서 론

양대 구강병인 치아우식증과 치주질환은 구강 내 존 재하는 세균이 주요한 원인인자인 세균감염성질환으로 잘 알려져 있다. 치아우식증은 치면세균막 내 당질대사 를 통해 분비되는 이차 대사산물인 유기산들(주로 젖산) 에 의해 치아 법랑질 표면이 탈회되면서 발병이 시작되 며, 이들의 주요한 원인균은 뮤탄스 그룹 연쇄구균(뮤탄 스 연쇄구균)인 것으로 보고되었다[1-2]. 치주질환은 치 아 주변 조직인 치은, 치조골, 치주인대 및 백악질에 염 증이 발생하는 질환으로 치아 소실의 주요한 원인이면 서 동맥경화증과 같은 심혈관질환뿐만 아니라 폐혈증, 유산, 조산, 폐렴 및 당뇨병과도 밀접한 관련이 있는 것 으로 보고되었다[3-6]. 치주질환과 관련된 세균들은 주로 치은연하치면세균막에 서식하는 그람 음성 혐기성세균 들로 알려져 있다[7-8].

치아우식증 및 치주질환의 예방에 있어서 올바른 잇 솔질로 이들 치면세균막을 제거하는 것이 좋은 방법이 라 할 수 있다. 하지만, 잇솔질로는 치아 교합면의 와나 열구에 존재하는 세균막이나 치아 인접면에 있는 세균 막까지는 제거가 어렵다. 이러한 단점을 보완하기 위하 여 치실이나 항균능이 부여된 구강양치용액을 사용한다.

구강양치용액의 항균성분으로는 장기간 사용 시 항생제 와 같은 내성이 없는 천연물에서 추출한 엔션설 오일들 (essential oils)이나 플라보노이드 계통의 단일 화합물을 추출하여 그 가능성을 연구하는 결과물이 보고되고 있 다[9,10]. 하지만, 이러한 단일 화학물들은 추출하고 정 제하는 데 많은 시간과 비용이 들기 때문에 복합추출물 을 이용하려는 연구들이 진행되었다[11,12].

황련(학명; Coptis japonica, 라틴명; Coptidis rhizome) 은 전통의학에서 오랫 동안 염증과 관련된 질환에 사용 되어 왔으며, 최근 연구 결과물들에 의하면 항균, 항말 라리아 및 항당뇨 효과가 있는 것으로 보고되었다 [13-17]. 하지만 황련의 치아우식증과 치주질환 원인균에 대한 연구는 미미한 실정이다. 그러므로 본 연구는 황련 메탄올 추출물의 치아우식증과 치주질환 원인균에 대한 항균능을 조사하여 향후 두 질환의 예방을 위한 치약 및 구강양치용액 등과 같은 구강위생용품 개발에 사용 가능하는지를 알아보기 위해 실시하였다.

재료 및 방법

황련 메탄올 추출물

중국이 원산지인 건조된 황련을 보림한약제약(Jinju, Korea)에서 구입하여 본 연구에 사용하였다. 분쇄기를 이용하여 분말로 만든 황련 100 g을 메탄올(DA JUNG, Seoul, Korea) 500 ml과 섞은 다음 실온에서 48시간 동 안 shaking incubator로 추출 하였다. 추출액은 원심분리 기(5000 rpm, 20분)를 이용하여 원심분리하여 상층액을 취한 다음, 회전농축기(RV 10, IKA, Seoul, Korea; 80 rpm, 40℃)로 농축하고, 동결건조(LABCONCO, Kansas City, MO, USA)하여 황련 메탄올 추출물을 얻었다. 동 결 건조된 황련 메탄올 추출물은 DMSO (Sigma)로 200 mg/ml 농도로 녹인 후 13,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리(5415D, Eppendorf, Hamburg, Germany)하여 상층액 을 취하여 다음 실험에 사용하였다.

실리카겔 크로마토그래피를 이용한 분획물 추출

황련 메탄올 추출물은 실리카 겔 크로마토그래피를 실시하여 분획화하였다. 메탄올 추출물 20 g을 메탄올 50 ml에 녹인 후 ethyl acetate (HPLC solvent, DA JUNG, Seoul, Korea) 50 ml을 혼합한 후 원심분리(1,500 rpm, 10 분) 하였다. 상층액에 실리카 겔(Silica gel 60, Merck, Darmstadt, Germany) 40 g과 잘 섞은 후 용매를 기화(실 온에서 10시간 동안)시켜 분말 상태로 건조시켰다. 추출 물-실리카 겔 분말에 n-Hexane 100 ml과 섞은 후 실리 카 겔 컬럼 충진물 위에 조심히 넣었다. 이동상 용액은 n-Hexane:ethyl acetate 비율이 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 0:10이 되도록 만든 후 순차적으로 컬럼에 흘려주었다. 각 비율의 용액을 500 ml씩 3번 분획(10:0 비율만 500 ml식 2번 분획)하여 회전 농축기(40℃, 80 rpm)로 농축 하여 동결건조시켜 다음과 같은 20개의 분획을 얻었다: 10:0-Ⅰ(F1), 10:0-Ⅱ(F2), 9:1-Ⅰ(F3), 9:1-Ⅱ(F4), 9:1-Ⅲ (F5), 8:2-Ⅰ(F6), 8:2-Ⅱ(F7), 8:2-Ⅲ(F8), 7:3-Ⅰ(F9), 7:3-Ⅱ (F10), 7:3-Ⅲ(F11), 6:4-I(F12), 6:4-Ⅱ(F13), 6:4-Ⅲ(F14), 5:5-Ⅰ(F15), 5:5-Ⅱ(F16), 5:5-Ⅲ(F17), 0:10-Ⅰ(F18), 0:10- Ⅱ(F19), 0:10-Ⅲ(F20). 동결 건조된 각각의 실리카 겔 크 로마토그래피 분획물들(F1~F20)을 DMSO (Sigma)로 20 mg/ml 농도로 녹인 후 13,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리(5415D, Eppendorf, Hamburg, Germany)하여 상층액 을 취하여 다음 실험에 사용하였다.

세균 및 세균배양

본 연구에 사용된 S. mutans ATCC 25175^T, S. sobrinus ATCC 33478^T, P. gingivalis ATCC 33277^T, P. intermedia ATCC 25611^T, T. denticola ATCC 35405^T 및 A. actinomycetemcomitans ATCC 33384^T 균주들은 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

연쇄구균들은 Todd Hewitt (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) 액체배지 또는 한천배지를 이용하여 37℃ 세균배양기에서 1-2일간 배양하였다. A. actinomycetemcomitans는 0.6% yeast extract, 5% horse serum, 75 mg/ml of bacitracin, and 5 mg/ml of vancomycin (Sigma)이 첨가된 tryptic soy broth (TSB, Becton, Dickinson and Company) 배지에서 배양하였다. T. denticola 균주는 1494 modified NOS medium (ATCC) 을 이용하여 배양하였다. P. gingivalis 및 P. intermedia 균주들은 TSB에 0.5% yeast extract, 0.05% cysteine HCl-H₂O, 0.5 mg/ml hemin 및 2 μg/ml vitamin K1이 첨 가된 배지에 배양 하였다. 연쇄구균을 제외한 모든 세균 들은 85% N₂, 10% CO₂, 5% H₂가 공급되는 37℃ 혐기 성 세균배양기(Bactron I, Sheldon Manufacturing Inc., Cornelius, OR, USA)에서 배양하여 다음 실험에 사용하 였다.

최소살균농도 측정

황련의 메탄올 추출물 원액과 실리카 겔 크로마토그 래피에서 얻은 분획물의 뮤탄스 연쇄구균 및 그람 음성 치주질환 원인균에 대한 항균능을 알아보기 위한 최소 살균농도 값은 앞선 연구에서 기술된 액체배지를 이용 한 미세희석(micro-dilution) 방법을 약간 변형하여 측정 하였다[18]. 이를 간략히 설명하자면, 각각의 세균 균주 에 맞는 액체배지 및 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 파장 595 nm에서 배양액의 흡광도를 측정한 후 세균이 1×10⁴ CFU/㎖가 되도록 균주 각각의 배지로 희석하여 100 μl씩 96 well plate에 넣었다. 실리카 겔 그로마토그 래피 분획물이 20 mg/ml이 되도록 DMSO (Sigma)로 녹 였다. 이들을 다시 각각의 세균 배지로 200 μg/ml이 되 도록 희석하고, 이들을 다시 2배씩 순차적으로 배지를 이용하여 희석한 다음, 앞서 96-well plate에 세균을 분주 한 well에 100 ㎕씩 분주하여 세균 배양액에 크로마토그 래 분획물의 농도가 100, 50, 25, 12.5, 6.3, 3.2 μg/ml인 조건이 되도록 하여 뮤탄스 연쇄구균의 경우 24시간, 나 머지 혐기성 그람 음성 세균의 경우 48시간씩 각각의 성장 조건에서 배양하였다. 위의 세균배양액에서 10 μl 를 취하여 10²배 희석한 뒤 각각의 세균에 적절한 한천 배지에 도말하여 37°C에서 48 시간 동안 배양한 뒤 군 락이 형성되지 않은 최소 농도를 최소살균농도로 결정 하였다. 각 반응은 3회 반복하여 모두 일치하는 농도를 선택하였다.

황련 메탄올 추출물의 세포 생존율 평가

세포 생존율 평가를 위해 KB 세포주를 이용하였으며, 이는 ATCC에서 구입하였다. KB 세포주는 Modified Eagles Medium (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)에 10% Fetal Bovine Serum (Gibco BRL)과 1% Antibiotic-Antimycotic (Gibco BRL)이 혼합된 세포배양액 을 이용하여 37˚C에서 5% CO₂가 첨가되고, 100% 습도 가 유지되는 세포 배양기에서 배양하였다[18].

황련의 메탄올 추출물 원액과 항균활성을 보이는 실리 카 겔 크로마토그래피 분획물의 KB 세포주에 대한 세포 생존율을 알아보기 위하여 앞선 연구에서 기술된 방법대 로 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide, a tetrazole) 분석법을 이용하여 측정하였다[9]. 이 때 사용된 황련 메탄올 추출물 원액의 농도는 2, 1, 0.5, 0.25, 0.13 mg/ml이었으며, 11번째 실리카겔 크로마토그래 피 분획물의 농도는 100, 50, 25, 12.5 μg/ml이었다.

결 과

뮤탄스 연쇄구균(S. mutans ATCC 25175^T와 S. sobrinus ATCC 33478^T)에 대한 황련 메탄올 추출물의 실리카 겔 크로마토그래피하여 얻은 분획물의 항균활성을 최소살 균농도 값 측정으로 알아본 결과 F11과 F12 분획물이 가장 좋은 항균활성을 보였다(Table 1). F10 분획물의 경 우 S. sobrnus ATCC 33478^T에서만 본 실험에서 실험한 농도 안에서 최소살균농도 값을 가졌다(Table 1). 황련 메탄올 추출물 원액에 대한 뮤탄스 연쇄구균의 최소살 균농도 값은 선행연구에서 얻은 결과이다[19].

황련 메탄올 추출물 원액과 실리카 겔 크로마토그래 피 분획물들의 4종 치주질환 원인균(P. gingivalis ATCC 33277^T, P. intermedia ATCC 25611^T, T. denticola ATCC 35405^T 및 A. actinomycetemcomitans ATCC 33384^T)에 대 한 항균능 결과는 Table 1과 같았다. 황련 메탄올 추출 물 원액의 경우 A. actinomycetemcomitans ATCC 33384^T 를 제외한 3 종 치주질환 원인균에 대해서 250-1,000 μ g/ml 범위에서 최소살균농도 값을 가졌다(Table 1). 실리 카겔 크로마토그래피 분획물들 중에서 F11 분획물이 가 장 좋은 항균능을 가졌으며, 이때 6.25-12.5 μg/ml 범위 에서 최소살균농도 값을 보였다(Table 1). 또한 F10, F12 및 F13 분획물들도 1균주 이상의 치주질환 원인균에 대 해 50 μg/ml 이하의 농도에서 최소살균농도 값을 보였 다(Table 1).

본 연구에서 사용된 균주에 대한 항균 활성을 갖는 황련 메탄올 추출물 원액 및 가장 항균능이 좋은 F11 분획물의 세포 독성을 KB 세포주를 이용하여 MTT 분 석법으로 조사 하였다(Fig. 1). 그 결과 황련 메탄올 추 출물 원액은 0.13-1 mg/ml 농도에서 72.8-86.2%의 세포 생존율을 보였다. F11 분획물의 경우, 100 μg/ml 농도에 서도 KB 세포의 생존율이 96.7%로 세포 독성이 거의 없는 것으로 조사되었다.

고 찰

본 연구 결과, 황련 메탄올 추출물 실리카 겔 크로마 토그래피 F11 (n-hexane : ethly acetate 비율이 7:3-Ⅲ) 분 획물이 본 연구에서 사용된 6균주의 뮤탄스 연쇄구균 및 치주질환 원인균에 대하여 6.25-50 μg/ml 범위에서 항균능을 가졌다(Table 1). 또한 F11 실리카 겔 크로마토 그래피 분획물은 100 μg/ml 농도까지 KB 세포주에 대 한 세포 독성이 거의 없었다(Fig. 1).

최근 황련의 물 추출물 62.5 mg/ml 농도에서 S. mutans (ATCC 25175^T 및 CCRC 10793), Streptococcus sanguinis (ATCC 49259 및 CCRC 15273) 및 P. gingivalis (ATCC 33277^T 및 CCRC 14417) 등의 구강 세균 균주들 이 100% 성장이 억제됨이 보고되었다[16]. 하지만, 본 연구를 제외하고는 황련 물 또는 메탄올 추출물에 대한 구강 세균에 대한 항균능을 조사한 연구는 없는 실정이 다. 이러한 이유는 현재까지는 확실하지 않지만, 황련이 항균 기능보다는 항염 기능에 맞추어서 많이 사용되었 기 때문이라 생각된다[15,16].

선행 연구에서 황련 메탄올 추출물 원액의 55 균주의 뮤탄스 연쇄구균(S. mutans ATCC 25175^T, S. sobrinus ATCC 33478^T및 한국인 구강에서 얻은 39 균주의 S. mutans와 14 균주의 S. sobrinus)에 대한 최소살균농도 값을 구하여 균주에 따른 항균능 차이를 조사하였다 [19]. 그 결과 한국인에서 분리동정된 S. mutans 및 S. sobrinus 균주들은 각각 90% 및 13.3%가 각각의 표준균 주들인 S. mutans ATCC 25175^T 및 S. sobrinus ATCC 33478^T들보다 황련 메탄올 추출물 원액에 대해서 더 높 은 최소살균농도 값을 보였다[19]. 또한 한국인 구강에 서 얻은 S. mutans (39 균주)와 S. sobrinus (14 균주)에 대한 최소살균농도 값도 각각 0.125-1 mg/ml 및 0.25-1.0 mg/ml 범위를 보였다[19]. 이는 같은 종(species)에 속하 는 균주라도 황련 메탄올 추출물에 대한 저항성이 매우 다를 수 있다는 것을 의미한다. 아직 서양인에서 분리 동정된 많은 뮤탄스 연쇄구균 균주들에 대한 황련을 포 함한 여러 천연물의 메탄올 추출물에 대한 항균능을 조 사해 보지 않았지만, 숙주 인종에 따른 분리된 균주들의 천연물 추출물의 항균능도 차이가 있을 것으로 생각된 다. 이러한 결과를 토대로 한국인을 대상으로 사용할 구 강위생용품 개발 시 사용될 항균물질들의 항균능 비교 와 적정 농도를 정하기 위한 세균모델시스템이 소개되 었다[19]. 그러므로 차 후 연구에서 세균모델시스템을 이용하여 본 연구에서 얻은 항균능이 가장 뛰어난 황련 메탄올 추출물의 실리카 겔 크로마토그래피 분획물인 F11의 치아우식증 예방을 위한 구강위생용품 개발 시 적정 농도를 결정하는 실험이 필요하리라 생각된다. 또 한 F11 분획물의 치주질환 예방을 위해 항균물질로 사 용하기 위해, 세포 독성이 없으면서 한국인에서 분리 동 정된 여러 치주질환 원인균에 대한 항균능을 갖는 적정 농도도 측정하여야 할 것이다.

이상의 연구결과들을 종합할 때, 황련 메탄올 추출물 크로마토그래피 분획물 F11은 50-100 μg/ml 농도로 치 아우식증 및 치주질환 예방 목적으로 사용될 치약 및 구강양치용액 등의 항균 성분으로 이용 가능할 것으로 생각된다.