, 분화유도 20일째와 21일째는 대조 군에 비해 접골목 추출물 처리군에서 석회화 결절의 증 가를 확인할 수 있었다(Fig. 2). 본 연구의 결과는 접골 목 추출물이 조골세포주 MC3T3-E1의 성장과 증식에는 영향을 주지 않으면서, 분화유도 과정에서 조골세포주의 분화를 직접적으로 촉진시킬 수 있음을 시사하고 있다. MC3T3-E1 세포주의 분화과정에서 조골세포 활성을 알 아보는 표지자로 ALP의 활성을 측정함으로서 접골목 추 출물의 조골세포 활성에 미치는 영향을 관찰한 결과, ALP mRNA의 발현은 MC3T3-E1 세포주의 분화유도 과정 에서 증가하였으며, 접골목 추출물은 ALP mRNA의 발현 을 더욱 증가시켰다(Fig. 3). 특히 분화유도 초기인 분화 7 일째에 ALP mRNA의 발현이 가장 많았다. ALP는 골조직 에서 골성장이 활발할 때 그 활성이 더욱 증가한다는 선 행연구들[25,26]의 결과를 보아, 본 연구에서 접골목 추출 물이 조골세포 분화과정 중에서 골결절 형성의 초기에 도 움을 줄 것으로 예상되며, 증가된 ALP 합성은 세포외 기 질에 calcium phosphate를 침착시켜 골형성 역할을 함으로 써 석회화를 유도하여 조골세포의 분화와 성숙에 중요기 능을 담당할 것으로 생각된다[25,26].

본 연구에서 MC3T3-E1 세포주 분화과정에서 ON mRNA의 발현이 감소하였으며, 특히 접골목 추출물 처 리군에서는 석회화 결절이 형성되면서 ON mRNA의 발 현이 더욱 감소하였다(Fig. 4). ON은 비교원성 성분으로 세포와 세포외 기질과의 상호작용을 조절하고 세포외 기질과 부착을 억제하는 당단백질로 알려져 있으며, 성 장인자 활동성의 조절기능과 세포주기 억제 기능이 있 다고 알려져 있다[27-29]. 본 연구에서 ON mRNA 발현 이 감소하는 결과는 MC3T3-E1 세포주의 분화과정에서 접골목은 세포외 기질과 부착을 억제하는 당단백질인 ON mRNA의 발현을 감소시켜 석회화 결절 형성을 촉 진시킴을 시사한다.

OC mRNA의 발현은 RT-PCR(Fig. 5)과 정량 PCR(Fig. 6) 결과에서 MC3T3-E1 세포주 분화유도 과정 중 증가하 였으며, 접골목 추출물은 OC mRNA의 발현을 더욱 증가 시켰으나, ALP에 비교해서는 크게 증가하지 않았다. 특 히 ALP의 경우에서와 유사하게 분화유도 초기인 분화 7 일째에 OC mRNA의 발현이 가장 많았다. OC는 골형성 의 생화학적 표지자로서 조골세포에서 합성되며, 비교원 성 단백질로 혈중 농도가 골형성 여부를 확인할 수 있는 요소이다[30]. 또한 OC는 골이나 상아질 및 석회화된 연 골에서 발현되는 특이적인 유전자로서, OC의 발현은 골 이 석회화되어 결절을 형성하는 시기와 일치하며, 이는 석회화를 촉진시키는 요인으로 작용한다[31,32]. 본 연구 의 결과로 보아 접골목 추출물은 조골세포 분화과정 중 골결절 형성의 초기에 도움을 줄 것으로 예상되며, 증가 된 OC는 조골세포 석회화를 촉진시키는 요인으로 작용 할 것으로 생각된다. 그러나 조골세포 분화의 분자적인 기 전과 접골목 추출물의 효과에 대한 세포 및 분자적 기전연 구는 더 추구하여야 할 과제로 생각된다.

결론적으로, 본 연구의 결과로 생쥐 두개관 조골세포 주 MC3T3-E1 세포주 분화과정에서 접골목 추출물이 조 골세포 분화를 촉진시킬 수 있음을 알 수 있었다. 또한 본 실험의 결과로, 골결손 질환 및 골재생에 관한 하나 의 연구방향을 제시할 수 있을 것으로 사료된다.