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ISSN : 2287-6618(Online)
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The Transcription Factor Mist1 Regulates the Cellular Polarity in Mouse Pancreatic Acinar Cells
Mar 5, 2012
Mar 14, 2012
Mar 23, 2012
Abstract
Pancreatic acinar cells exhibit a polarity that is characterized by the localization of secretory granules at the apical membrane. However, the factors that regulate cellular polarity in these cells are not well understood. In this study, we investigated the effect of Mist1, a basic helix-loop-helix transcription factor, on the cellular architecture of pancreatic acinar cells. Mist1-null mice displayed secretory granules that were diffuse throughout the pancreatic acinar cells, from the apical to basolateral membranes, whereas Mist1 heterozygote mice showed apical localization of secretory granules. Deletion of the Mist1 gene decreased the expression of type 3 inositol 1,4,5-triphosphate receptors (IP3R) but did not affect apical localization and expression of IP3R2. Mist1- null mice also displayed an increase in luminal areas and an increase in the expression of zymogen granules in pancreatic acinar cells. These results suggest that Mist1 plays a critical role in polar localization of cellular organelles and in maintaining cellular architecture in mouse pancreatic acinar cells.
초록
서 론
췌장은 G-단백 결합 수용체들(G protein-coupled receptors, GPCRs)을 통한 칼슘 신호전달의 활성을 통하여 소화 효 소들을 분비하는 역할을 담당한다[1]. 비정상적인 효소의 분비는 섬유낭종(cystic fibrosis)이나 급성 췌장염과 같은 다양한 질환들을 유발할 수 있으며, 이전의 연구들은 이 러한 질환들이 비정상적인 칼슘 신호전달과 밀접한 관련 이 있다고 보고되고 있다[2,3]. 췌장을 포함한 외분비기 능을 담당하는 분비 선세포에서 나타나는 극성(polarity) 은 칼슘신호전달을 연구하는데 중요한 역할을 담당한다. 췌장 선세포에서 효현제를 이용하여 GPCRs를 자극함으로 써 세포 내 반복적인 칼슘 파동(Ca 2+ wave)을 유발하면 칼슘 파동은 세포의 첨단부(apical membrane)에서 기저부 (basal membrane)쪽으로 진행 되는 것을 확인할 수 있다 [4]. 이러한 칼슘의 파동은 첨단부 쪽에 위치한 칼슘신호 구조물들과 밀접한 관련이 있는 것으로 여겨지고 있다[5,6].
일반적으로 타액선과 같은 외분비선들은 선세포와 관세 포로 이루어져 있으며, 특히 선세포는 기저부의 조면 소 포체와 첨단부의 활면 소포체가 과도하게 분포되어 있는 전형적인 극성 상피세포의 모습을 지니고 있다. 또한, 기 저부 근처에 핵, 골지체, 분비과립과 세포내막 등이 분포 하고 있다[7]. 이러한 극성은 세포 내 소기관들과 단일 단 백들에게 까지 나타난다. 칼슘 신호전달 단백들은 칼슘 펌 프, 칼슘 수용체, GPCRs과 조절 단백들이 극성 발현되는 세포 간 밀착 결합부위(tight junction) 근처에 칼슘 신호 전달 복합체(Ca 2+ signaling complex)를 형성하는데, 이는 칼슘 파동의 생성과 진행에 꼭 필요한 과정이다[5-8]. 이 러한 칼슘 신호전달 과정에 대한 연구는 유사한 구조를 지니고 있는 췌장에서 보다 많은 연구가 이루어지고 있다.
외분비기능을 담당하는 선세포의 극성은 출생 이후에 완전히 성숙되어 나타나게 되는데, 이때 관여하는 것으로 여겨지는 전사인자가 PTF1-p48 (pancreatic transcription factor 1, 48 kD subunit)[9]과 Mist1[10]이다. PTF1-p48 과 Mist1은 모두 basic helix-loop-helix (bHLH) 단백 그 룹에 속한다. 이러한 단백들은 유전자의 조절부위에 있는 E-box DNA elements (CANNTG)에 결합하여 전사과정 의 조절자로서 기능을 하는 활성 이합체를 형성한다[11]. PTF1-p48 전사 인자는 소화효소의 작용을 담당하는 유전자의 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있으며, PTF1-p48 이 췌장의 발생에 중요한 역할을 담당한다[12]. 반면, Mist1 은 췌장이나 침샘과 같은 다양한 분비선들에 있는 장막 선세포에 특이적으로 발현하여 이들의 정상적인 분화에 관여한다[13]. Mist1의 기능 억제시 선세포의 구조적 변 형이 칼슘 신호전달에도 영향을 미칠 수 있다는 보고가 있다[14]. 그럼에도 불구하고, 선세포의 극성을 조절하는 인자가 무엇인지는 잘 알려져 있지 않아 본 연구에서는 Mist1 유전자 제거 생쥐(knock-out mouse)를 이용하여 췌장 선세포에서 극성을 조절하는 인자로서 Mist1의 역 할을 세포 구조적 측면에서 알아보고자 하였다.
실험재료 및 방법
재료
Akihiko Tanimura 박사(Health Science University of Hokkaido, Hokkaido, Japan)로부터 anti-inositol 1,4,5- triphosphate receptors (IP3R) 2 다중 항체(polyclonal antibody) 를 제공받았다. Anti-IP3R3 단일 항체(monoclonal antibody) 는 Transduction Laboratories (Lexington, KY)에서 구입하였다. Anti-ZO1 다중 항체는 Developmental Studies Hybridoma Bank (Univeristy of Iowa, Iowa City, IA)에 서, Anti-Syncollin 단일 항체는 Complex Carbohydrate Research Center (University of Georgia, Athens, GA)에 서 구입하였다.
실험동물
Mist1 유전자 제거(Mist1−/−) 생쥐는 Shmuel Muallem 박사(University of Texas Medical Center, Dallas, TX) 소유물을 사용하였는데 제공된 동물들은 미국 University of Texas Medical Center 동물실에서 12시간 주/야 순환 주기와 일정한 온도, 습도를 유지하면서 실험동물용 사료 와 물을 자유로이 공급하며 사육하였으며, 미국 University of Texas Medical Center 실험동물위원회의 윤리 규정에 따라 실험하였다.
췌장의 선세포 분리
췌장의 선세포 분리는 콜라게네이즈 분해법(collagenase digestion)을 이용하여 선행연구에서 사용된 방법과 동일하 게 실시하였다[15]. 분리된 세포는 solution A (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7.4 with NaOH), 10 mM glucose, 0.1% bovine serum albumin과 0.02% soybean trypsin inhibitor) 에 담근 후 사용할 때까지 얼음에 보관하였다.
면역형광염색법
면역형광염색은 선행연구에서 사용된 방법과 동일하게 실시하였다[15,16]. 췌장 선세포를 슬라이드에 고정한 후 −20 o C에서 10분간 0.5 ml의 차가운 methanol로 세포막 의 투과성의 높인 후 50 mM glycine이 첨가된 인산완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 세척한다. 5% goat serum, 1% bovine serum albumin과 0.1% gelatin이 첨가된 PBS를 1시간 동안 처리하여 불특정 부위를 차단 (blocking)시킨다. 차단과정이 끝나면 용액을 제거한 후 1 차 항체 처리를 위해 1:100으로 희석된 IP3R2 항체와 1:500으로 희석된 IP3R3, ZO1, 그리고 Syncollin 항체를 첨가한 50 μl의 차단배지(blocking meida)를 4 o C에서 밤 새도록 처리한다. 1차 항체 처리가 끝나면 배양 완충용액 (incubation buffer)을 이용하여 3번의 세척과정을 거친 후 2차 항체 처리를 위해 fluorescein이나 rhodamine에 IgG 가 연결된 anti-rabbit과 anti-mouse 항체를 이용하여 2차 항체를 붙여준다. 처리가 끝난 시료는 Carl Zeiss confocal microscope (model LSM 510, Feldbach, Switzerland)를 사용하여 이미지를 얻었다.
실험 결과
췌장의 선세포는 분비과립들이 세포의 첨단부에 위치하 여 극성을 가지는 것으로 잘 알려져 있다. 생후 8개월 된 생쥐의 췌장에서 분리된 선세포를 관찰한 결과 Mist1 +/− 의 선세포에서는 분비과립들이 주로 세포의 첨단부에 밀 집되어 있는 반면, Mist1−/−의 선세포에서는 분비과립들이 세포 전반에 퍼져있는 모습을 볼 수 있었다(Fig. 1). 이는 Mist1이 췌장 선세포가 극성을 가지는 것과 상관관계가 있음을 시사한다.
Fig. 1. Morphology of the polarized mouse pancreatic acinar cells in Mist1 +/− and Mist1−/−. The cellular architecture of pancreatic acinar cells from Mist1−/− and Mist1 +/− mice at 8 months old (scale bar, 10 μm). AM, apical membrane; SG, secretory granules; BM, basolateral membrane.
췌장 선세포는 칼슘 신호전달을 연구하는데 중요한 재료로 사용되며 특히, IP3 수용체의 분포는 밀접한 상관관 계를 지닌다. 이전의 Pin 등의 보고에서 생쥐의 연령에 따 른 췌장염 관련 단백들이 발현적 차이를 나타냄을 보여준 적이 있다[17]. 따라서 본 논문에서는 5주와 8개월 된 Mist1−/− 생쥐를 이용하여 Mist1이 췌장 선세포에 주로 분 포하는 IP3 수용체인 IP3R2와 IP3R3의 분포에 어떠한 영 향을 미치는지를 면역형광염색법을 통해 확인해 보았다. 그 결과, 5주된 Mist1−/− 생쥐의 췌장 선세포에서 IP3R3의 발현이 대조군(wild-type)에 비해 감소되어 있음을 확인할 수 있었으며(Fig. 2E와 2F), 8개월 된 Mist1−/− 생쥐의 췌장 선세포에서의 IP3R3의 발현은 Mist1 +/−과 비교하여 거의 나타나지 않음을 확인할 수 있었다(Fig. 2G와 2H). 반면, Mist1이 IP3R2의 발현에는 어떠한 영향도 미치지 않음을 확인할 수 있었다(Fig. 2B와 2D). 본 결과들을 통 해서 칼슘신호전달에 중요한 IP3 수용체의 분포에 Mist1 이 상관관계가 있으며 칼슘신호전달에도 영향을 줄 수 있 을 것으로 여겨진다.
Fig. 2. Expression of IP3Rs in mouse pancreatic acinar cells form Mist1 +/− and Mist1−/− mice. Immunolocalized IP3R2 and IP3R3 in pancreatic acinar cells from WT (A and E) and Mist1−/− (B and F) mice at 5 weeks old and replaced the sentence Mist1 +/− (C and G) and Mist1−/− (D and H) mice at 8 months old (scale bar, 50 μm).
Fig. 1에서 Mist1이 췌장 선세포의 분비과립의 분포와 세포의 극성에 영향을 줄 수 있음을 확인하였다. 이에 Mist1이 세포 구조물의 형성에 어떠한 상관관계가 있는지 를 세포간 밀착 결합(tight junction)의 표식인자인 ZO1과 효소원 과립막(zymogen granule membrane) 표식인자인 Syncollin을 사용하여 알아보았다. 5주된 Mist1−/− 생쥐의 췌장 선세포에서 대조군에 비해 세포간 밀착 결합 간의 간격이 증가되어져 있으며(Fig. 3A와 3B), 그 차이가 8개 월 된 Mist1−/−에서 뚜렷해진 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3C와 3D). 또한, 대조군에 비해 세포 전반에 효소원 과 립들이 형성되어 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 3F와 3H). 이러한 결과들을 통하여 Mist1이 세포 구조물들의 형성에 관여하고 췌장 선세포가 극성을 가지는 것에 영향을 주는 것으로 여겨진다.
Fig. 3. Localization of cellular architecture markers in WT, Mist1 +/− and Mist1−/− cells. Immunolocalized tight juctions (ZO1) and zymogen granules (Synchollin) in pancreatic acinar cells from WT (A and E) and Mist1−/− (B and F) mice at 5 weeks old and Mist1 +/− (C and G) and Mist1−/− (D and H) mice at 8 months old (scale bar, 50 μm).
고 찰
본 연구는 Mist1이 분비기능을담당하는 췌장 선세포의 극성에 관여하는 세포 구조물들에 어떠한 영향을 미치는 지 세포 구조적 측면에서 조사하였다. Mist1은 췌장 선 세포가 극성을 가질 수 있도록 작용을 하며, 분비기능에 관여하는 세포 구조물들의 형성에도 영향을 미치는 것을 확인하였다. 또한, 이러한 현상은 생쥐의 연령이 증가할 수록 더 뚜렷해 지는 것을 확인할 수 있었다. 이전의 연 구들에서 Mist1이 선세포의 분비기전에 영향을 주고 이 와 관련된 칼슘 신호전달에도 영향을 준다는 보고들은 있 어왔지만 Mist1이 선세포의 극성을 형성하는데 영향을 미 친다는 것을 세포 구조학적으로 보여준 연구 결과는 없었다.
췌장에서의 외분비기능에 영향을 주는칼슘 신호전달은 주로 세포 첨단부에 위치한 효소원 과립들의 분포와 외 부 신호를 인지하여 작동하는 특정 신호전달계의 존재 유 무에 의존하는 것으로 여겨진다. Pin 등은 Mist1−/− 생쥐 의 췌장 조직에서 효소원 과립들의 발현에 영향을 주는 단백인 VAMP2와 CCK 신호전달에 주요한 CCK A 수 용체의 단백 발현이 현저히 증가되는 반면, IP3R3의 단 백 발현이 특이적으로 감소되어짐을 보고 하였다[17]. 또 한, Luo 등은 Mist1−/− 생쥐의 췌장 선세포에서 효현제인 CCK와 carbachol에 의한 칼슘 파형이 유발되지 않는다고 보고하였다[14]. 이러한 결과들은 Mist1이 췌장 선세포의 첨단부에 위치하는 GPCRs의 활성에 직접적으로 작용하 여 분비기전에 영향을 주는 것으로 여겨진다.
본 연구의 결과에서도 효소원 과립들의 분포가 세포 전 반에 나타나는 것은 Mist1에 의해 췌장 선세포의 분비 과 립들이 극성을 잃어버린 것과 밀접한 관계가 있을 것으로 여겨진다. 이러한 Mist1과 선세포의 극성에 따른 작용변 화는 이전의 보고들에서도 예측할 수 있었다. Mist1−/− 생 쥐의 췌장 조직에서 부착 결합(adherens juction)의 표지 인자인 β-catenin의 단백 발현이 현저히 줄어들고, 세포간 밀착 결합의 표지인자인 ZO1은 세포의 첨단부뿐만 아니 라 췌장관 쪽으로 넓게 퍼져있는 것을 확인하였다[17]. 또한, Mist1−/− 생쥐의 선세포에서는 골지체의 분포가 세 포 전반에 퍼져 있으며 그 경계가 명확하지 않은데, 이러 한 현상은 췌장 선세포의 소화 효소의 감소에 의한 것으 로 보고되었다[14]. 이전의 보고들과 함께 본 연구의 결 과들을 통하여 Mist1이 분비기능과 밀접한 관련이 있는 세포 구조물의 형성과 세포 극성에 중요한 영향을 미칠 것으로 여겨진다. 따라서, 본 논문은 Mist1 단백이 전사인 자로서의 역할 뿐 아니라 직접적으로 세포 내 칼슘 신호 전달 기전에 작용하여 췌장 선세포의 극성 형성에 관여하 며, 췌장 내 특정 단백질의 발현 및 효소 활성에 관여한 다는 내용을 명확히 보여주고 있다. 이와 같은 연구는 이 후 췌장염과 같은 질병 연구에 큰 도움이 될 것으로 사 료된다.
감사의 글
이 논문은 연세대학교 치과대학 2010년도 연구비에 의하여 이루어진 것임.
Figure
Table
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