서론

살모넬라균은 사람을 포함하는 많은 동물에서 경증의 위장관염에서 부터 장티푸스 열(Typhoid fever) 및 패혈증 등 심각한 질병을 일으킬 수 있고, 숙주세포 내부에서 기 생 능력이 있는 병원균(intracellular pathogen)이다. 살모넬 라균의 종명은 Salmonella enterica 이며, 주로 장관계와 관 련되는 살모넬라증(salmonellosis)을 일으킨다[5]. 세 가지 의 대표적인 혈청형(serovar)이 주요한 병원균으로서, Typhi 혈청형(Salmonella enterica serovar Typhi, 혹은 줄여 서 S. Typhi 로 표기)은 사람에 장티푸스 열을 일으키며, Enteritidis 혈청형(S. Enteritidis)은 인체 및 동물에 위장관 염을 일으키고, 특히 가금류에 심각한 주요 식중독 균이 다. 마지막으로, Typhimurium 혈청형(S. Typhimurium)은 쥐 에서 장티푸스 유사 열병을 일으키고 사람엔 덜 심각한 위 장관염을 일으킨다[2]. S. Typhimurium과 실험용 쥐를 이용 한 살모넬라 병원성 연구는 살모넬라균이 일으키는 살모 넬라증의 기전을 밝히고 있으며, 더불어 숙주세포 내 기생 능력이 있는 병원균의 병원성을 이해하는데 큰 기여를 하 고 있다.

살모넬라균의 숙주세포 내 기생능력은 이 세균의 병독 성을 결정하는데 아주 중요하여, 특히 장 상피세포를 침입 한 후 만나는 대식세포(macrophage)에 포식된 후, 이 안에 서 대식세포가 생산하는 많은 종류의 항생물질에 대해 적 응 하거나 혹은 내성을 갖는 능력은 이 세균의 질병 유발 능력과 높은 상관관계가 있다[3]. 실제로 대식세포 내에서 생존하지 못하는 대부분의 S. Typhimurium 돌연변이주들 은 쥐에 대한 병독성이 제한적이다. 대식세포 내에서 생존 할 수 있는 살모넬라균은 대식세포를 따라 이동하여 숙주 동물 내 다른 표적 기관으로 퍼져나갈 수 있다[3].

대식세포에서 생산하는 항생 물질 중 살모넬라균의 생 존과 번식을 제어하는 대표적인 물질로 알려진 것은 반응 성 산소화합물들인 활성 산소종(reactive oxygen species) 혹 은 활성 질소종(reactive nitrogen species)들로서 대식세포 내 phagosome 막에 위치한 NADPH oxidase (Phox)가 생산 하는 superoxide (O₂^-.) 및 inducible nitric oxide synthase (iNOS)가 생산하는 nitric oxide (NO)에 의해 생화학적으로 파생된다[4,5]. 이들의 표적은 세균세포 내 핵산, 지질, 단 백질등 다양하며, DNA및 단백질을 직접 훼손하거나, 특히 철(Fe) 이온과 같이 전자전달이 가능한 효소 보조인자등에 반응하여 세균세포 내 산화환원 반응들에 관여함으로써 많은 세균 대사를 비정상적으로 변화시킬 수 있다[5].

살모넬라를 포함하는 숙주세포 내 병원균들은 대부분 이러한 활성 산소/질소 종들을 해독할 수 있는 효소들을 갖고 있는데, superoxide dismutase, catalase/peroxidase 등은 활성산소종 O₂^-.와 H₂O₂를 각각 해독할 수 있으며, flavohemoglobin Hmp 는 NO를 해독할 수 있다[6-8]. 이들 효소의 유전자가 결손된 살모넬라균은 대식세포 내 생존 률이 현저히 저하되고, 쥐에서 병독성을 보이지 못한다 [7-9]. 이 해독 효소들의 중요성은 다른 많은 병원성 세균 에서도 입증이 되고 있어, 병원균의 병독성 발현 과정중 숙주세포가 생산하는 활성 산소/질소 종들과 세균의 상호 작용이 매우 중요함을 보여준다[10,11].

활성 산소/질소 종들에 대한 세균의 유전체 반응을 조사 한 최근의 전사체 연구들은 위에서 언급한 해독효소들 유 전자외에도 수많은 유전자들의 새로운 발현이 이루어지고 있음을 보여주고 있는데, 이것은 이들의 높은 반응성 특성 때문에 기존 해독 효소들 외에도 세균세포 훼손을 최소화 할 수 있는 많은 복구 시스템들이 필요함을 보여준다 [12-14].

이들 활성 산소/질소 종들에 의한 단백질 훼손은 DnaK, DnaJ, GroELS 등의 많은 종류의 세포질 내 chaperone 단백 질들이 복구할 수 있고, 이들 유전자가 결손된 돌연변이주 는 산화적 스트레스에 민감하며, 병독성 또한 감소하는 것 으로 알려졌다[15-17].

최근 연구에서 세균 세포질 외부의 단백질 구조 안정화 에 특이적이고 필수적인 것으로 밝혀진 새로운 chaperone 단백질 Spy가 알려졌는데[18], 활성 산소/질소 종들에 대 한 세균의 내성에서 이 단백질의 역할은 아직 알려진 바 없다. 본 연구에서는 그 가능성을 조사하였다.

재료 및 방법

사용 균주 및 균주 배양 조건

본 연구에서는 야생형 균주로 Salmonella enterica serover Typhimurium 14028s (Chromosome RefSeq: NC_016856.1)를 사용하였으며, 이 균주를 상대로 유전자 돌연변이를 제조하 였다. 본 연구에서 사용한 균주들은 Table 1.에 명시하였다. 균주를 배양하는 배지로는 Luria‐Bertani (LB; Difco) 영양 배지와 0.2% glucose를 포함하는 E 최소배지(1.66 mM MgSO₄, 9.5 mM citric acid monohydrate, 57 mM K₂HPO₄, 16.7 mM NaNH₃PO₄)를 사용하였다. 사용한 모든 균주는 37°C, 220 rpm 조건의 진탕 배양기에서 배양하여 사용하였으며, 필요시 항생제는 chloramphenicol(50 μg/ml; CM)과 kanamycin (50 μg/ml; KM) 을 배지에 넣어 사용하였다. 특별히 표기한 경우를 제외하고는 모든 화학제품은 Sigma‐Aldrich사로 부터 구입하였다.

활성 산소종과 활성 질소종에 대한 세균의 민감도 측정

활성 질소종과 활성 산소종을 첨가하였을 때 세균의 성 장곡선을 비교함으로써 돌연변이주들의 민감도를 확인하 였다. 활성 산소종은 H₂O₂ (Samchun chemical, Korea)를 매 번 신선하게 첨가하여 사용하였고, 활성 질소종은 산화질 소 공여체인 S‐nitrosoglutathione (GSNO)를 사용하였는데, glutathione와 Sodium nitrite를 사용하여 합성하였다. 하루 동안 LB 배지에서 키운 균주를 PBS (Phosphate Buffered Saline)에 희석하여 O.D_600nm 값을 1로 맞춘 후, H₂O₂와 GSNO가 농도별로 첨가된 배지가 분주된 Microplate에 개 시 O.D_600nm 값이 0.01이 되도록 희석하여 접종하였다. Bioscreen C Microbiology Microplate Reader (Oy Growth Curves Ab Ltd) 를 이용하여 37°C에 24시간 동안 교반하며 30분에 한 번씩 O.D_600nm값으로 측정하였다.

spy 결손 돌연변이주 제조

spy 유전자 결손 살모넬라 돌연변이주를 만들기 위해 Datsenko와 Wanner[19]의 방법을 사용하였다. 5‐gttgcctcta ccctggcgat gggtgctgcg aatctcgctc gtgtaggctgg agctgcttc‐3과 5‐ ttccgtcaga cgcttctcaa aattagcgtt atattgcttt catatgaata tcctccttag‐3 로 제작된 60mer의 primer들을 이용하여 chloramphenicol cassette를 가지는 pKD3 플라스미드를 주형가닥으로 PCR 을 하여 증폭시켰다. 증폭된 PCR 생산물은 제한효소인 DpnI을 처리하고 λ‐Red 재조합 효소(pTP223)를 발현시킨 균주에 형질전환 시킨 후 chlorampenicol을 포함한 LB 영 양배지에 키워 항생제를 가지는 군락을 선별하였다. 선별 한 군락은 P22 파아지를 통해 신선한 야생형균주에 형질 도입하였다. spy 유전자의 외부 DNA에 해당하는 primer인 5‐ttaatcacga caacacggcg‐3과 5‐ag gacggctata gaattctctg‐3 이용 하여 PCR을 수행하였고 이 PCR로 chrorampenicol 카세트 의 삽입을 확인하여 최종 선별하였다.

RNA추출 및 quantitative real-time reverse transcrition (RT) PCR

LB 영양배지에서 24 시간 배양한 균주를 E 최소배지 (0.2% glucose)에 1:500희석 비율로 접종하여 O.D_600nm에서 0.5 값이 될 때까지 배양한 후 배양액의 절반내 세균을 회 수하였다. 나머지 절반은 GSNO (1mM)를 1시간 처리하거 나, H₂O₂ (1mM) 를 30분간 더 처리한 후 세균을 회수하였 다. 회수한 균주에는 5% phenol (95% EtOH)을 1:5 비율로 첨가하고 얼음에서 20분간 처리하여, 세균 전사 (transcription)를 정지시키고, 10분 간 원심분리(4°C, 4000 rpm) 하여 배양균주를 얻었다. 배양균주에 lysozyme (10 mg/ml)을 포함하는 TE buffer [10 mM Tris‐HCl, 1 mM EDTA (ethylene diamine tetra acetic acid); pH 8.0]를 처리하 여 37°C에서 10분에 한 번씩 교반하며 30분간 반응 시켰 다. RNA는 RNAiso Plus (TaKaRa)를 이용하여 추출한 후, DNase 를 이용하여 잔여 DNA를 제거 한 후, 전기영동 및 UV spectrophotometry를 통하여 DNA의 잔류여부를 확인 하였다. Quantitative real-time RT PCR은 2ug의 RNA를 이 용하여 annealing 온도 57°C; 40 cycle 조건으로 QuantiTect SYBR Green RT‐PCR kit (Qiagen)를 이용하여 반응시켰으 며, 그 산물은 RotoGene thermocycler (Qiagen)를 이용하여 분석하였다. 시료간 RNA 발현 표준화를 위해 살모넬라균 에서 항상 같은 발현 양을 보이는 housekeeping 유전자 gyrB 를 사용하였다. spy mRNA 농도측정을 위해 사용된 primer는 5‐caaatgaaac gtccgctgct‐3과 5‐tttcgtaatt tgcgcttcgg‐3 을 이용하였는데, spy 유전자의 개시코돈으로부터 각각 300 bp, 425 bp 뒤쪽에 위치하는 염기서열에 해당한다.

결과

세균 주변세포질내 공간(periplasmic space)에 존재하는 많은 단백질들의 안정화에 기여할것으로 예상되는 단백질 인 Spy가 살모넬라균의 활성산소종과 활성질소종에 대한 내성에서 어느정도의 역할을 담당하는지 알아보기 위해 Spy가 결손된 spy 유전자 돌연변이주의 제조 및 돌연변이 주의 활성 산소/질소 종들에 대한 민감도를 측정하였으며, 또한 활성 산소/질소 종들에 대한 살모넬라균의 반응과정 동안 spy 유전자의 발현 정도를 측정하였다.

살모넬라균 염색체의 경우 spy 유전자는 1388541번째 염 기부터 1389042번째 염기까지 501bp의 염기를 가진다. 재 료 및 방법에서 기술한 파아지 λ Red recombinase를 이용한 단일 단계 유전자 돌연변이 방법을 사용하여, spy 유전자를 결손시켰다. spy 유전자의 N‐말단 부위 300 bp가 결손되 고 그 자리에 약 1 kbp 크기의 chlorampenicol cassette를 삽 입하였다. 그 결과를 확인하기 위해 spy 유전자를 포함하는 외부 DNA primer를 이용하여 PCR을 시행하였다. PCR결 과, 그 크기가 야생형균주는 850 bp이며 spy 결손 돌연변이 주는 약 1.6 kbp의 PCR 산물을 생산하는 것을 확인하였다 (Fig. 1). 이 결과는 spy가 결핍된 살모넬라 돌연변이주가 정 상적으로 만들어졌음을 보여준다.

spy 돌연변이주의 활성 질소종에 대한 성장률을 확인하 기 위해 E 최소배지(0.2% glucose)에 GSNO를 농도별로 처 리하여 성장곡선을 측정하였다. 실험 대조군으로 세균내 부 산화질소를 대부분 해독하는 효소인 Flavohemoglobin Hmp가 결핍된 돌연변이주를 사용하였다. Hmp가 결여된 hmp 돌연변이주의 경우 NO를 해독하지 못하므로 GSNO 가 첨가된 배지에서 성장이 억제되는 것을 확인할 수 있 다. spy 돌연변이주의 경우 야생형균주과 비교하였을 때 대수기에서 정지기로 들어가는 시간이 한 시간 가량 지연 되는 것으로 보아 GSNO에 비교적 민감한 것으로 볼 수 있다(Fig. 2A).

활성 산소종에 대한 성장률을 확인하기 위해 LB 영양배 지에 H₂O₂ 를 농도별로 첨가하여 성장곡선을 측정하였다. 실험 대조군으로는 살모넬라균의 활성 산소종에 대한 내 성과 관련된 것으로 확인된 시그마인자인 RpoS가 결여된 rpoS 유전자 돌연변이주를 사용하였다. RpoS는 superoxide dismutase 및 catalse등의 효소 유전자 발현을 활성화시킨다 [20]. rpoS 돌연변이주의 경우 적은 농도의 H₂O₂에도 성장 이 제한되는 것을 볼 수 있으나, 야생형 균주와 spy 돌연변 이주는 그 성장률이 같은 것으로 확인되어, spy 돌연변이 주의 활성 산소종에 대한 민감성은 거의 없는 것으로 확인 되었다(Fig. 2B).

DnaK와 DnaJ 등의 세균 세포질 내 chaperone 단백질들 은 살모넬라균이 대식세포에 포식되었을 때 그 발현이 크 게 증가하며, 살모넬라 병독성에 필수적이다[17,21]. 활성 산소/질소 종들에 대한 살모넬라균의 반응과정 동안 Spy 의 발현 변화를 조사하기 위해 각 스트레스에 노출된 살모 넬라균의 spy mRNA의 발현량을 측정하였다. Fig. 3에 나 타낸 real-time RT PCR 결과는 야생형 균주와 각 스트레스 에 민감한 돌연변이주들에서 상이한 spy 전사 발현 패턴을 보인다. spy mRNA의 발현량은 야생형 균주에서는 각 스 트레스 노출 유무와 관계없이 일정한 반면, 산화질소를 분 해하지 못하는 hmp 돌연변이주가 GSNO에 노출되면 약 5 배 정도 증가하였으며, 활성 산소종에 민감한 rpoS 돌연변 이주가 H₂O₂ 에 노출되면 5‐6배 정도 증가하였다(Fig. 3). 주목할 점은 H₂O₂ 에 노출되지 않은 조건에서 rpoS 돌연변 이주내 spy 전사가 야생형에 비해 감소한다는 점인데, 이 것은 spy 전사가 일정 부분 RpoS에 의존적임을 보여준다.

고찰

리보좀에서 일어나는 번역(translation) 과정 동안 새로이 합성된 초기 폴리펩타이드(polypeptide)는 세포질, 세포막, 혹은 세포막 외부로 이동하여 고유의 기능을 하게 되는데, 이 과정에서 여러 종류의 chaperone 단백질들의 도움을 받 아 기능을 하게 되며, 그렇지 못한 단백질은 단백분해효소 에 의해 분해된다[22,23].

숙주 면역체계는 다양한 항미생물 성분을 분비하며, 그 중 많은 성분들이 세균 단백질의 구조를 훼손할 수 있다. 대부분의 세균들은 단백질의 활성을 복구할 수 있는 chaperone 기능의 단백질들을 생산하고 있으며, 스트레스 환경에 노출되면 그 발현이 크게 증가하여[24,25], 세균 병 원성 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 알려지고 있다 [26]. 특히 세균세포 외부 혹은 숙주 세포내로 다양한 병원 성 효과 단백질(effector protein)을 분비하는 과정은 다양한 chaperone 단백질들의 역할이 필수적이다[27]. 따라서 그람 음성균의 주변세포질(periplasm)을 포함하는 세포질외부 (extracytoplasm)로의 단백질들의 발현 및 분비는 병독성 세균의 병원성 발현에 필수적인데, 세포질외부에 노출되 는 다양한 스트레스에 대해 적응하기 위해 세균은 필요 단 백질들의 발현 조절과 항상성을 유지할 수 있는 체계를 갖 추고 있는 것으로 알려졌다[25]. 이 단백질들의 구조적 안 정성에 많은 chaperone 단백질들이 참여할 것으로 예상되 고 있다.

Spy 단백질의 존재는 대장균(Escherichia coli)이 spheroplast 를 형성할 때 세포질에는 존재하지 않고 오직 주변세포질 내에서만 위치하는 단백질로 소개되면서 알려졌다[28]. 그 람음성 세균이 숙주세포 내 환경에서 만나는 여러 항미생물 성분 중에는 세균의 spheroplast 형성을 유도할 수 있는 성분 들이 존재하기 때문에, 이러한 스트레스에 반응하여 발현되 는 Spy의 기능은 전체 세포질 외부 단백질 항상성과 관계가 있을 것으로 예상되어 왔다. 이후 대장균을 상대로한 계속 된 연구에서 Spy의 발현이 실제로 세균 외막(envelope) 스트 레스 반응에 활성화 되는 Cpx 조절 시스템과 금속이온 스트 레스에 반응하는 또 다른 세균 외막 항상성 조절 시스템 BaeSR을 필요로 한다는 사실이 알려졌다[29,30]. 살모넬라 균의 주변세포질과 외막의 스트레스에 반응하여 신호전달 및 항상성에 기여하는 분자적 시스템은 크게 다섯 가지가 알려졌는데, 대체시그마 인자 RpoE, BaeSR. CpxRA, Rcs 인 산전달(phosphorelay) 시스템, 파아지 쇼크(phage shock) 반 응 시스템 등이다[25]. Spy의 발현이 BaeSR과 CpxRA에 의 존한다는 사실은 Spy의 위치가 주변세포질에 국한된다는 발견과 함께 Spy의 기능이 외막 스트레스에 대한 주변세포 질 항상성에 기여할 수 있다는 사실을 암시해 왔다. Spy의 기능이 세포질 외부 단백질의 구조 안정화에 기여한다는 최근 발견은, 기존에 알려진 세균 주변세포질 chaperone 단 백질들과 함께 세균 고유의(진핵세포의 경우는 아직 확실하 게 발견되지 않고 있음) 생존 전략에서 세포질 외부 분비 단백질들의 중요성을 보여준다[18].

본 연구를 통해, 살모넬라균의 활성 산소/질소 종에 대 한 내성에서 Spy의 결손 효과는 거의 없는 것으로 확인되 었다. 다만, spy 유전자의 발현이 세균세포 내에 활성 산소 종 혹은 활성 질소종 들이 많이 축적되는 rpoS 혹은 hmp 돌연변이주들에서 괄목할 정도로 증가된다는 발견은, 실 제 표현형으로 나타나지 않았지만, Spy의 발현이 살모넬 라균의 활성 산소/질소 종에 대한 내성에서 일정 부분 역 할을 할 수 있다는 가능성을 시사한다. 즉, Spy의 기능이 결여되어 있는 spy 돌연변이주 내의 다른 주변세포질 chaperone들의 역할이 이 스트레스들에 대한 단백질 항상 성을 유지하는데 충분하며, 이는 Spy를 포함하는 chaperone 단백질의 기능적인 과잉 현상일 가능성이 있다. 특히, 세 균세포 외막 스트레스에 반응하는 대체시그마 인자 RpoE 의 발현이 활성 산소종에 대한 살모넬라균의 내성에 필수 적이고, 이것은 또한 RpoS의 발현에 필요하다는 사실들을 비쳐 보았을 때[31,32], spy 유전자 전사가 일정부분 RpoS 에 의존한다는 본 연구결과는 Spy의 역할이 활성 산소종 내성과 관련될 가능성이 일부분 존재할 것으로 예상된다. rpoS 돌연변이주에서 Spy 발현이 H₂O₂에 의해 다시 야생 형 균주 정도로 증가되었는데(Fig. 3B), 이는 spy 유전자 발 현 유도과정에 대장균과 마찬가지로 Cpx 및 BaeSR 등 다 른 활성 조절자 단백질들이 관여하지만 RpoS가 존재하는 야생형 세균에서는 활성 산소종에 대한 세균 세포내 스트 레스가 적거나 아직 알 수 없는 조절자간의 조절과정을 통 해 큰 역할을 하지 못하는 것으로 생각된다. 향후 연구에 서 세균 주변세포질 내 chaperone으로 알려진 유전자들과 spy 유전자의 중복 돌연변이주들의 표현형을 조사하고, Spy 발현에 관여하는 조절체계가 밝혀진다면, Spy 기능의 근본적인 역할을 보다 자세하게 해석할 수 있을 것으로 판 단된다.