서 론

보툴리눔 독소(botulinum neurotoxins)는 신경시냅스 틈 으로 아세틸콜린 분비를 차단하여 근골격계 질환들을 치료하는데 사용하는 것으로 알려져 있다[1,2]. 최근 연 구에서 보툴리눔 독소 A형이 통증을 억제한다는 것[3] 을 보고하면서 통증을 조절하는 약물로 사용하기 시작 하였다. 보툴리눔 독소가 진통작용을 나타낸다는 보고는 다양한 임상증례에서 볼 수 있는데, 특히 긴장성두통[4], 만성요통[5], 근골격계에 발생하는 통증[6], 편두통[7,8], 그리고 근막통증[9]에 이르는 다양한 통증에 작용하여 진통작용을 나타낸다. 보툴리눔 독소는 동물실험에서도 의미 있는 진통작용을 보여주고 있다. 보툴리눔 독소를 피하조직으로 주입하면 carrageenan이나 capsaicin을 주입 하여 나타나는 통증을 유의하게 억제하였다[10]. 이와 같이 피하조직으로 보툴리눔 독소를 주입하여 나타나는 진통작용은 신경말단에서 유리되는 glutamate 분비를 억 제하여 나타난다[11]고 한다. 또 다른 선행연구로서 배 아기에서 적출한 뒤뿌리 신경절을 배양한 실험에서 보 툴리눔 독소 투여가 substance P 유리를 유의하게 억제 하였다[12]는 실험결과는 보툴리눔 독소의 작용기전을 잘 설명하고 있다.

보툴리눔 독소의 통증 억제작용은 말초에서 뿐만 아 니라 중추로 주입하였을 때에도 나타났다. 경막하로 주 입한 보툴리눔 독소는 포르말린를 주입하여 나타나는 통증 행위 반응을 유의하게 억제하였으며[13,14], 당뇨병 에 의해 유도되는 신경병성 통증을 유의하게 억제하였 다[15]. 또한 산성용액을 주입하여 발생하는 통증과민 현상을 억제하였다[16]. 이러한 실험 결과는 보툴리눔 독소를 중추신경계로 주입하여도 통증을 억제할 수 있 다는 것을 보여주며, 이러한 방법은 향후 말초 투여와 더불어 의미 있는 통증 조절방법으로 제시될 수 있을 것이다.

보툴리눔 독소는 악안면 영역에서 발생한 통증도 억 제한다. 보툴리눔 독소를 말초 또는 중추로 주입하면 악 안면 영역에서 발생하는 염증성 통증을 유의하게 억제 하였고[17], 안와하신경(infraorbital nerve)을 묶어서 나타 나는 신경병성 통증을 억제하였다[18]. 또한 삼차신경절 (trigeminal ganglion)을 배양한 실험에서 보툴리눔 독소 를 주입하면 통증을 전도하는 신경전달 물질인 CGRP의 유리를 유의하게 억제하였다[19,20]. 임상 연구에서도 안 면 피하조직으로 주입한 capsaicin에 의해 나타나는 통증 이 보툴리눔 독소를 투여하면 유의하게 억제되었다[21]. 나아가 악관절 통증이나 수술 후 외상에 의한 통증, 두 통 혹은 다발성 안면통증에 이르기까지 다양한 통증을 억제한다는 것이 보고되었다[22]. 이러한 실험 결과는 악안면 영역에서도 보툴리눔 독소가 진통작용을 나타낼 수 있다는 것을 보여 준다.

최근 신경세포와 신경교세포(glial cells) 사이에서 발 생한 상호작용에 의해 신경계가 감작되어 통증과민 현 상을 나타낸다는 보고[23-25]는 만성통증 발생에 신경교 세포의 역할을 잘 설명해 주고 있다. 그러나 보툴리눔 독소를 투여하여 나타나는 진통작용에 신경교세포가 어 떻게 작용하는지에 대한 연구는 거의 없는 실정이다. 따 라서 본 연구에서는 보툴리눔 독소를 주입하여 나타나 는 진통작용에 신경교세포의 역할을 알아보기 위하여 실험하였다. 안면 열통증을 발생시키기 위하여 피하조직 으로 CFA를 주입하였으며 미세아교세포(microglia)의 표 지자인 Iba1과 별아교세포(astrocyte)의 표지자인 GFAP의 발현을 관찰하였다. CFA 주입 3일 전 보툴리눔 독소를 피하조직과 소뇌연수조로 각각 주입한 다음 신경교세포 발현에 미치는 영향을 평가하였다.

재료 및 방법

실험동물

실험동물은 수컷 Sprague-Dawley계 흰쥐(230-280 g)를 사용하였고, 경북대학교 치의학전문대학원 동물실에서 일정한 온도와 12시간 주/야 빛 순환주기를 갖는 환경 에서 실험동물용 사료와 물을 자유롭게 공급하여 사육 하였다. 본 연구는 경북대학교 치의학전문대학원 실험동 물위원회의 승인을 얻었으며, 의식이 있는 동물 실험에 관한 세계통증연구학회의 윤리적 규정을 준수하였다.

소뇌연수조 약물 주입관 삽입

약물을 안면부 감각정보가 투사되는 삼차신경핵군으 로 주입하기 위하여 소뇌연수조로 투여하였다. 소뇌연수 조로 약물을 투입하기 위하여 실험동물에게 카테터 (catheter)를 삽입하는 수술을 실시하였다[26-29]. 실험동 물을 ketamine 0.5ml/kg으로 마취하였으며 마취된 쥐는 뇌정위고정장치(David kopf instruments, Tujunga, CA, USA)에 머리를 고정시키고 폴리에틸렌관(PE10)을 소뇌 연수조 내로 삽관하였다. 폴리에틸렌관은 두개골 부위로 빼내어 금속 나사못과 치과용 레진(Dentsply Caulk, Milford, USA)을 사용하여 머리에 고정하였다. 수술 후 72시간 동안 실험동물을 회복시켰다.

악안면 통증 동물 모델

실험동물을 3% isoflurane으로 흡입 마취한 다음 안면 영역에 염증성 만성 통증을 유발하기 위해 CFA oil (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)과 생리식염수를 1:1의 비 율로 혼합하여 40 μL 용량으로 안면영역 피하에 주사하 였다. 선행연구에서 CFA를 안면영역 피하에 주입하면 1 일째부터 열과민성 통증이 발생하였고, 주입 후 10일째 까지 계속 유지되었으며, 14일째가 되면 CFA를 주입하 기 전과 같은 수준으로 회복된다는 것을 보고한 바 있 다[30]. 열통증 평가를 위해 실험동물이 목을 빼내어 자 유롭게 움직일 수 있도록 설계된 투명한 플라스틱 관찰 용 통에 한 마리씩 넣어 열자극을 받을 수 있도록 하였 다. 동물 실험은 밝지 않으면서 조용한 곳에서 최소 30 분 이상 안정화시킨 다음 실험을 실시하였다. 열자극은 레이저 자극기(Infrared Diode Laser, LVI-808-10, LVI tech, Seoul, Republic of Korea)를 이용하여 피부로부터 10 cm 떨어진 곳에서 90°각도로 적용하였다[31,32]. 레 이저 자극의 전력과 전류는 11 W와 18.1 A로 고정하였 으며, 안면영역에 열자극을 가한 다음 자극으로부터 얼 굴을 피하는 시간(Head withdrawal latency)을 측정하여 평가하였다. 자극은 5분 간격을 두고 2번을 가한 다음 평균값을 산출하였으며, cut-off time은 조직손상을 방지 하기 위해 20초로 설정하였다.

보툴리눔 독소의 투여

신경말단에서 분비되는 신경전달물질을 차단하기 위 하여 보툴리눔 독소를 안면피부 피하조직으로 3 U/kg 농도로 30 μL를 주입하였다. 주입한 보툴리눔 독소는 신경말단에서 SNARE 단백질을 분해하여 신경전달물질 유리를 억제하는 것으로 알려져 있다[33]. 또한 중추성 작용을 평가하기 위하여 소뇌연수조로 연결된 관을 이 용하여 보툴리눔 독소(1 U/kg)를 중추신경으로 주입하였 다. 보툴리눔 독소는 type A (Botulax, Hugel Inc, Chuncheon, Republic of Korea)를 사용하였으며, 생리식 염수에 희석하여 CFA 주입 3일 전에 투여하였다.

면역조직화학염색

CFA 투여 후 5일째 되는 날 실험동물(n=5 per group)에 서 열통증을 평가하였고, 이후 3시간이 지난 다음 ketamine 0.5 ml/kg으로 마취하였다. 마취된 실험동물은 0.9% 생리 식염수를 이용하여 심장관류를 실시하였으며, 0.1 M phosphates buffer (PB, pH 7.4)에 용해시킨 4% paraformaldehyde로 고정하였다. 숨뇌뒷뿔을 적출하여 동 일한 고정액으로 4℃에서 2시간 동안 후고정한 뒤 후고정 한 조직을 30% sucrose 용액에 두어 4℃에서 24시간 침투 시켰다. 그 후 조직을 얼린 뒤, 박절기를 이용하여 30 μm 두께의 절편을 제작하고 ready-to-use 2.5% normal horse serum blocking solution (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 조직을 4℃ 환경에서 미세아교세포의 마커인 rabbit anti-Iba1 (Ionized calcium binding adaptor molecule 1, 1:2000, Wako, Osaka, Japan)과 별아교세포의 마커인 mouse anti-GFAP (glial fibrillary acidic protein, 1:5000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA) 항체를 이용하여 24시간 반응시켰다. 이어서 Anti-mouse or anti-rabbit secondary antibody conjugated to peroxidase (ImmPRESS reagent kit, Vector Laboratories)를 이용하여 반응시킨 후, 3,3'-diaminobenzidine (DAB, Vector Laboratories)로 발색시켰다. 발색된 절편은 현미경(BX 41 and U-RFL-T, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하고 사진 을 촬영하였다. 이미지 분석은 I-solution (Innerview Co, Seongnam, Republic of Korea) 프로그램을 이용하여 분석하 였다.

통계분석

면역조직화학염색 결과의 통계분석은 반응의 유의성 을 검증하기 위해 student t-test를 실시하였다. 통계적인 비교를 위해 통계적 유의성의 표준값은 P<0.05로 설정 하였다. 모든 결과는 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표시하 였다.

결 과

안면 피부에 CFA를 주입한 다음 통증이 발생한 실험 동물에서 나타나는 미세아교세포와 별아교세포의 변화 양상을 면역조직화학염색방법을 이용하여 분석한 결과 를 그림 1에 나타내었다. CFA를 실험동물 안면 피부로 주입한 다음 3일째가 되면 열자극에 대한 반응이 유의 하게 증가하였고 이러한 열통증 과민현상은 5일째 최고 로 나타났으며 14일이 되면 정상으로 회복되었다[30]. 따라서 CFA를 주입하고 통증이 최고로 나타나는 5일째 되는 날 미세아교세포와 별아교세포의 변화를 평가하기 위하여 면역조직화학염색을 실시하였다. 미세아교세포를 관찰하기 위하여 Iba1 마커를 이용하였으며, 별아교세포 는 GFAP 마커를 이용하여 관찰하였다. CFA를 안면 피 부로 주입하면 삼차신경 척수감각핵의 꼬리핵에서 미세 교세포 마커인 Iba1과 별아교세포 마커인 GFAP가 유의 하게 증가하였다(P<0.05). 이러한 변화는 주로 CFA를 주 입한 같은 측의 꼬리핵 에 분포하였으며 위치는 lamina I과 II 영역에 주로 분포하였다.Fig .1

CFA를 주입하여 통증이 유발된 실험동물에서 보툴리 눔 독소의 진통작용은 선행연구에서 이미 보고하였다 [34]. 실험동물에 CFA를 주입하여 발생한 열통증은 안 면 피하조직으로 보툴리눔 독소를 1 또는 3 U/kg의 용 량으로 주입하면 유의하게 억제되었다. 또한 소뇌연수조 로 0.3 또는 1 U/kg의 용량으로 주입한 실험에서도 유의 한 진통작용을 관찰하였다[34]. 본 연구에서 통증 행위 반응을 억제시키는 보툴리눔 독소가 CFA투여로 발현이 증가한 신경교세포 활성에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다. 피하조직으로 보툴리눔 독소를 3 U/kg의 용 량으로 주입한 실험동물에서 미세아교세포 마커인 Iba1 의 발현이 vehicle을 주입한 대조군과 비교하여 볼 때 유의하게 억제된 것을 볼 수 있다(P<0.05, Fig 2). 또한 별아교세포 마커인 GFAP의 발현도 보툴리눔 독소를 주 입한 실험군에서 vehicle을 주입한 대조군과 비교하여 볼 때 유의하게 억제되어 나타났다(P<0.05, Fig 2.).

중추성 작용을 알아보기 위하여 소뇌연수조로 보툴리 눔 독소를 진통작용을 유발하는 용량인 1U/kg의 용량으 로 주입한 다음 CFA에 의해 발현이 증가되는 Iba1과 GFAP의 발현에 미치는 영향을 분석한 결과를 그림 3에 나타내었다. 소뇌연수조로 주입한 보툴리눔 독소는 CFA 를 주입하여 나타나는 Iba1과 GFAP의 발현을 모두 유 의하게 억제하였다(P<0.05).Fig .3

고 찰

본 연구 결과는 CFA를 안면 피부로 주입하면 삼차신 경 척수감각핵에서 미세아교세포 마커인 Iba1과 별아교 세포 마커인 GFAP의 발현이 증가하였으며, 증가된 Iba1 과 GFAP의 발현은 말초 또는 중추로 주입한 보툴리눔 독소에 의해 유의하게 억제된다는 것을 보여준다. 이러 한 실험 결과는 말초 또는 중추로 주입한 보툴리눔 독 소에 의해 나타나는 진통작용이 중추신경계에 존재하는 신경교세포의 활성을 억제하여 나타난다는 것을 말해 주고 있으며 신경교세포 조절은 향후 새로운 진통제 개 발에 중요한 실험적 근거를 제시해 준다고 판단된다.

중추신경계에서 신경교세포는 미세아교세포, 희소돌 기아교세포, 별아교세포로 구성되어 있다. 미세아교세포 는 대식세포나 단핵구의 전구세포에서 만들어지는데 일 반적으로 면역기능에 관여하며, 조직 손상이나 감염으로 부터 뇌조직을 보호하는 기능을 가지고 있다[35]. 신경 손상이 발생하면 미세아교세포는 흥분되면서 형태학적 인 변형을 일으킨다. 이때 세포막에서 새로운 세포 마커 가 발현되어 손상 받은 부위로 이동하게 되고 탐식작용 을 야기하며 염증전구물질을 분비하여[36,37] 만성통증 유발에 관여하게 된다. 미세아교세포가 통증이 발생하는 초기에 반응을 한다면 별아교세포는 통증을 유지하는데 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 미세아교세포 와 다르게 별아교세포는 신경세포와 혈관을 구성하는 세포와 밀접하게 관련이 있다. 신경손상 후 손상 받은 척수신경에서 활성화된 별아교세포를 관찰할 수 있으며 [38], 미세아교세포와 같이 별아교세포는 형태학적으로 변화하여 TNF-α나 IL-1β와 같은 사이토카인을 유리한다 [39]. 별아교세포가 만성통증 발생에 관여된다는 사실은 말초 염증에 의해 발생하는 통증[40]이나 좌골신경[38], 척수신경[41,42] 그리고 안와하신경[43]을 묶어서 유발하 는 신경병성 통증이 발생할 때 별아교세포가 활성화된 다는 결과를 통하여 알 수 있다. 이러한 실험결과를 미 루어 볼 때 미세아교세포 뿐만 아니라 별아교세포도 만 성통증 유발에 매우 중요하게 작용한다는 것을 알 수 있다.

악안면 영역에서 발생하는 통증에서도 미세아교세포 와 별아교세포가 중요하게 작용한다는 사실은 선행 실 험 결과[44]를 통하여 알 수 있다. 본 연구에서도 CFA 로 염증을 유발시키면 통증이 발생할 뿐만 아니라 미세 아교세포와 별아교세포의 활성을 유의하게 증가시켰다. CFA를 안면 피하조직으로 주입한 다음 통증 발생과 더 불어 신경교세포의 활성이 증가하였다는 보고[45,46]는 본 연구 결과와 일치한다는 것을 알 수 있다. 본 연구결 과를 포함하는 선행 연구의 실험 결과들은 악안면 영역 에서 발생하는 만성통증의 발생에 미세아교세포나 별아 교세포가 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.

혐기성 세균인 Clostridium botulinum에 의해 합성되는 보툴리눔 독소(Botulinum neurotoxins)는 무거운 사슬과 가 벼운 사슬이 단일 디설피드 (disulfide bond)결합으로 연결 되어 있는 구조를 가지는 것[13]으로 알려져 있다. 일반적 으로 보툴리눔 독소는 말초 신경 말단에서 SNARE 단백 복합체 형성을 방해하여[47-49] acetylcholine과 같은 신경 전달물질의 유리를 억제한다[11,33]. SNARE단백 복합체 중에서 보툴리눔 독소는 synaptobrevin (VAMP), 25kDa의 synaptosomal associate protein (SNAP25)을 포함하는 소포 체와 결합하는 단백질과 결합하는 작용을 나타낸다[50]. 이러한 작용으로 보툴리눔 독소는 신경시냅스 틈으로 아 세틸콜린의 분비를 차단하여 작용을 나타낸다[1,2]. 선행 연구에서 CFA를 주입하여 통증이 유발된 실험동물에서 보툴리눔 독소를 주입하여 진통작용을 관찰하였다[34]. CFA를 주입하면 발생한 열통증은 안면 피하조직이나 소 뇌연수조로 주입한 보툴리눔 독소에 의해 유의하게 억제 되었다[34]. 이러한 실험결과는 보툴리눔 독소가 안면영역 에서 발생하는 통증을 조절할 수 있다는 것을 보여주고 있 으며, 특히 말초나 중추성작용을 통하여 진통작용이 나타 난다는 것을 말해 준다.

진통작용을 나타내는 보툴리눔 독소가 CFA에 의해 발현이 증가된 신경교세포를 조절하는지 알아보았다. 본 연구에서 말초조직으로 투여한 보툴리눔 독소는 진통작 용을 나타낼 뿐만 아니라 CFA를 주입하여 활성화된 미 세아교세포와 별아교세포의 발현을 유의하게 억제시켰 다. 이러한 실험 결과는 말초조직으로 투여한 보툴리눔 독소가 CFA로 유도되는 통증 반응을 억제할 때 신경교 세포를 조절하여 나타난다는 것을 말해 주고 있다. 말초 로 투여한 보툴리눔 독소가 신경교세포를 억제하는 작 용은 포르말린에 의해 유도되는 통증 행위반응[51]이나 CFA로 유도되는 염증성 통증[17]을 억제하였다는 보고 들로부터 추론될 수 있다.

보툴리눔 독소의 중추성 진통작용 역시 선행연구에서 보고된 바 있는데 보툴리눔 독소를 경막하로 주입하면 좌골신경을 묶어서 유발하는 신경병성 통증[52]이나 당 뇨병에 의해 유도되는 신경병성 통증[15]을 유의하게 억 제하였다. 또한 중추신경계로 주입한 보툴리눔 독소는 포르말린이나 CFA를 주입하여 나타나는 통증행위반응 을 유의하게 억제하였다[17]. 중추로 투여한 보툴리눔 독소가 신경교세포에 영향을 미치는지 본 연구에서 확 인하였다. 본 연구결과는 중추신경계로 주입한 보툴리눔 독소가 CFA에 의해 활성화되는 신경교세포 발현을 유 의하게 억제시키는 것을 보여 주고 있다. 이러한 실험 결과는 중추로 투여한 보툴리눔 독소가 신경교세포를 억제하여 진통작용을 나타낸다는 사실을 보여주고 있다.

아직까지 보툴리눔 독소의 진통작용 기전은 잘 알려 져 있지 않다. 일반적으로 말초통증 수용기의 활성화는 통증을 유발하고 유발된 통증은 중추신경경계에 전도되 어 신경의 가소성(plasticity)을 유발하게 되어 말초조직 에 대한 반응을 지속시키거나 증가시키게 된다. 이러한 현상은 만성 지속성 통증을 유발하는데 매우 중요한 역 할을 한다. 이와 같은 가소성 변화를 중추성 감작이라고 이야기하며 신경교세포가 중추성 감작에 매우 중요하다 는 사실은 많은 선행 연구에서 보고되었다[53-56]. 그러 나 보툴리눔 독소가 신경시냅스 가소성을 조절하여 진 통작용을 나타낼 수 있다는 사실은 더 연구되어져야 할 것으로 판단된다.