서론

활성산소종(reactive oxygen species; ROS)은 과산화수소 (H₂O₂), superoxide 음이온(O₂^∙-), 수산기(hydroxyl radical; ∙ OH), 산화질소(NO), 과산화질산염(peroxynitrite; ONOO^-)을 포함하는데 이중에서 NO, ONOO^-는 활성질소종(reactive nitrogen species; RNS)으로 따로 분류하기도 한다. 이들은 조직손상이나 증가된 유해반응과 관련되는데[1-4], 최근에 는 유전자 발현, 세포 분화와 증식 등 세포조절물질로서의 역할이 보고되고 있다[5-7]. 신경조직에서 ROS는 다양한 경로를 통해서 발생되는데 미토콘드리아의 전자전달계 (electron transport complex) 과정 중 superoxide(O₂^∙-)의 방출, 아라키돈산 산화과정에 의한 phospholipase A₂의 활성, xanthine dehydrogenase에서 xanthine oxidase(XO)로의 전환, NO synthease(NOS) 활성에 의한 NO 생성, NO와 O₂^∙-의 결 합에 의한 ONOO^-의 생성 등으로부터 얻어진다[8,9].

최근에 ROS가 통증발생에 관여된다는 연구가 보고되었 는데 H₂O₂의 피하투여에 의해 통증을 유발하였고[10], 항 산화제의 투여로 수 시간동안 지속되는 진통효과가 나타 남이 보고되었다[11]. 또한 척수신경을 결찰하여 신경병증 성 통증을 유발시킨 흰쥐와[12] 피부 내 capsaicin 투여로 통증을 유발시킨 생쥐에서[13] 척수후각 뉴론의 미토콘드 리아에서 O₂^∙-가 증가됨이 관찰되었고, 척수에 전자전달계 억제제 투여에 의해 O₂^∙-의 증가와 통증 행동반응의 증가 를 나타냈는데[9], 이는 척수후각 뉴론에서 발생된 O₂^∙-가 통증을 발생시키는데 중요한 발생원이며 그것의 감소가 통증을 억제시키는 요인이라고 생각할 수 있다.

이에 반하여 RNS의 한 종류인 NO의 통증에 대한 역할 은 확실치 않으며, 통증 유발효과와 진통효과가 같이 보고 되어 있다. 예를 들면, 신경손상이나 조직염증에 의해 유 발된 과민성은 NOS 억제제의 척수 내 투여나 nNOS 유전 자를 제거한 생쥐에서 감소하였으며[14-16], 척수세포에서 발생된 NOS가 만성통증 발생에 중요하게 작용한다고[17] 보고되었다. 반면에 다른 연구에서는 L-arginine과 NO donor인 3-morpholinosydnomimine (SIN-1)을 같이 뇌실에 투여하거나[18], sodium nitroprusside (SNP)를 발바닥에 주 입하여 진통효과를 유발함이 보고되었다[19].

ROS의 일종인 H₂O₂가 어떻게 세포에 작용하여 효과를 나타내는지에 대한 연구는 많이 보고되었다. Transient receptor potential (TRP) 통로를 활성화하여 탈분극을 유발 하거나[20], ATP 민감성 K⁺ (K_ATP) 통로의 열림을 자극하 여 과분극을 유발하기도 한다[21]. 척수의 아교질 세포에 서는 H₂O₂가 미세억제성 시냅스후 전류의 빈도를 증가시 킨다고 하였고[22], H₂O₂와 유사한 tert-buthyl hydroperoxide (t-BuOOH)는 흥분성 시냅스후 전류를 증가시키고 탈분극 을 유발하였다[23].

NO는 guanylyl cyclase를 활성화하여 세포내 cGMP를 증 가시켜 반응을 나타내거나, S-nitration에 의해서 직접적으 로 세포막 단백질에 작용하기도 한다[24]. O₂^∙-가 세포에 어 떤 기전으로 작용하는지는 아직 잘 알려져 있지 않았으나 PKA, PKC, extracellular signal-related kinase (ERK) 등의 단 백질 인산화효소를 활성화하거나[25], Cl^- 통로를 통과하여 세포내부에서 이차적인 신호전달과정에 참여한다고 보고 되었다[26].

따라서 이 연구에서는 ROS의 한 종류인 O₂^∙-와 대표적 RNS인 NO가 통증전달에 1차적 중계역할을 하는 척수후 각 세포에 어떻게 작용하여 통증을 조절할 수 있는지 확인 하고자 척수후각 세포의 흥분성에 대한 X/XO와 SNP의 효 과를 알아보았으며 시냅스 전, 혹은 후에 작용하는지, 세 포내 G 단백이 관여하는지, 세포막 단백질에 직접 작용하 는지 등을 patch clamp 방법으로 조사하였다.

재료 및 방법

척수절편 제작

생후 13일-18일 된 Sprague-Dawley 흰쥐를 암수 구별 없 이 사용하였으며, 이 연구는 원광대학교 동물실험 윤리위 원회에서 승인을 얻었다(WKU09-076). 흰쥐를 ether로 마 취한 후 20% urethane (2 ml/Kg)을 복강 내 투여하였다. 흉 추에서부터 천추까지 척추제거술(laminectomy)을 하여 척 수를 노출한 후 요천수 팽대부(lumbosacral enlargement)에 서 1 cm 정도 길이의 척수를 절단하였다. 조직절편기 (vibratome 752M, Campden, 영국)의 고정대에 agar block을 먼저 고정한 후 순간접착제를 이용하여 척수절편을 고정 하였다. 95% O₂-5% CO₂를 공급하면서 두께 150-350 μm의 척수절편을 얻었는데, 절단 중 계속 온도 조절기(model 765, Campden, 영국)를 이용하여 용액의 온도를 1-2 °C 정 도로 낮게 유지 시켰다. 척수절편은 32 °C의 인공 뇌척수 액 용액에 1시간 정도 보관하여 정상상태로 회복시켰고, 이후에 실온에서 실험을 시행하였다. 기록은 척수절편을 현미경(BX50WI, Olympus, 일본) 위의 기록용기(1 mℓ)에 옮 긴 후 치실로 만든 그물로 움직이지 않도록 고정한 후 시 행하였고, 실험기간 동안 계속해서 95% O₂-5% CO₂가 포 함된 용액을 관류펌프(Minipuls 3, Gilson, 프랑스)를 이용 하여 관류시켰다(2-3 mℓ/min).

실험용액

척수절편 제작에 사용했던 절단용액의 조성(mM)은 252 Sucrose, 2.5 KCl, 0.1 CaCl₂, 2 MgCl₂, 10 glucose, 26 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO₄ 등으로 구성되었으며, 막전압을 기 록하기 위한 세포외 용액의 조성은 117 NaCl, 3.6 KCl, 2.5 CaCl₂, 1.2 MgCl₂, 1.2 NaH₂PO₄, 25 NaHCO₃, 11 Glucose 이 었고 95% O₂-5% CO₂를 공급하여 pH를 7.4로 유지하였다. 세포내 용액은 150 K-Glu, 10 HEPES, 5 KCl, 0.1 EGTA, 5 MgATP, 0.3 Na GTP를 사용하였고, pH는 KOH를 첨가하 여 7.3으로 조정하였다. 시냅스 전도를 차단하기 위하여 세포외 Ca²⁺를 제거한 후 Mg²⁺로 교체하였고, CdCl₂ 0.5 mM, thapsigargin 1 μM을 추가하였다.

실험에 사용한 xanthine (X), XO, SNP, N-tert-butylnitrone (PBN), 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMPOL), guanosine 5’-[β-thio]diphosphate trilithium salt (GDP-β-S), n-ethylmaleimide (NEM), suramin, thapsigargin 등은 Sigma사 (미국)에서 구입하였고, S-nitroso- N- acetyl- DL- penicillamine (SNAP)는 Tocris사(미국)에서 구입하여 사용하였다. Thapsigargin 은 DMSO (dimethyl sulfoxide; Sigma)에 먼저 녹인 후 최종농 도로 세포외 용액에 희석하여 사용하였고, 그 외의 약물은 실험직전에 세포외 용액에 녹여 사용하였다. 세포에 대한 실험용액의 적용은 중력을 이용한 관류장치(BPS-4SG, Ala Scientific Instruments, 미국)를 이용하여 기록용기 내 용액을 교환하였다.

전기생리학적 기록방법

막전압의 기록은 whole cell patch clamp 방법을 사용하 였다. 미세 유리전극 제조기(PP-830, Narishige, 일본)와 microforge (MF-830, Narishige, 일본)를 이용하여 외경 1.5 mm의 연질 유리미세관(TW150-3, WPI, 미국)을 저항이 5-8 MΩ이 되도록 기록전극을 제작하였다. 10배의 대물렌즈로 다른 부위에 비해 밝은 띠를 형성하고 있는 척수후각 아교 질 부위를 확인한 후 전극에 양압을 가하면서 미세 전극조 절기(ROE-200, Sutter, 미국)를 이용하여 30° 경사를 유지 하면서 세포에 접근하였다. Seal test를 시행하면서 세포에 접근하여 피펫의 저항이 순간적으로 증가하는 것으로 세 포에 근접함을 확인한 후 양압을 풀고 음압을 가하여 세포 와의 gigaohm seal을 이루었다. Gigaohm seal을 이룬 후 10-20분 경과하여 막전압이 -45 mV 이하로 안정되었을 때 기록을 시작하였다. 전압 및 전류측정에는 Axopatch 200B 증폭기(Axon, 미국)를 사용하였고, 이 증폭기는 Digidata 1200B (Axon, 미국) AD변환기를 통하여 컴퓨터에 연결하 였으며, pCLAMP software (version 9.0, Axon, 미국)를 사용 하여 실험수행의 명령과 얻어진 전기신호의 저장 및 분석 에 이용하였다. 발생된 전류는 low pass 8-pole Bessel filter 로 2 kHz로 여과하였다. 모든 실험은 실온에서 시행하였다.

실험자료의 분석

막전압의 분석은 Clampfit (version 9.0, Axon, 미국)을 이 용하였다. 약물처리군 사이에 통계적으로 유의한 차이가 존재하는지의 여부는 independent t-test를 이용하였고, 한 세포에서 약물 전후의 차이는 paired t-test를 이용하였으며, p<0.05에서 통계적으로 유의하다고 판정하였다. 통계자료 의 값은 평균값±표준오차(mean±SEM)로 표시하였다.

연구성적

척수후각 세포의 흥분성에 대한 X/XO와 SNP의 효과

X/XO와 SNP 투여에 의해서 발생한 O₂^∙-와 NO가 척수 후각세포의 흥분성에 미치는 효과를 조사하기 위하여 patch clamp 방법을 이용하여 막전압을 기록하였다. Whole cell이 되었을 때 막전압이 -45 mV 이하로 안정된 세포만 을 결과분석에 이용하였다. 전류기록법을 이용하여 지속 적으로 막전압을 기록하면서 X 300 μM과 XO 30 mU을 섞 은 용액을 5분간 처리하였는데 약물 주입 후 1분 이내부터 3-15 mV의 크기의 탈분극이 관찰되었다(6.1±0.4 mV, n=15)(Fig. 1Aa).

SNP 처리에 의한 반응은 농도에 따라 상이하여 고농도 와 저농도의 두 가지로 분리하여 관찰하였다. 저농도 용액 (10 μM)을 처리하였을 때는 탈분극이 관찰되는 반면에 (4.8±0.4 mV, n=12)(Fig. 1Ab), 고농도 용액(1 mM)을 처리 하였을 때는 과분극이 관찰되었다(-6.8±0.5 mV, n=12)(Fig. 1Ac). 다른 NO donor인 SNAP 처리에 의해서는 농도를 변 화시켜도 탈분극만이 관찰되었는데 500 μM 투여에 의해 4.6±0.6 mV의 탈분극이 유발되었다(n=7)(Fig. 1Ad). X/XO, SNP, SNAP에 의한 막전압의 변화는 비선택성 항산화제인 PBN이 포함된 용액으로 관류시 단독으로 투여하였을 때 보다 유의하게 감소하였다(Fig. 1A).

비선택성 항산화제인 PBN, O₂^∙-에 작용하여 H₂O₂로 전 환시키는 SOD 유사물질 TEMPOL, NO에 선택적으로 작용 하여 항산화 작용을 하는 hemoglobin (Hb) 등을 각각 세포 내액에 포함시킨 후 X/XO와 SNP를 투여하였다. X/XO 투 여에 의한 탈분극은 세 가지 항산화제 모두에서 대조군과 차이가 없었다(Fig. 2A). SNP를 투여하였을 때는 고농도와 저농도 모두에서 PBN과 TEMPOL에 의해서 대조군과 차 이가 없었고(Fig. 2Ab, 2Ac), Hb 세포내액을 사용한 경우만 고농도와 저농도에서 각각 유의한 억제를 관찰하였다 (-10.2±0.8 mV vs. 1.7±0.9 mV, P<0.001; 4.9±0.3 mV vs. 1.6±1.2 mV, P<0.01)(Fig. 2Ad, B).

X/XO와 SNP에 의한 반응 기전

X/XO와 SNP의 반응이 시냅스 전 혹은 시냅스 후 뉴론 에 작용하는지를 알아보았다. 시냅스 전달을 차단하기 위 하여 세포외 용액에서 Ca²⁺를 제거하고 Mg²⁺를 증가시켰 으며 CdCl₂ 0.5 mM, thapsigargine 10 μM을 추가하였다. X/XO 투여에 의한 반응은 정상용액에 비해 유의하게 감 소하였고(7.7±1.5 mV vs. 3.1±1.3 mV, n=9, P<0.05)(Fig. 3Aa), SNP 투여에 의해서는 감소하는 경향이었으나 유의 하지 않았다(5.4±0.6 mV vs. 3.9±0.9 mV. n=8)(Fig. 3Ab).

X/XO와 SNP에 의한 반응이 G 단백과 연결된 신호전달 과정을 통해서 발생하는지를 확인하고자 G 단백 억제제인 GDP-β-S와 suramin을 세포내 용액에 첨가한 후 기록하였 다. X/XO 투여에 의한 탈분극은 두 가지 억제제 모두에서 대조군과 차이를 보이지 않았다. 그러나 고농도의 SNP에 의한 과분극은 GDP-β-S (-4.8±1.5 mV, n=9)와 suramin (-4.6±1.6 mV, n=8) 세포내액에 의해 유의하게 억제되었으 며, 저농도의 SNP에 의한 탈분극도 GDP-β-S (2.2±1.0 mV, n=9)와 suramin (-2.0±0.8 mV, n=8) 세포내액에 의해 유의 하게 억제되었다(Fig. 4).

X/XO와 SNP에 의한 반응이 세포막 단백질을 직접 산화 시킴에 의해 반응이 일어나는지를 확인하고자 alkylating agent인 NEM을 전처리한 후 결과를 비교하였다. X/XO 투 여에 의한 탈분극은 전처리에 의해서 변화를 보이지 않았 고(5.4±0.7 mV vs. 4.9±0.6 mV, n=5)(Fig. 5a), 저농도와 고 농도의 SNP 투여에 의한 반응은 각각 유의하게 감소하였 다(-4.2±0.8 mV vs. 1.0±1.2 mV, n=7, P<0.05; -6.3±0.9 mV vs. -3.4±1.1 mV, n=5, P<0.05)(Fig. 5b, c).

고찰

ROS는 조직손상이나 증가된 유해반응에 의하여 세포내 에서 증가하여 세포독성을 일으키고 세포죽음과 관련되 며, 전사인자 활성, 유전자 발현, 세포 분화와 증식 등 여 러 가지 생리적 기능을 조절하는 세포조절물질로서의 역 할도 보고되고 있다[6,27]. 또한 최근에는 ROS가 통증발생 에 관여되어 있다고 보고되고 있는데, 척수의 ROS 양이 감소함에 따라 통증행동 반응이 저하되었고[11,28], ROS 양이 많아짐에 따라 반응이 증가되었다[9,13]. 또한 superoxide dismutase[4], PBN[11], vitamin E[29]와 같은 다 양한 항산화제를 전신투여 혹은 척수 내로 투여함에 의해 진통효과를 가짐이 보고되었으며 이러한 결과는 척수의 활성산소가 통증의 발생과 전달에 중요하게 관여하고 있 음을 의미한다.

신경조직에서 ROS는 다양한 경로를 통해서 얻어지는데 미토콘드리아 세포호흡의 부산물로 형성되거나 nicotine adenine diphosphate, xanthine oxidase (XO), 아라키돈산 산 화효소, NO synthease 활성 등으로부터 만들어 진다[8]. 이 연구에서는 ROS를 발생시키기 위해 X와 XO를 혼합하여 투여하였는데 척수후각 뉴론에서 탈분극을 발생시켰다 (Fig. 1). XO는 X를 산화시켜 uric acid로 만드는 과정에서 superoxide 음이온(O₂^∙-)을 발생시키며 이것은 superoxide dismutase (SOD)에 의해 H₂O₂로 변환된다. Sato 등[30]과 Hawkins 등[26]은 X/XO 투여에 의해 약물투여 직후부터 O₂^∙-가 발생되기 시작하여 3분에서 최고치를, 5분정도 경과 하면 SOD에 의해 H₂O₂로 변환된다고 하였으며, Zhou 등 [31]도 X/XO 투여는 즉각적이고 일시적인 변화를 H₂O₂ 투 여는 느리고 지속적인 변화를 보인다고 하였다. 이 연구에 서도 X/XO의 투여는 약물 주입 후 1분 이내부터 즉각적인 탈분극을 유발하였으며 이는 이전에 보고한 H₂O₂ 투여에 의해 발생되는 작고 느린 탈분극과는 차이를 보였다[23]. 이 연구에서는 약물적용 시간을 5분으로 하였는데 이는 O₂^∙-가 SOD에 의해 H₂O₂로 전환되기 충분한 시간으로 X/XO의 투여효과는 O₂^∙- 외에 H₂O₂도 발생시켜 세포에 영 향을 미쳤을 가능성이 있다.

NO는 통증전달과정에서 농도 의존적으로 통증유발효 과와 진통효과를 가진다. 즉, Li와 Qi는 낮은 농도의 L-arginine을 척수 내 투여하여 포르말린으로 유발된 통증 반응을 억제하였고, 높은 농도에 의해서는 증가시켰다고 하였다[32]. 반면에, Kawabata는 낮은 농도의 L-arginine은 통증반응을 증가시키고 높은 농도에서는 억제시켰다고 상반된 결과를 보고하였다[33]. 세포외 기록법을 이용한 전기생리학적 연구에서도 Pehl과 Schmid는 NO가 서로 다 른 농도에서 척수신경을 흥분 혹은 억제시킨다고 보고하 였다[34]. 이 연구에서도 높은 농도(1 mM)의 SNP는 막전 압을 과분극 시켰으며 낮은 농도(10 μM)는 탈분극을 발 생시켰다(Fig. 1). SNP의 농도에 따른 서로 다른 반응이 유발됨에 따라 다른 종류의 NO donor인 SNAP의 처리로 NO의 작용을 확인한 결과 SNAP는 농도에 관계없이 탈분 극만을 발생시켰다. 그러나 이 연구에서는 SNP의 농도에 따른 반응의 차이만 관찰하였으므로 차후에 추가적으로 왜 농도에 따른 차이가 발생하는지, 또는 탈분극과 과분 극에 어떤 이온통로가 관여하는를 밝히는 연구가 필요하 다고 생각된다.

PBN은 “spin-trapping” 작용이 있는 질소화합물로 H2O2, O₂^∙-, ^∙OH, NO, ONOO^- 등의 다양한 ROS 형성을 억제한다 [35]. 이 연구에서도 PBN을 세포외 용액에 사용하였을 때 O₂^∙-와 NO의 작용을 비선택적으로 모두 억제시켰다(Fig. 1). 그러나 PBN을 세포내 용액에 사용하였을 때는 억제효 과가 나타나지 않아 O₂^∙-와 NO의 작용은 주로 시냅스전 세 포에 작용하였으리라 추측된다(Fig. 2).

TEMPOL은 SOD 유사물질로 O₂^∙-를 H₂O₂로 전환시킨다 [36]. TEMPOL을 세포내 용액에 포함시켜 막전압을 기록 하였을 때는 SNP에 의한 반응에는 영향을 주지 않았다. 그러나 O₂^∙-에 의한 탈분극은 초기에 억제되었으며 반응이 지연되어 나타났다. 즉, O₂^∙-에 의해 초반의 과분극과 이어 지는 후반의 느린 탈분극이 발생하여 이전의 H₂O₂를 투여 하였을 때의 반응과 유사하였으며[23], 이는 O₂^∙-의 효과라 기보다는 O₂^∙-에서 전환된 H₂O₂의 효과일 가능성을 배제할 수 없다. O₂^∙-는 인지질 이중층을 통과하는데 낮은 투과력 을 가지고 있고[37], 전하를 가지지 않는 안정상태인 H₂O₂ 로 빠른 dismutation을 보이기 때문에[38] 세포내 신호전달 물질로 작용하는 것은 어렵다고 여겨 왔다. 그러나 최근 O₂^∙-가 Cl^- 통로를 통과하여 세포내부로 빠르게 이동하여 이차적인 신호전달과정에 참여함이 보고되어[26,39], O₂^∙- 의 효과는 직접 세포에 작용하거나 혹은 H₂O₂로 전환되어 작용하는 두 가지 가능성을 모두 고려해야 한다.

PBN을 포함시킨 세포내 용액을 사용하여 X/XO와 SNP 에 의한 반응을 억제하지 못한 결과나(Fig. 2) 칼슘을 제거 하고 thapsigargin을 첨가한 세포외 용액에서 X/XO와 SNP 에 의한 반응이 억제된 결과는(Fig. 3) O₂^∙-와 NO의 작용이 주로 시냅스전에 작용함을 의미한다. 척수 아교질 세포에 서 신경전달물질의 분비는 시냅스전 축색말단의 칼슘농도 증가가 필요한데 이는 세포 밖으로부터 유입되거나 세포 내 칼슘저장소인 ER로부터의 방출에 의해 이루어진다 [22]. 그러나 세포내 칼슘저장소의 칼슘을 고갈시키는 작 용이 있는 thapsigargin의 사용은 시냅스 전 뿐만 아니라 시 냅스 후에도 작용하여 X/XO와 SNP에 의한 반응을 억제하 였을 가능성이 있다. Hawkins 등[26]은 O₂^∙-가 장시간 세포 신호전달 과정에 사용되기 위해서는 먼저 세포내 칼슘의 이동을 유도하고 미토콘드리아에서 칼슘을 매개로 O₂^∙-를 지속적으로 방출해야 한다고 하였는데 이 연구와 같이 thapsigargin의 사용은 세포내 칼슘 공급원을 고갈시켜 세 포내 칼슘농도의 증가를 억제시켜 반응의 감소를 유발할 수 있다.

NO는 직접적으로 통로단백질을 S-nitrosilation 시킴에 의해 세포반응을 유도하거나 간접적으로 guanylate cyclase (GC)를 활성화하여 세포내 cGMP를 증가시켜 작용을 나타 낸다. 즉, Kawano 등[40]은 NO가 S-nitrosilation에 의해 K_ATP 통로를 활성화 한다고 하였고, Sausa와 Prado [41]는 NO donor의 척수 내 투여 효과가 sGC 억제제인 ODQ에 의해 억제됨을 보고하였다. 이 연구에서는 X/XO와 SNP에 의한 반응의 G 단백 관련성을 세포내 용액에 G 단백 억제 제인 GDP-β-S와 suramin을 첨가하여 확인하였는데, SNP 의 효과는 억제되었으나 X/XO의 효과는 억제되지 않았다 (Fig. 4). 이는 H₂O₂와 같은 ROS도 G 단백의 α 소단위에 작 용하여 세포의 기능을 조절한다[42]는 보고와 다른 결과로 이 연구에 사용한 O₂^∙-는 H₂O₂에 비해 세포막 투과성이 현 저히 낮아 세포내 G 단백에 대한 영향이 낮았을 것으로 생각된다. 한편, suramin은 G 단백을 억제하는 효과 외에 주로 P2 수용체의 억제제로 이용되고 있으며 ROS는 다양 한 경로를 통하여 P2 수용체에 영향을 줄 수 있다고 보고 되어 있어[43] suramin의 SNP 반응 억제는 P2 수용체도 관여되었을 가능성을 배제할 수 없다. 또한 이 연구에서 세포막 단백질을 직접 산화시킴에 의해 반응이 일어나는 지를 확인하고자 alkylating agent인 NEM을 전처리하였을 때도 SNP의 효과는 억제되었으나 X/XO의 효과는 억제되 지 않았다(Fig. 5). 이는 X/XO에 의한 반응은 주로 시냅스 전 세포에 작용하여 G 단백을 이용하지 않는 세포내 기전 에 의해 발생하였으리라 생각된다.

요약하면 이 연구에서는 NO는 시냅스 전과 후 모두에 서 G 단백을 이용하거나 세포막 단백질을 직접 산화시켜 작용을 나타내고 O₂^∙-는 주로 시냅스전에 작용하여 G 단백 을 이용하지 않는 세포내 기전에 의해 작용을 나타냄을 확 인하였다. 이는 ROS와 RNS가 서로 다른 기전에 의해 척 수후각 아교질 세포의 흥분성을 조절함을 나타내며 차후 활성산소와 관련된 통증조절물질의 개발에 유용한 정보를 제공할 수 있을 것으로 생각된다.