서 론
구강 내의 충치나 점막에 생기는 질환을 치료할 때 주로 drilling, 레이저, 클로르헥시딘과 같은 화학치료제 를 사용한다. 하지만 drilling은 진동을 발생시키고[1], 레 이저는 열을 발생시킨다. 이러한 진동과 열은 신경을 자 극시켜 환자에게 고통을 준다. 화학치료제의 경우 기분 나쁜 맛과 착색을 일으킬 수 있다[2]. 또한, 이와 같은 치료법은 주변의 건강한 조직까지 제거하거나 손상을 입힐 수 있다.
플라즈마는 고체, 액체, 기체에 이은 제 4의 상태로 음 전하를 가진 전자와 양전하를 가진 이온으로 분리된 상태 를 말한다. 플라즈마는 산업 분야에서 널리 사용되었는데, 안정적인 저온의 대기압 플라즈마가 개발되었다. 이러한 플라즈마는 조직에 열적 손상, 화학적 손상을 일으키지 않 고 비파괴적이어서 항암, 지혈, 상처치유, 치아미백과 같 은 다양한 biomedicine 연구에 사용된다[3-6].
저온 대기압 플라즈마의 멸균성은 다양하게 연구되었 지만[7,8], 대부분 Streptococcus mutans (S. mutans)나 Escherichia coli (E. coli)에 국한되어왔다. 하지만 본 연 구팀은 구강 내 점막뿐 아니라 치아 표면, 근관에도 적 용이 가능하도록 needle tip을 탈착할 수 있는 플라즈마 장비를 개발하였다. S. mutans는 그람양성균이며, 통성혐 기성으로 산을 매우 많이 생성하고 충치의 주된 균으로 알려져 있다[9]. E. faecalis는 근관치료 실패에 있어 중 요한 요인으로 알려져 있으며[10], 그람양성의 통성혐기 성 균이다. 또한, 최근에는 E. faecalis가 근관 내에서 치 태를 만들 수 있는 잠재력이 있는 것으로 보고되고 있 으며[11], 근관 내 다른 세균에 비해 치료에 대한 강력 한 저항성을 보인다[12]. C. albicans는 구강 내 상주하는 미생물로 기회감염으로 연조직에 질환을 일으킬 수 있 는 효모상균이다[13].
플라즈마에 의해 생성된 O와 OH radical은 멸균에 영 향을 주는 것으로 알려져 있다. 이러한 활성종은 불포화 지방산으로 이루어져 O를 포함한 radical에 민감하게 작 용하는 세포벽을 파괴한다[14]. 그리고 오존보다 높은 살균 효과를 갖는데 이것은 오존보다 높은 산화 전위를 갖기 때문이다[15]. 이러한 활성종에 의한 효과적인 멸 균력 때문에 통증이 없고 비파괴적인 접근이 가능하다.
따라서 이 연구의 목적은 구강과 치근단에 접근이 용 이하도록 새롭게 개발된 잘 구부러지는 needle tip 형태 의 저온 대기압 플라즈마를 이용하여 S. mutans, E. faecalis, C. albicans의 항균력을 알아보는 것이다.
재료 및 방법
플라즈마 장치
본 연구에 사용된 저온 대기압 플라즈마는 low frequency plasma로 석영관이 절연체로 쓰였다. 유동전력 공급 장비를 이용하여 10 kHz의 주파수로 10 kV의 전 압이 가해졌다. 헬륨가스는 2 slm으로 안쪽 관을 통하도 록 하였다. 플라즈마 jet 길이는 약 30 mm였다.
플라즈마 jet의 온도는 수은온도계로 측정하였다. Tip 을 꽂지 않았을 때는 jet의 끝이, tip을 꽂았을 때는 tip 밖으로 나오는 jet의 끝이 온도계에 닿도록 하여 1분에 서 5분까지 1분단위로 측정하였다(Fig. 1).
균주 및 배양
S. muatans (KCTC5365)와 E. faecalis (KCTC 5290)는 Brain Heart Infusion (BHI) broth (Fluka, Swizerland)에서 배양하였 다. C. albicans (KCTC 27242)은 yeast mold (YM) broth (Difco, USA)에서 배양하였다. 3가지 균주 모두 37°C에서 배양되었으며, PBS로 최종 농도가 1ml당 1 x 108 colony-forming units (CFU)가 되도록 희석하였다.
항균효과
항균효과를 관찰하기 위해 한천 배지 위에 각 균을 도말하였다. 도말 후에, 15초, 30초, 60초 동안 needle tip 유무에 따라 플라즈마를 조사하였다. 또한 gas flow의 영향을 알아보기 위하여 플라즈마를 발생시키지 않고 같은 양으로 gas만 주입하였다. 각 실험군마다 플라즈마 를 조사한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 균 이 자라지 않은 clear zone의 지름을 측정하였다.
각 균주의 항균효과를 정량화하기 위해 액체배지에 각 균주를 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 각 균주를 PBS를 이용하여 최종 농도가 1 ml당 1 x 104 CFU가 되 도록 희석하였다. 각 균주를 1분, 3분, 5분 동안 플라즈 마 처리한 후, PBS를 이용하여 1:10 비율로 단계 희석 하여 한천배지에 도말하였다. 도말한 한천배지를 37°C 에서 24시간 배양한 후, 300개 이하의 집락이 형성된 배 지를 선택하여 집락수를 센 다음 희석배율에 따라 계산 하여 각 균주의 생균수를 측정하였다.
또한 S. mutans를 치아 시편 위에 접종하여 항균효과 를 연구하였다. 치아 시편은 경조직 절단기(Struers, Denmark)를 이용하여 3 x 3 x 2 mm로 제작되었다. 이 를 초음파 세척기로 10분 동안 세척한 후, PBS에 담궈 멸균했다. 치아 시편에 1 x 108 CFU인 S. mutans를 5 μl 접종하여, 실온에서 30분간 건조시켰다. 건조 후에 치아 시편 표면 위로 tip을 빼고 플라즈마를 조사하였다. 1, 3, 5분 동안 플라즈마를 조사한 후 치아 시편을 1ml의 PBS에 담궈 충분히 vortexing을 하고 이를 단계 희석하 여 한천배지에 도말하였다. 배지를 37°C에서 24시간 배 양한 후, 집락수를 세어 생균수를 측정하였다.
E. faecalis는 치근단 모형의 레진블럭을 제작하여 항 균효과를 측정했다(Fig. 1B). 레진 블록을 멸균하고 치근 단 부분에 1 x 108 CFU의 농도로 E. faecalis를 5 μl접종 시켰다. 30분간 실온에서 건조시킨 후, 치근단 부분을 파라필름으로 막았다. Tip을 끼워 근관을 통해 치근단에 1, 3, 5분 동안 플라즈마를 처리해주었다. 플라즈마 처리 후에, 파라필름을 떼어내고 근관을 통해 1 ml의 PBS를 흘려보내 치근단 부분으로 나온 PBS를 단계희석하여 아가배지에 도말하였다. 배지를 37°C에서 24시간 배양 한 후, 집락수를 세어 생균수를 측정하였다.
SEM
플라즈마 처리 후에 각 균의 형태 변화 관찰을 위하 여 주사 전자 현미경(S3500N, HITACHI, Japan)을 이용 하였다. 각 균주를 수산화인회석 디스크 위에 5 μl 접종 한 후, 실온에서 30분간 건조시켰다. 플라즈마를 5분간 조사한 후, 각 시편을 2.5% glutaraldehyde에 2시간 30분 동안 처리했다. 그 후 1% osmium tetroxide에 2시간 동 안 처리했다. 각 시편을 단계적으로 에탄올을 통해 탈수 시킨 후 hexamethyldisilasane을 이용해 건조시켜 SEM 관 찰을 하였다. 모든 사진은 시편 위를 무작위로 선택하여 5000배율로 찍었다.
통계
통계는 SPSS (SPSS Inc, USA)를 이용했다. 플라즈마 의 항균효과를 알아보기 위해 one-way ANOVA를 이용 하였고 Bonferroni’s post hoc test로 검증하였다. 대조군 과의 유의율은 95%이다.
결 과
플라즈마 온도
플라즈마의 온도를 측정한 결과 tip을 꽂지 않았을 때 는 1분에서 26.5°C였고 2분 이후로는 27.5°C를 유지하였 다. Tip을 꽂았을 때는 1분 이후로 22°C를 유지하였다 (Fig. 2)
Clear zone 측정법에 의한 항균 효과
S. mutans의 경우, tip을 빼고 플라즈마를 조사한 결과, 플라즈마 jet의 끝이 닿은 지점을 중심으로 15초 조사한 경우 지름 0.3 cm, 30초 조사한 경우 0.4 cm, 60초 조사 한 경우 0.8 cm로 clear zone이 형성되었다(Fig. 3).
E. faecalis의 경우, tip을 빼고 플라즈마를 조사한 결 과, 플라즈마 jet의 끝이 닿은 지점을 중심으로 15초 조 사한 경우 지름 0.3 cm, 30초 조사한 경우 0.5 cm, 60초 조사한 경우 0.6 cm로 clear zone이 형성되었다. 하지만 더 넓은 원 형태로 완전히 균주가 자라지 않았지만 colony 형태를 이루는 부위가 있었다. 이 부위까지 친다 면 15초 조사한 경우 1.1 cm, 30초 조사한 경우 1.5 cm, 60초 조사한 경우 1.7 cm였다(Fig. 4).
C. albicans의 경우, tip을 빼고 플라즈마를 조사한 결 과, 플라즈마 jet의 끝이 닿은 지점을 중심으로 15초 조 사한 경우 지름 0.1 cm, 30초 조사한 경우 0.2 cm, 60초 조사한 경우 0.6 cm로 clear zone이 형성되었다(Fig. 5).
세 균주 모두 tip을 끼웠을 때는 15초, 30초, 60초 모 두 점 형태로 clear zone이 형성되었다. Gas만 흘려보냈 을 때는 tip이 있거나 없을 때 모두 clear zone이 나타나 지 않았다.
희석평판배양법에 의한 항균 효과
S. mutans와 E. faecalis의 경우, tip 유무에 상관없이 플라즈마를 15초, 30초, 60초 조사하였을 때 멸균효과가 99% 이상으로 나타났다. C. albicans의 경우 tip을 꽂지 않았을 때 플라즈마를 15초 조사하였을 경우 90%의 멸 균효과가 나왔고, 30초, 60초에서는 99% 이상의 멸균효 과가 나타났다. Tip을 꽂았을 때는 15초, 30초, 60초 모 두 99% 이상의 멸균효과를 보였다 (p < 0.05) (Fig. 6).
S. mutans를 치아 위에 접종하여 플라즈마를 조사한 결과, 플라즈마를 1, 3, 5분 조사하였을 때 3 log-reduction을 보였 다 (p < 0.05) (Fig. 7A).
E. faecalis를 레진 블록상에서 플라즈마를 조사한 결 과, 플라즈마를 1분 조사하였을 때 약 3 log-reduction을 보였고, 3분, 5분 조사하였을 때 약 4 log-reduction을 보 였다 (p < 0.05) (Fig. 7B).
SEM을 통한 형태관찰
세 균주 모두 대조군에서는 많은 양의 균들이 구형의 형태를 가지고 치아 시편 위에 붙어 있었다. 하지만 플 라즈마를 5분 조사한 시편에서는 균의 수가 현저히 줄 어들어 있었고 균주의 형태도 본래의 형태를 잃고 불규 칙적으로 일그러져 있었다(Fig. 8).
고 찰
S. mutans는 glucosyltansferase (GTase) 라는 효소를 분 비하고 GTase가 음식물 중에 있는 자당을 분해하여 불 용성 글루칸을 형성한다. 글루칸은 구강 내에 있는 다른 세균들과 치아에 부착되어 치면세균막을 생성하고 치주 질환의 원인이 된다[16]. 치주질환의 치료제로는 클로르 헥시딘류, 일불소인산나트륨, 트리메칠렌포스폰산 등 다 양한 성분들이 개발되어 사용되고 있다. 하지만 장기간 사용 시 치아 변색이나 구강 점막 손상 등의 부작용이 발생할 수 있다. 또한 충치 치료 시에 drilling으로 인해 주변의 미생물 제거를 위해 건강한 조직까지 과도하게 제거된다.
근관 내 치료제로는 차아염소산나트륨, 클로르헥시딘, 수산화칼슘이 주로 이용된다[17-19]. 친근단 균인 E. faecalis는 항생 물질에 강력한 저항성을 가지고 있고, 항생물질에 직접적으로 접했을 때 항균작용을 한다. 하 지만 근관의 해부학적 구조에 의해 항생제가 감염부위 에 직접적으로 닿기가 어렵다[20]. 저온 대기압 플라즈 마는 다양한 활성종을 갖는 gas 형태여서 복잡한 근관 의 감염된 부위까지 도달하기 쉽다. 그러므로 근관 치료 의 이상적인 방법이라고 할 수 있다. 기존의 화학적인 항생제와 비교한 연구에서도 플라즈마 조사가 기존의 항생제보다 더 높은 효과를 나타내었다[21].
C. albicans는 정상 세균총으로 구강 내에서 존재하지만 [22], 면역력이 떨어지면 균의 수가 빠르게 증가하여 구강 질환이 발생하게 된다[23]. 이를 치료하는 구강 소독제는 장기간 사용 시 균교대증, 구강건조증과 같은 부작용이 있을 수 있다. 최근 연구에 따르면 저온의 대기압 플라즈 마 장치가 기존의 구강소독제에 비해 살균력이 효과적이 라는 것이 보고되고 있다[24,25]. 본 연구 결과 플라즈마 를 이용한 S. muatans, E. faecalis, C. albicans의 멸균력을 측정한 결과 세 균 모두에서 99%의 사멸율을 보였으며, 치아나 근관을 재현한 레진 블록상에서도 3-log reduction 이상의 높은 살균력을 나타내었다.
플라즈마와 비교할 수 있는 레이저의 가장 큰 단점은 온도이다. 이는 만성적인 동통을 증가시킨다. 레이저를 치아에 적용할 때 온도 상승을 낮추는 방법은 물로 식 혀주는 것이다. 하지만 플라즈마는 저온이며 물을 뿌려 주는 것과 같은 부가적인 술식이 필요하지 않다. 본 연 구에 사용된 플라즈마의 온도를 측정한 결과 실온과 비 슷한 온도로 유지하면서 조직에 전혀 손상을 입히지 않 는 온도를 오랫동안 유지하였다. Tip을 꽂았을 때는 온 도가 더 낮음을 볼 수 있었는데 이는 gas가 좁은 tip을 통과하면서 온도를 더 낮춘 것으로 보인다. 또한 레이저 는 직진성을 가지며 고출력 레이저는 치아에 금이 가게 하고[26], 레이저 빔에 의해 눈에 damage를 입힐 수 있 다. 하지만 본 연구에 사용된 플라즈마 jet은 화학적 손 상이 없고 조직에 비파괴적이며, tip에 의해 유연하게 조절할 수 있어 구강 적용에 적합하다.
임상적으로 항균작용이 화학적인 것인지, 열에 의한 것인지 구분하는 것이 중요하다. 치아에 열적인 피해는 피해야한다. 치아는 5.5°C 이상의 열을 받았을 때 15% 정도 치수 괴사가 일어나고, 11°C 이상 열을 받았을 때 60%에서 치수괴사가 일어난다[27]. 하지만 플라즈마는 상온에 가깝게 유지되고 화학종은 상대적으로 짧은 lifetime을 가지기 때문에 치료가 완료된 후에 남지 않는 다. 따라서 조직에 열적인 손상과 통증을 주지 않는다 [28]. 또한 플라즈마에 의해 생성된 항균물질은 금이나 fissure, pit과 같은 불규칙한 구조에서 퍼지므로 복잡하 고 굴곡이 많은 구강구조에 적용하기 적합하다[7].
플라즈마의 멸균은 주로 UVB와 UVC 범위의 활동적 광자와 O, OH와 같은 short-living 활성종, 오존, 전자와 이온과 같은 대전종(charged species)에 의해 이루어진다 [29]. 플라즈마에 조사받은 미생물은 활성종에 의해서 빠르게 회복될 수 없도록 세포벽을 자극받는다[30]. 이 러한 세포벽의 변화는 직접적으로 세포의 DNA에 영향 을 미치게 되고 세포는 사멸하게 된다. SEM 결과에서 나타나듯이, 플라즈마를 조사하였을 때 원래의 구형의 형태를 잃고 일그러지거나 세포벽이 터진 것과 같이 보 였다. 본 연구에서의 멸균은 UV 원자의 경우 대기압에 서 쉽게 흡수되므로[29] 산소원자와 OH radical, 세포막 을 붕괴시키는 정전기적 과정이 관여한 것으로 보인다 [31,32].
이번 연구에 사용된 플라즈마 장비는 pit, fissure 뿐만 아니라 좁고 굽은 형태의 근관에도 잘 적용이 되도록 탈부착이 가능한 flexible한 tip이 이용되었다. 치아 표면 이나 구강 점막에 사용될 때는 tip을 빼고, 치간이나 근 관에 사용될 때는 tip을 꽂아서 쓰도록 하였다. 플라즈 마는 항균 작용뿐 아니라 치아 미백, 상처 치유, 지혈, 구강암사멸[3-6] 등에도 활발히 연구되고 있으므로 복합 적으로 사용이 가능한 획기적인 장비가 될 것이다.
