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ISSN : 1226-7155(Print)
ISSN : 2287-6618(Online)
International Journal of Oral Biology Vol.40 No.1 pp.27-33
DOI : https://doi.org/10.11620/IJOB.2015.40.1.027

Staurosporine Induces ROS-Mediated Process Formation in Human Gingival Fibroblasts and Rat Cortical Astrocytes

Han Gil Lee1, Du Sik Kim1, Seong Ah Moon1, Jeong Wan Kang2*, Jeong Taeg Seo1**
1Department of Oral Biology, Yonsei University College of Dentistry, Seoul 120-752, Korea
2Department of Oral & Maxillofacial Surgery, Yonsei University College of Dentistry, Seoul 120-752, Korea
Corresponding Author : Jeong Wan Kang, Department of Oral & Maxillofacial Surgery, Yonsei University College of Dentistry, 50 Yonsei-ro, Seodaemun-gu, Seoul 120-752, Korea Tel.: +82-2-2228-3131, jeongwan@yuhs.ac
Corresponding Author : Jeong Taeg Seo, Department of Oral Biology, Yonsei University College of Dentistry, 50 Yonsei-ro, Seodaemun-gu, Seoul 120-752, Korea Tel.: +82-2-2228-3054, jeong@yuhs.ac
February 25, 2015 March 15, 2015 March 16, 2015

Abstract

In the present study, we investigated the effect of staurosporine on the formation of cellular processes in human gingival fibroblasts and rat astrocytes. Staurosporine caused a rapid induction of process formation in human gingival fibroblasts and rat astrocytes in a concentration dependent manner. The process formation of human gingival fibroblasts and rat astrocytes was prevented by the pretreatment with N-acetylcysteine, suggesting that staurosporine-induced ROS production was responsible for the process formation. Colchicine, a microtubule depolymerizing agent, inhibited the staurosporine-induced process formation, whereas cytochalasin D, an actin filament breakdown agent, failed to suppress the formation of cellular processes. This result indicated that polymerization of microtubule, and not actin filament, was responsible for the formation of cellular processes induced by staurosporine. In support of this hypothesis, Western blot analysis was conducted using anti-tubulin antibody, and the results showed that the amount of polymerized microtubule was increased by the treatment with staurosporine while that of depolymerized beta-tubulin in soluble fraction was decreased. These results indicate that staurosporine induces ROSmediated, microtubule-dependent formation of cellular processes in human gingival fibroblasts and rat astrocytes.


초록


    Yonsei University College of Dentistry

    서 론

    Staurosporine은 비특이적 광범위 단백질인산화효소 (protein kinase) 억제제로서 농도에 따라 protein kinase C, protein kinase A, protein kinase G, myosin light chain kinase, calmodulin-dependent kinase 등 다양한 단백질인산화효소 를 봉쇄한다. 또한 staurosporine은 단백질인산화효소 억제 목적 외에도 대표적인 아포토시스(apoptosis) 유발 약물로 널리 사용되고 있다. 이에 관여하는 기전으로는 caspase-3 활성화, 미토콘드리아로부터 cytochrome c 유리, 활성산소 종(reactive oxygen species, ROS) 생성, 세포내 칼슘 증가, 아포토시스 유발인자(apoptosis inducing factor, AIF) 등이 알려져 있다[1-3].

    그러나 단백질인산화효소 봉쇄작용 및 아포토시스 유발 작용과는 별도로 staurosporine은 척수신경절세포[4], PC12 세포[5], SH-SY5Y 세포[6,7], RGC-5 망막신경절 세포[8], HN33 세포[9] 등 다양한 세포에서 신경돌기 성장을 유도 하는 강력한 신경분화 유도물질이라고 보고되었으며, 배 아줄기세포에서도 staurosporine이 신경돌기를 길게 형성하 고 신경네트워크를 형성하는 것으로 밝혀졌다[10]. Staurosporine에 의해 유도되는 신경세포 분화는 신경성장 인자(nerve growth factor, NGF)에 의한 신경세포 분화와는 달리 Raf-MEK-ERK로 이어지는 MAPK 신호계 와는 상관 없이 일어나며 매우 빠른 신경돌기 성장을 보인다. Staurosporine이 신경세포를 분화시키는 기전은 아직까지 확실하게 밝혀져 있지 않으나, 최근 staurosporine에 의한 활성산소종의 생성이 PC12 세포 분화 및 신경돌기 생성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다[11].

    Staurosporine은 신경세포뿐 아니라 신경교세포(astrocyte) 에서도 신경 돌기와 비슷한 형태의 가늘고 긴 돌기를 형성 하는 것으로 알려져 있다[12]. 신경교세포는 다양한 자극 에 의해 활성화되는 경우 돌기를 가진 별 모양으로 형태가 변화하며, 이러한 형태 변화는 뇌의 발생과 세포의 이동 과정에 중요한 역할을 한다. 이와 같이 staurosporine은 신 경세포와 신경교세포에서 빠른 속도로 세포의 돌기를 형 성하기 때문에 빠르게 세포 분화와 돌기형성을 유발하는 물질로서 연구가 많이 진행되고 있다.

    Staurosporine에 의해 세포가 가늘고 길어지는 현상, 즉 세포돌기가 형성되는 현상이 최근 HeLa 세포와 흰쥐의 3Y1 섬유세포에서도 관찰되었다[13]. 세포에서 돌기의 형 성은 형태적 역동성에 관여하며 세포의 분화, 이동, 생리 적 기능조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

    따라서 본 연구에서는 사람 치은에서 분리한 섬유세포 (fibroblasts)와 생쥐 뇌에서 분리한 신경교세포를 이용하여 staurosporine이 돌기를 형성하는지 확인하고, 이 과정에 활 성산소종 및 세포골격(cytoskeleton)의 관여 여부를 확인하 고자 한다.

    재료 및 방법

    시약 및 재료

    Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin, streptomycin, trypsin-EDTA 는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 그 외 staurosporine, N-acetylcysteine (NAC), 항-베타튜불린 항체, colchicine, cytochalasin D 등은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사에서 구입하였다.

    세포배양

    신경교세포는 태어난 후 12-24시간이 지난 흰쥐의 뇌에 서 분리하였다. 흰쥐 대뇌 피질을 분리한 후 조직을 잘게 썰어 기계적으로 분리한 후 세포를 60-mm 배양접시에 넣 고 세포배양기에서 2-3 주 동안 유지하였다. 배양액은 2 mM glutamine, 25 mM glucose, 100 μg/ml penicillin, 25 ng/ml streptomycin, 10% FBS가 포함된 MEM 용액을 사용 하였다. 배양액은 3일 마다 교체하였다.

    사람의 치은섬유세포는 100-mm 배양접시에서 항생제 와 10% FBS가 포함된 DMEM 용액에서 배양하여 사용 하였다.

    세포돌기 생성확인

    Staurosporine에 의해 세포돌기가 생성된 경우 세포돌 기 길이의 합이 세포 총 길이의 1/2을 초과한 경우 유 효한 세포돌기로 간주하였다. 유효한 세포돌기를 생성한 세포의 숫자를 전체 세포 숫자에 대한 비율로 표시하였 다. 세포돌기의 길이는 Imagepro 프로그램을 사용하여 측정하였다.

    미세소관(microtubule) 중합반응 확인

    세포를 자극한 후 미세소관 안정 용액(90 mM MES (pH 6.7), 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10% glycerol)으로 씻고 triton X-100 용해 용액(90 mM MES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10% glycerol, 10 μM taxol, 0.1% Triton X-100, protease inhibitors, 1 mM Na3VO4)으로 세포를 용 해시켰다. 얻어진 단백질을 12,000g로 10분 간 원심분리 하고 상층액을 분리하였다. 가라 앉은 침전물(pellet)은 2% SDS 용해 용액(50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 2% SDS, protease inhibitor, 1 mM Na3VO4)에서 10분 간 100°C로 가열하고 얻어진 단백질 은 항-베타튜불린 항체를 이용하여 Western blot을 시행 하였다.

    결 과

    치은섬유세포 및 신경교세포에서 staurosporine에 의 한 세포돌기 형성

    Staurosporine이 세포의 돌기 형성에 미치는 영향을 사 람의 치은섬유세포와 흰쥐의 신경교세포에서 확인하였 다. Staurosporine을 투여하기 전 두 종류의 세포 모두에 서 돌기 형태는 적은 수의 세포에서만 관찰이 되었다 (치은섬유세포; 7.1 ± 1.2 %, 신경교세포; 1.2 ± 0.2 %)

    Staurosporine 50 nM, 100 nM을 치은섬유세포에 3 시 간 동안 처리한 후 세포의 형태 변화를 확인한 결과 그 림 1A에서 보는 바와 같이 staurosporine에 의해 세포질 에서 신경돌기와 유사한 형태를 갖는 긴 돌기가 형성되 는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 세포 돌기는 staurosporine의 농도가 증가함에 따라 더 빨리 형성되었 는데, 그림 1B에서와 같이 50 nM에서는 76 ± 7.4 %의 세포에서 돌기가 형성되었고 100 nM에서는 97 ± 2.3 % 의 세포에서 돌기가 형성되었다.

    흰쥐의 신경교세포에서도 staurosporine 50 nM, 100 nM 에 의해 농도의존적으로 세포 돌기가 형성되어 50 nM에 서는 63 ± 10.3 %의 세포에서 돌기가 형성되었고 100 nM 에서는 92 ± 4.5 %의 세포에서 돌기가 형성되었다.

    활성산소종이 staurosporine에 의한 세포돌기 형성에 미치는 역할

    PC12 세포에서 staurosporine에 의해 신경돌기가 생성 될 때 활성산소종의 생성이 관여한다는 보고가 있으므 로 그림 1에서 관찰된 결과가 활성산소종의 생성에 의 한 것인지 확인하였다. 그림 2에서 보는 바와 같이 치은 섬유세포와 신경교세포에 staurosporine 100 nM을 3 시 간 동안 처리하면 각각 97. 1 ± 3.1 % 및 93.1 ± 4.2 % 의 세포에서 돌기를 형성하였는데, 활성산소종을 제거하 는 NAC을 10분 간 전처리하고 staurosporine을 투여한 경우 돌기가 형성된 세포가 각각 11.2 ± 7.8 % 및 27.4 ±11.6 % 로 감소하였다(p<0.01).

    Staurosporine에 의한 세포돌기 형성에 미세소관의 합 성이 미치는 영향

    세포돌기 형성 과정에서 세포골격의 역할을 확인하기 위해 미세소관 합성을 억제하는 colchicine과 액틴(actin)을 깨는 cytochalasin D를 흰쥐의 신경교세포에 전처리하고 staurosporine의 효과를 확인하였다. 그림 3A와 B에서 보 는 바와 같이 100 nM staurosporine을 3 시간 처리한 세포 에서 세포 돌기가 94.3 ± 4.2 % 형성되었으나 20 μM colchicine을 10분 간 전처리하고 staurosporine을 투여한 세포는 돌기가 15.2 ± 8.1 % 만 형성되어, colchicine이 staurosporine에 의한 돌기 형성을 효과적으로 봉쇄함을 확 인할 수 있었다(p<0.01). 한편, 1 μM cytochalasin D를 10 분 동안 전처리하고 100 nM staurosporine을 투여한 세포 는 돌기가 97.0 ± 6.7 % 형성되어 100 nM staurosporine 만 을 처리한 세포와 큰 차이가 없었으며(p>0.05) 이러한 결 과를 바탕으로 cytochalasin D는 staurosporine에 의한 돌기 형성을 억제하지 못함을 확인하였다. 그러나 cytochalasin D를 투여한 세포는 staurosporine 만을 투여한 세포에 비 해 돌기의 숫자가 더 많았으며 돌기의 모양이 매끄럽지 않고 가시처럼 뻗어 나온 형태적 특징을 보였다.

    Staurosporine이 튜불린의 중합을 촉진하여 미세소관을 형성하는지 확인하기 위해 100 nM staurosporine을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 중합된 상태의 튜불린 양의 차이를 항-베타튜불린 항체를 이용하여 확인하였다. 그림 4에서 보는 바와 같이 staurosporine을 처리한 세포를 원심분 리하여 얻은 침전물에서의 튜불린 양이 staurosporine을 처 리하지 않은 세포의 침전물에서 측정한 튜불린 양보다 많음 을 확인하였는데, 이는 staurosporine에 의해 튜불린의 중합 이 촉진되었음을 나타낸다. 세포에 20 μM colchicine을 전처 리하는 경우 staurosporine 투여 여부와 상관없이 침전물에 서 튜불린이 거의 측정되지 않았으며, 이와는 반대로 1 μM cytochalasin D는 침전물에서의 튜불린 양에 거의 영향을 주 지 않았다. 따라서 staurosporine은 미세소관의 중합을 촉진 하였으며 staurosporine에 의한 미세소관의 중합 촉진이 돌 기 형성의 주요 기전임을 확인하였다.

    고 찰

    본 연구를 통해 기원이 서로 두 가지 세포, 즉 사람 의 치은섬유세포와 흰쥐의 신경교세포에서 staurosporine 이 길고 가는 세포돌기를 형성하는 것을 확인하였다. Staurosporine이 신경세포에서 세포의 분화와 신경 돌기 의 성장을 유도한다는 것은 이미 잘 알려져 있으며 [14,15], 신경교세포에서도 staurosporine이 세포돌기를 형 성한다는 것이 보고되었다[12]. 그러나 치은섬유세포에 서 staurosporine이 세포돌기를 형성한다는 것은 아직까 지 보고된 바가 없다. 최근 발표된 보고에 의하면 HeLa 세포와 3Y1 세포 등의 섬유세포에서 staurosporine이 매 우 긴 세포돌기를 형성하며, 이러한 세포 돌기의 형성이 세포의 분화와 이동 과정에서 관찰된다고 하였다[13]. 따라서 치은섬유세포에서 세포돌기의 형성을 유도한다 는 결과는 치은섬유세포의 분화 및 이동을 staurosporine 이 촉진할 가능성이 있음을 보여준다.

    신경세포의 경우 세포의 분화 및 신경돌기의 성장 과 정에 ERK의 활성화가 관여하는 것으로 알려져 있다. 일 반적으로 PC12 세포에서 신경세포 분화는 세포막 수용 체에 신경성장인자가 작용함으로써 Ras가 활성화되고, 이어서 Raf-MEK-ERK 신호계가 순차적으로 활성화됨으 로써 세포분화 및 신경세포돌기의 성장이 유발된다[16]. 그러나 staurosporine에 의한 신경세포의 분화 과정에는 ERK 신호계는 관여하지 않는 것으로 알려져 있으며, Jun NH2-terminal kinase (JNK) 활성화[14], galectin-3의 발현[17], 세포막을 통한 칼슘 유입[18] 등이 관여하는 것으로 알려져 있다. 그런데 최근에서 활성산소종의 생 성이 staurosporine에 의한 PC12 세포 분화 및 신경돌기 생성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다[11]. 이 에 치은섬유세포 및 신경교세포에서 staurosporine에 의 해 돌기가 형성되는 과정에서도 활성산소종이 중요한 역할을 하는지 확인한 결과, staurosporine에 의한 돌기 형성이 활성산소종의 제거제인 NAC에 의해 억제되는 것이 확인되었다.

    활성산소종은 세포 손상과 사멸을 유발하는 대표적인 물질로서, 산소를 이용해서 에너지를 생성하는 모든 생 명체의 미토콘드리아에서 호흡과정 중 부산물로 생성되 는 superoxide 음이온(O2·-), 과산화수소(H2O2), 하이드록 시 라디칼(hydroxyl radical; OH) 등을 일컫는다. 이러한 활성산소종은 반응성이 강하여 세포에 독작용을 나타내 므로 세포 내에는 활성산소종을 제거하는 다양한 효소 계와 항산화물질이 존재하며, 이들 항산화 시스템을 이 용하여 활성산소종을 제거한다. 그러나 활성산소종은 다 양한 생리적 자극에 의해 생성되어 세포내 신호전달계 를 활성화시킴으로써 세포의 분화 및 분열을 비롯하여 세포의 다양한 생리적 기능을 매개하는 것으로도 알려 져 있다. Staurosporine이 치은섬유세포 및 신경교세포에 서 어떤 기전을 통해 활성산소종을 생성하는지는 아직 확실하게 밝혀져 있지 않다. PC12 세포의 경우 Rac1 활 성화에 이은 NADPH oxidase 활성화로 활성산소종이 생 성되는 것이 보고되어 있지만[11], 치은섬유세포 및 신 경교세포에서도 NADPH oxidase 활성화에 의해 활성산 소종이 생성되는지는 좀 더 세밀한 연구가 필요할 것으 로 생각된다.

    활성산소종이 staurosporine에 의한 신경돌기 형성을 촉진하는 기전도 아직까지 정확히 밝혀져 있지 않다. 활 성산소종이 tyrosine receptor kinase-A (TrkA)와 ERK를 인산화시킴으로써 신경세포 분화를 촉진하는 것이 알려 져 있지만, staurosporine은 이들 신호인자를 활성화시키 지 않는 것이 밝혀져 있으므로 staurosporine에 의한 신 경돌기 형성 촉진 과정에 이들 인자는 관여하지 않는다. 그러나 세포 내에서 생성된 활성산소종이 액틴 및 액틴 결합 단백질의 기능을 직접적으로 조절함으로써 신경돌 기 성장을 촉진할 수 있다는 보고가 있으므로[19,20], staurosporine에 의한 활성산소종 생성이 액틴이나 미세 소관에 영향을 미쳐서 신경돌기를 생성할 가능성을 생 각할 수 있다.

    세포의 분화 및 이동 과정에 액틴이나 미세소관 같은 세포골격의 변화가 관여함은 이미 잘 알려져 있다 [21,22]. 예를 들어 Rac과 Cdc42의 활성화는 세포의 확 장(spreading)과 이동에 관련된 lamellipodia 및 filopodia를 형성하고, 신경세포의 growth cone에서는 Rac과 Cdc42에 의해 액틴이 형성된다[23]. 또한 NIH 3T3 섬유세포의 경우 혈소판유래성장인자(PDGF) 또는 ROCK 봉쇄제에 의해 신경돌기와 비슷한 세포의 돌기가 형성되는 것으 로 알려져 있는데, 이 과정에 미세소관이 관여하는 것으 로 보고되었다[24].

    본 연구에서는 staurosporine에 의한 세포돌기 형성을 미세소관 중합 억제제인 colchicine이 억제하지만, 액틴 섬유를 깨는 cytochalasin D는 세포돌기 형성을 억제하지 못하는 것을 보였다. 뿐만 아니라 항-베타튜불린 항체를 이용하여 staurosporine을 처리하기 전과 후에 중합된 상 태의 튜불린 양의 변화를 관찰한 결과 staurosporine에 의해 튜불린의 중합이 촉진되었음을 확인하였다. 이와 같은 결과는 staurosporine에 의해 세포돌기가 형성되는 과정에 활성산소종과 미세소관 중합이 중요한 역할을 함을 보여주는 것으로서 향후 staurosporine이 어떻게 활 성산소종을 생성하여 미세소관 중합을 촉진하는지 연구 할 예정이다.

    Conflict of interest

    The authors declare that there is no conflict of interest.

    Figure

    IJOB-40-27_F1.gif

    staurosporine caused a rapid induction of process formation in human gingival fibroblasts and rat astrocytes. (A and C) Photomicrographs of human gingival fibroblasts (A) and rat astrocytes (C) incubated with indicated concentrations of staurosporine for 3 h. The image in each panel is representative of 4 independent experiments. (B and D) Cells with the processes of which the total length was greater than 1/2 of the cell length were counted and the percentage of process-bearing cells was determined. Results are presented as mean ±S.E.M. of 4 independent experiments; at least 50 cells/condition were analyzed in each experiment. STS: staurosporine.

    IJOB-40-27_F2.gif

    ROS were involved in staurosporine-induced induction of process formation. (A and C) Photomicrographs of human gingival fibroblasts (A) and rat astrocytes (C) treated with 100 nM staurosporine for 3 h in the presence or absence of 10 mM NAC. The image in each panel is representative of 5 independent experiments. (B and D) Human gingival fibroblasts (B) and rat astrocytes (D) with cellular processes of which the total length was greater than 1/2 of the cell length were counted and the percentage of process-bearing cells was determined. Results are presented as mean ±S.E.M. of 5 independent experiments; at least 70 cells/condition were analyzed in each experiment. Statistical analysis was performed using an unpaired Student’s t-test. **Significant differences between the indicated groups (P < 0.01). STS: staurosporine, NAC: N-acetylcysteine.

    IJOB-40-27_F3.gif

    Microtubule polymerization was responsible for the formation of cellular processes induced by staurosporine. (A) Photomicrographs of rat astrocytes treated with 100 nM staurosporine for 3 h in the presence or absence of 20 μM colchicine or 1 μM cytochalasin D. The image in each panel is representative of 4 independent experiments. (B) Cells with the processes of which the total length was greater than 1/2 of the cell length were counted and the percentage of process-bearing cells was determined. Results are presented as mean ±S.E.M. of 4 independent experiments; at least 40 cells/condition were analyzed in each experiment. Statistical analysis was performed using an unpaired Student’s t-test. **Significant difference between the indicated groups (P < 0.01). N.S. indicates that there is no significant difference between the indicated groups (P > 0.05). STS: staurosporine, Col: colchicine, Cyt: cytochalasin D.

    IJOB-40-27_F4.gif

    Staurosporine induced polymerization of the microtubule network. Cells were stimulated with 100 nM staurosporine for 3 h in the presence or absence of 20 μM colchicine or 1 μM cytochalasin D. The cells were lysed and fractionated into soluble (supernatant) and polymerized (pellet) extracts, which were separated with SDS-PAGE, transferred, and probed with anti-β-tubulin antibody. The image in each panel is representative of three independent experiments.

    Table

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