서 론

삼차신경 척수감각핵은 구강 악안면 영역으로부터의 무수 신경섬유(C섬유)와 직경이 얇은 유수 신경섬유(Aδ 섬유)의 구심성 신호를 받고 있어서 유해성 정보를 전 달하는데 1차적 중계역할을 하는 곳으로 알려져 있으며, 척수후각(spinal dorsal horn)과 유사한 점을 많이 가지고 있어 연수후각(medullary dorsal horn)이라고도 표현한다 [1,2].

활성산소종(reactive oxygen species; ROS)은 과산화수소 (H₂O₂), superoxide 음이온(O₂^·−), 수산기(hydroxyl radical; ·OH), 산화질소(NO), 과산화질산염(peroxynitrite; ONOO⁻) 등을 포함하는데 조직손상이나 증가된 유해반응과 관련된 다[3-6]. 활성산소는 superoxide dismutase나 catalase, glutathione peroxidase와 같은 내재성 항산화 활성에 의해 정밀하게 조절 된다[7]. 그러나 활성산소의 생성이 증가하 거나 항산화 방어가 감소하면 산화자극을 유발하게 되고 [8], 이는 세포내 단백질, DNA, 지질 등의 손상을 초래 한 다[9,10].

신경조직에서 ROS는 다양한 경로를 통해서 얻어지는 데 미토콘드리아의 산화적 인산화반응 과정에서 O₂^·−의 생성, xantine dehydrogenase에서 xantine oxidase로의 전 환, NO synthease 활성에 의한 NO 생성 등으로부터 얻 어진다[11,12]. 이 과정 중에서 가장 대표적인 경우는 미 토콘드리아의 전자전달계(electron transport complex;ETC) 과정 중 complex I과 III에서 O₂^·−를 방출하는 것이다 [13].

척수후각 뉴론의 미토콘드리아에서 발생된 ROS가 통 증조절에 관여한다는 연구가 최근에 보고되고 있는데, 척수신경을 결찰하여 신경병증성 통증을 유발시킨 흰쥐 와[14] 피부내 capsaicin 투여로 통증을 유발시킨 생쥐에 서[15] 척수후각 뉴론의 미토콘드리아에서 superoxide가 증가됨이 관찰되었고, 척수에 전자전달계 억제제 투여에 의해 superoxide의 증가와 통증 행동반응의 증가를 나타 냈다[12]. 또한 superoxide dismutase (SOD) 유사물질인 4- hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMPOL) 처치 에 의해 몇 가지 만성통증 모델에서 통증을 감소시켰는 데 [16-18], 이는 척수후각 뉴론으로부터 발생된 O₂^·−가 만성통증을 발생시키는데 주요한 발생원이며 그것의 감 소가 통증을 억제시켰다고 생각할 수 있다.

이와 같이 통증과 미토콘드리아에서 발생되는 ROS와 의 밀접한 관련성이 있음에도 불구하고 현재까지는 주 로 항산화제나 미토콘드리아 억제약물을 사용하여 그 작용기전을 탐구하는 연구가 주로 시행되었으며, 직접적 으로 미토콘드리아에서 ROS 발생을 확인하는 연구는 드문 실정이었다. 따라서 이 연구에서는 미토콘드리아 전자전달 복합체의 기질이 실제로 ROS를 발생시키는가 를 확인하고 이것이 통증을 유발하는지를 알아보고자 악안면 통각전달에 일차적 중계역할을 하는 삼차신경 척수감각핵 미측소핵 세포에서 전자전달계 작용약물의 반응을 patch clamp방법과 공초점 현미경을 이용하여 조 사하였다.

재료 및 방법

뇌절편 제작

생후 13일-18일 된 Sprague-Dawley 흰쥐를 암수 구별 없이 사용하였으며, 이 연구는 원광대학교 동물실험 윤리 위원회에서 승인을 얻었다. 흰쥐를 ether로 마취한 후 단 두하여 소뇌와 뇌간부위를 적출하여 0-4℃의 Na⁺의 농도 를 낮춘 절단용액에 넣은 다음 순간접착제 (cyanoacrylate adhesive)를 이용하여 뇌조직을 고정시켰다. 95% O₂-5% CO₂를 공급하면서 조직절편기 (vibratome 752M, Campden, UK)를 이용하여 삼차신경 척수감각핵 미측소핵 부위를 150-350 ㎛ 두께로 관상면 절단하여 뇌절편을 만들었다. 절단 중 계속 온도 조절기(model 765, Campden)를 이용하 여 용액의 온도를 1-2 ℃ 정도로 낮게 유지 시켰다. 뇌절 편은 32℃의 인공 뇌척수액 용액에 1시간 정도 보관하여 정상상태로 회복시켰고, 이후에 실온에서 실험을 시행하 였다. 기록은 뇌절편을 현미경위의 기록용기(1 ㎖)에 옮 긴 후 치실로 만든 그물로 움직이지 않도록 고정한 후 시 행하였고, 실험기간 동안 계속해서 95% O₂-5% CO₂가 포 함된 용액을 관류펌프(Minipuls 3, Gilson, France)를 이용 하여 관류시켰다(2-3 ㎖/min).

실험용액

뇌절편 제작에 사용했던 절단용액의 조성은 252 mM Sucrose, 2.5 mM KCl, 0.1 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM glucose, 26 mM NaHCO₃, 1.25 mM NaH₂PO₄ 등으로 구성되었으며, 막전압을 기록하기 위한 세포외 용액의 조성은 117 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.5 mM CaCl₂, 1.2 mM MgCl₂, 1.2 mM NaH₂PO₄, 25 mM NaHCO₃, 11 mM glucose 이었고 95% O₂-5% CO₂를 공급하여 pH를 7.4로 유지하였다. 세포내 용액은 150 mM K-Glu, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0.1 mM EGTA, 5 mM MgATP, 0.3 mM Na GTP를 사용하였고, pH는 KOH를 첨가하여 7.3 으로 조정하였다.

실험에 사용한 malate, succinate, N-tert-butylnitrone (PBN), 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMPOL) 등은 Sigma 사 (St Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 2′,7′ -dichlorofluorescin diacetate (H₂DCF-DA), dihydroethidium (DHE), MitoTracker Red CMXRos는 Molecular Probes 사 (Eugene, OR, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포에 대 한 실험용액의 적용은 중력을 이용한 관류장치(BPS-4SG, Ala Scientific Instruments, Farmingdale, NY, USA)를 이용하 여 기록용기 내 용액을 교환하였다.

전기생리학적 기록방법

막전압과 전류의 기록은 whole cell patch clamp 방법을 사용하였다. 미세 유리전극 제조기(PP-830, Narishige, Japan)와 microforge (MF-830, Narishige)를 이용하여 외경 1.5 mm의 연질 유리미세관(TW150-3, WPI, Sarasota, FL, USA)을 저항이 5-8 ㏁이 되도록 기록전극을 제작하였다. 10배의 대물렌즈로 삼차신경 척수감각핵 미측소핵 부위 를 확인한 후 전극에 양압을 가하면서 미세 전극조절기 (ROE-200, Sutter, Novato, CA, USA)를 이용하여 30° 경사 를 유지하면서 세포에 접근하였다. Seal test를 시행하면서 세포에 접근하여 피펫의 저항이 순간적으로 증가하는 것 으로 세포에 근접함을 확인한 후 양압을 풀고 음압을 가 하여 세포와의 gigaohm seal을 이루었다. Gigaohm seal을 이룬 후 10-20분 경과하여 막전압이 -45 mV 이하로 안정 되었을 때 기록을 시작하였다. 전압 측정에는 Axopatch 200B 증폭기(Axon, Foster City, CA, USA)를 사용하였고, 이 증폭기는 Digidata 1200B (Axon) AD변환기를 통하여 컴퓨터에 연결하였으며, pCLAMP software (version 9.0, Axon)를 사용하여 실험수행의 명령과 얻어진 전기신호의 저장 및 분석에 이용하였다. 발생된 전류는 low pass 8-pole Bessel filter로 2 kHz로 여과하였다. 모든 실험은 실 온에서 시행하였다.

형광이미지 측정

세포내 활성산소 생성 정도는 H₂DCF-DA, DHE assay로 측정하였고, 미토콘드리아 내 활성산소 생성 정도는 MitoTracker Red CMXRos assay로 측정하였다. 150 μm의 뇌절편은 H₂DCF-DA (10 μM), DHE (20 μM), MitoTracker Red CMXRos (100 nM) dye를 넣은 32℃의 세포외 용액에 서 각각 15분, 10분, 30분간 loading 하였다. 이후 뇌절편 은 공초점 레이저 형광현미경 (LSM 510, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 ×400 배율로 관찰 하였으며, excitation 파장은 488 nm (argon laser), emission 파장은 505 nm 이었다. Image time series를 이용하여 30초마다 연 속이미지를 기록하였으며, 약물 투여 후 시간 경과에 따 른 세포 내의 형광 강도 변화를 관찰하였다.

실험자료의 분석

막전압의 분석은 Clampfit (version 9.0, Axon)을 이용 하였고, 세포내 활성산소 생성 정도는 LSM 510 image analysis software (Carl Zeiss)를 이용하였다. 약물처리군 사이에 통계적으로 유의한 차이가 존재하는지의 여부는 independent t-test를 이용하였고 약물처리 전후비교는 paired t-test를 이용하였으며, p<0.05에서 통계적으로 유 의하다고 판정하였다. 통계자료의 값은 평균값±표준오 차 (mean±SEM)로 표시하였다.

결 과

삼차신경 척수감각핵 미측소핵세포 흥분성에 대한 전 자전달 복합체 기질의 효과

삼차신경 척수감각핵 미측소핵 세포의 흥분성에 대한 전자전달 복합체 기질의 효과를 조사하기 위하여 patch clamp 방법을 이용하여 막전압을 기록하였다. 전류고정법 으로 지속적으로 막전압을 기록하면서 복합체 Ⅰ의 기질 로 알려진 malate를 10 mM 투여하였을 때 4.1±0.5 mV (n=18)의 탈분극이 관찰되었고 그 중 일부의 세포에서는 약물투여 후 활동전압이 발생되었으며 이는 약물이 포함 되지 않은 용액으로 처리하였을 때 서서히 원상태로 회복 되었다(Fig. 1A, E). 복합체 Ⅱ의 기질인 succinate 10 mM을 투여하였을 때는 2.7±0.3 mV (n=15)의 탈분극이 발생하였 다(Figs. 1B, E).

주로 O₂^·−에 작용하여 항산화 작용을 나타내는 TEMPOL 과 광범위 항산화제인 PBN을 세포외액에 전 처리한 후 malate를 투여 하였을 때는 malate에 의한 탈분극이 각각 2.8±0.3 mV (n=9, p<0.05)(Fig. 1C, E), 2.1±0.3 mV (n=7, p<0.01)(Fig. 1D, E)로 통계적으로 유의하게 억제되었다.

삼차신경 척수감각핵 미측소핵세포내 활성산소의 확인

Malate 투여가 실제로 세포내 활성산소를 생성하는지 를 확인하기 위하여 공초점 레이저 형광현미경으로 광 범위한 ROS에 반응하는 H₂DCF-DA와 O₂^·−에 특이적으 로 반응하는 DHE의 형광강도를 측정하였다. H₂DCF-DA (10 μM)와 DHE (20 μM)로 loading된 뇌절편에 5분간 malate (10 mM)을 관류하였을 때 각각 147.2±9.5% (n=7, p<0.01), 125.8±7.0% (n=7, p<0.05)로 형광강도가 유의하 게 증가하였고, 약물이 포함되지 않은 용액으로 재관류 시 원래 상태로 회복되었다(Figs. 2A, B, C).

항산화제가 malate의 O₂^·−생성을 억제할 수 있는지를 확인하고자 DHE가 포함된 세포외 용액에서 뇌절편을 10분간 loading한 후 기록하였다. PBN을 전처리 하였을 때 형광강도는 크게 감소하였으며 전처리후 malate에 의 한 형광반응의 증가는 관찰되지 않았다(n=5, p<0.01) (Figs. 2D, E, F).

Malate에 의한 미토콘드리아 내 활성산소의 발생

미토콘드리아 전자전달계 기질로 알려진 malate가 실제 로 미토콘드리아 내 활성산소를 생성하는지 확인하기 위 하여 미토콘드리아 내 활성산소를 측정하는 탐식자 CMXRos를 사용였다. DCF (10 μM)와 CMXRos (100 nM) 로 이중형광염색을 실시하여 malate를 투여한 결과 각각 175.7±9.6% (n=6)(p<0.01), 160.0±11.9% (n=6)(p<0.05)로 형 광강도가 유의하게 증가하였고, 형광강도 증가부위가 겹 치는 형태를 나타내었다(Fig. 3). 따라서 malate에 의한 흥 분성의 증가는 미토콘드리아 내 전자전달 과정 중 발생된 활성산소종에 의하여 발생하였음을 확인하였다.

고 찰

ROS는 조직손상이나 증가된 유해반응에 의하여 세포 내에서 증가하여 세포독성을 일으키고 세포죽음과 관련 되며, 여러 가지 생리적 기능을 조절하는 세포조절물질로 서의 역할도 보고되고 있는데[19-21], 최근에는 ROS가 통 증발생에 관여한다고 보고되었다[6,16]. 신경조직에서 ROS는 다양한 경로를 통해서 얻어지는데 가장 대표적인 경우는 정상적인 대사과정 동안에 미토콘드리아의 전자 전달계(electron transport complex; ETC)에서 발생되는 것 이다[13,22]. 미토콘드리아의 전자전달계는 I-V 복합체로 구성되는데, I 복합체는 NADH oxidoreductase라고 하고 glutamate, pyruvate, malate가 기질로 작용한다. I 복합체는 정상 생리적 기능을 유지하고 있을 때 주요한 ROS의 공 급원으로 기질측에 위치한 flavin site와 막간강측에 위치 한 quinone site에서 O₂^·−를 방출한다. II 복합체는 succinate dehydrogenase라고 하며 succinate가 기질로 작용한다 [23,24]. III 복합체는 ROS 발생에 가장 중요한 장소로 막 간강측에 위치한 Qo center와 내막에 위치하여 기질과 접 하고 있는 Qi center로 구성되며 각각 막간강과 기질에 O₂^·−를 방출한다[25,26]. IV복합체는 cytochrome C oxidase 가 매개하고 전자를 전달받아 산소와 결합하여 물을 형성 하며, V 복합체는 ATP synthease를 가지고 있어 막간강측 에 있는 H+ 이온이 기질로 들어올 때 ATP를 생산한다[13].

이 연구에서는 복합체 I, II의 기질인 malate와 succinate 를 처리하여 전자전달계를 활성화 시켰는데 발생된 ROS 는 각각 4.1±0.5 mV, 2.7±0.3 mV의 탈분극을 유발하였고, 탈분극은 약물제거 후 원상태로 회복되는 가역적인 반응 을 보였다(Fig. 1). Malate에 의한 ROS 발생의 확인은 세 포내 활성산소를 측정하는데 일반적으로 사용되는 DCF 와 O₂^·−에 특이적으로 반응하는 DHE[27-29]를 사용하였는 데 malate에 의해 형광 강도가 증가되었고, 약물제거 후 원상태로 회복되었다(Fig. 2). 이는 통증에 관여하는 ROS 의 작용은 영구적인 세포죽음을 일으키는 것이 아닌 정상 적인 세포내 신호조절물질로써의 작용 혹은 경미한 산화 자극에 의한 일시적인 기능변화를 일으킨 상태임을 의미 한다.

Malate에 의해서 발생된 탈분극은 O₂^·−에 작용하여 항 산화 작용을 나타내는 TEMPOL과 H₂O₂, O₂^·−, ·OH 등 광범위한 ROS를 scavenging 할 수 있는 PBN에 의하여 유의하게 억제되었으며(Fig. 1), malate에 의해 DHE 형광 강도의 증가가 PBN에 의해 유의하게 감소하는 것을 확 인하였는데(Fig. 2), 이는 Gwak 등[30]의 척수손상 모델 에서 ROS에 의해 상승된 DHE 형광강도가 PBN에 의해 억제된 결과와 유사하였다.

미토콘드리아 I, III 복합체는 ROS의 주 발생원으로 주로 O₂^·−를 방출한다. 그러나 O₂^·−는 세포막의 투과성이 낮아 미토콘드리아 막간강과 기질에 방출되면 세포질로 의 이동이 쉽지 않아 세포에 영향을 미치기가 어렵다. O₂^·−는 superoxide dismutase에 의해 H₂O₂로 전환되는데 이것은 세포막을 쉽게 확산으로 통과하여 막전압을 변 화시킬 수 있으며[12,13,31], 다른 연구에서도 H₂O₂가 transient receptor potential (TRP) 통로를 활성화 하거나 [32], ATP 민감성 K+ 통로의 열림을 조절하여[33] 막전 압을 변화시킨다고 보고되었다. 이 연구에서도 O₂^·−에 특이적으로 작용하는 TEMPOL에 의한 억제효과보다 광 범위한 ROS를 scavenging 할 수 있는 PBN에 의한 억제 효과가 더 크게 나타난 것은 O₂^·−외에도 H₂O₂, ·OH 등 이 관여하였다는 것을 의미하며, 차후의 연구에서 H₂O₂, ·OH 등이 구체적으로 어떤 기전에 의해 막전압을 탈분 극 시키는지 조사하고자 한다.

레이저를 이용한 공초점 현미경은 세포내 활성산소의 역할을 규명하는데 최근 많이 사용되는데 여러 가지 ROS와 RNS를 특이적으로 탐지할 수 있는 탐식자를 이 용한다. 예를 들면, H₂DCF-DA는 비교적 비선택적인 탐 식자로 세포질, 핵, 미토콘드리아의 활성산소와 반응하 는 것으로 알려져 있다[34]. 이것은 세포내로 확산으로 이동하여 acetate group이 세포내 estrase에 의해 분해되 며 2,7-dichlorofluorescein (H₂DCF)는 세포내에 남아 형광 을 발현한다. 이 염료는 H₂O₂ 뿐만 아니라 O₂^·−, ·OH, NO, ONOO⁻도 탐지한다고 보고되었다[35].

DHE는 세포 내의 O₂^·−을 측정하기 위한 선택적인 탐 식자로, O₂^·−와 만나면 산화하여 ethidium bromide가 된 다. 이것은 H₂O₂에 대해 매우 낮은 민감성을 가지며 ·OH, ONOO⁻ 등과도 잘 반응하지 않는다[36]. 한편, CMXRos (Mitotracker red)는 세포막을 통과할 수 있는 탐식자로 미토콘드리아에 특이적이다. 미토콘드리아는 전자전달 과정 중 O₂^·−을 방출하는데 이것은 망간 O₂^·− dismutase (MnSOD)에 의해 H₂O₂로 전환되고 이어서 NO 와 결합하여 ONOO⁻를 발생시킨다. 따라서 이 탐식자는 ROS와 RNS를 모두 탐지한다고 알려져 있다[34].

Lee 등[37]은 H₂DCF와 mitochondrial ROS marker인 CMXRos를 사용하여 미토콘드리아 내 활성산소 생성을 확인하였다. 이 연구에서도 malate가 실제로 미토콘드리 아 내 활성산소를 생성하는지 확인하기 위하여 DCF와 CMXRos를 이중형광염색하여 실시하였는데, malate 처리 에 의해 형광강도가 증가하였고, 형광강도 증가부위가 서로 겹치는 양상을 확인하였다(Fig. 3). 따라서 malate에 의한 흥분성의 증가는 전자전달계 과정 중 발생된 활성 산소종에 의하여 발생하였을 것으로 생각할 수 있다.

결론적으로 이 연구에서 미토콘드리아에서 발생된 ROS는 삼차신경 척수감각핵 미측소핵 세포를 탈분극 시키는 것으로 보아 악안면 통증전달과정에 흥분적으로 작용하며 이러한 점은 ROS가 이전의 역치하 입력신호 에 대하여 더 쉽게 활동전압을 발생시킬 수 있어 통증 의 전달과정에 중요하게 관여할 수 있음을 시사한다.