서 론

Prevotella intermedia는 그람 음성 혐기성 간균으로 치 주질환의 원인균 중 하나로 잘 알려져 있다. 실제로 P. intermedia는 성인성 치주염, 임신성 치은염, 급성괴사성 궤양성치은염(acute necrotizing ulcerative gingivitis) 및 HIV 연관성 치은염 등에 이환된 환자의 치은연하부위에서 빈 번하게 검출되고 있으며, 구강 농양 병소에서도 검출됨이 보고되었다[1-3]. 최근 한국인의 치은염 환자를 대상으로 연구 결과에 의하면, P. intermedia가 치은연하 치면세균 막에 존재할 경우 비외과적 치료 후 예후가 좋지 않다는 보고가 있다[4]. P. intermedia가 치주질환을 유발시키는 데 있어서 중요한 독성인자로는 구강 상피세포에 침입[5], 내독소[6], succinate, isobutyrate, isovlerate 및 ammonia 등 과 같은 독성 대사산물[7], 용혈소 및 적혈구 응집소[1] 등 이 있다.

치주질환의 병인론 연구를 위한 선행 연구로써 치주질환 과 밀접한 원인균종을 찾는 역학연구가 선행되어야 한다. 치주질환과 밀접한 관련이 있는 세균 종을 찾는 분자역학 연구를 수행하기 위해서는 많은 수의 샘플에서 세균 종을 신속 정확하게 검출할 수 있는 방법이 있어야 한다. 현재까 지 개발된 여러 세균 검출법들 중에서 가장 신속 정확하고, 민감도가 높으며 정성 및 정량적 방법이 가능한 방법은 실 시간 중합효소연쇄반응법(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR) 이라 할 수 있다. 최근 본 연구자 팀은 DNA-dependent RNA polymerase beta-subunit 유전자 (rpoB) 핵산염기서열을 바탕으로 42종 구강 세균 종에 대한 종-특 이 qPCR 프라이머 쌍들을 개발하여 소개하였다[8]. 그 논문 에서 소개된 P. intermedia 종-특이 qPCR 프라이머 쌍인 Pi-F4와 Pi-R4는 75종(P. intermedia 포함) 구강 세균 표준균 주와 P. intermedia를 포함하여 종-특이성 검사를 시행하여 P. intermedia 균주들(ATCC 25611^T와 ATCC 49046)의 지놈 DNA에서 PCR 산물이 증폭되었다. 하지만, 본 연구자팀의 후속 연구 과정 중 Pi-F4와 Pi-R4 프라이머 쌍은 한국인에서 분리동정된 P. intermedia 임상균주의 일부를 검출하지 못함 을 알게되었다. 그러므로 본 연구는 rpoB 핵산염기서열을 바탕으로 P. intermedia 임상균주들까지 검출이 가능한 개선 된 P. intermedia 특이적 qPCR 프라이머를 개발하기 위하여 시행하였다.

재료 및 방법

세균 및 세균 배양

본 연구에서 사용된 표준 균주들은 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, Biological Resource Center, Korea), CCUG (Culture Collection, University of Göteborg, Sweden) 및 ATCC (Type Culture Collection, USA)에서 구입 하여 사용하였다(Table 1). 또한 한국인유래 P. intermedia 임상균주들은 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology, Gwangju, Korea)에서 분양받아 사용 하였다.

Enterococcus spp., Streptococcus spp. 및 Neisseria spp. 균주 들은 brain heart infusion (BHI, Difco Laboratories, Spark, MD, USA) 배지를 이용하여 37°C 호기성 세균배양기(Thermo Forma, Waltham, MA, USA)에서 배양하였으며, A. actinomycetemcomitans 균주들은 tryptic soy broth (TSB, Difco Laboratories)에 0.6% yeast extract, 5% horse serum, 75 μg/ml bacitracin 및 5 μg/ml vancomycin (Sigma, St. Louis, MO, USA)이 첨가된 배지에, 그외 균주들은 TSB에 0.5% yeast extract, 0.05% cysteine HCl-H₂O, 0.5 mg/ml hemin 및 2 μg/ml vitamin K₁가 첨가된 배지에 85% N₂, 10% CO₂, 5% H2가 공급되는 37°C 혐기성 세균배양기(Bactron I, Sheldon Manufacturing Inc., Cornelius, OR, USA)에서 배양하였다.

qPCR 프라이머 설계 및 종-특이성 검증

P. intermedia의 rpoB 핵산염기서열(GenBank accession no. JX480867)을 바탕으로 PrimerSelect 프로그램 (DNASTAR Inc., USA)을 이용하여 qPCR 프라이머를 설 계하였으며 다음과 같다; RTPi-F2, 5′-ACC CAT TGG CAG AAG TTA CG-3′; RTPi-R2, 5′-TCA ATA GGA CAC AAG CGA CCA TAG-3′. 예상되는 PCR 증폭물의 크기는 130 bp이다. 이때 설계된 primer 쌍은 Bioneer 사 (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 제작하였다.

세균의 지놈 DNA들은 CTAB 방법에 따라 추출하였다[9]. qPCR 프라이머(RTPi-F2/RTPi-R2)의 P. intermedia에 대 한 종-특이성 검증은 일반적인 PCR법을 이용하였으며, Bioneer 사(Korea)의 AccuPower^® PCR PreMix (Bioneer) 및 MyGenie^TM 96 Gradient Thermal Block을 사용하여 제 조회사에서 제시한 방법으로 실시하였다. 이때 PCR 반 응 용액의 RTPi-F2와 RTPi-R2 프라이머들은 각각 최종 1 pmole/μl 씩 넣었으며, 세균 지놈 DNA들은 각각 2ng 을 넣어서 반응을 시켰다. PCR 반응 조건은 95°C에서 10분간 전변성 처리하였고, 95°C에서 10초간 변성, 60°C 에서 20초간 결합, 72°C에서 20초간 중합 과정을 30회 시행하고, 72°C에서 5분간 최종 중합과정을 시행하였다. PCR이 끝난 후 PCR 반응물 중 5 μl를 1.5% 아가로스 젤을 매질로, Tris-acetate buffer (0.04 M Tris-acetate, 0.001 M EDTA, [pH8.0])를 전해질로 사용하여 100V에서 15분간 전기영동하였다. 증폭물을 GoodView^TM Nucleic Acid Stain (SBS Greetech, Beijing, China)으로 염색하여 UV transilluminator로 PCR 증폭 여부를 확인하였다.

qPCR

qPCR은 AccuPower^®GreenStar^TM qPCR PreMix (Bionner, Korea) 및 Exicycler^TM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(Bionner)을 이용하여 실시하였다. PCR PreMix에 RTPi-F2와 RTPi-R2 프라이머 각각 60 pmoles와 세균 유전체 40 ng에서 4 fg까지 10배씩 희석된 양을 각각 PCR tube에 넣고, DEPC water를 첨가하여 최종 반응물이 50 μl가 되도록 한 후 voltexing하고, 2,500 rpm에서 10초간 원심분리 하였다. qPCR 조건은 95°C에서 10분간 전변성 과정을 거친 후 95°C 에서 10초간 변성, 60°C에서 20초간 결합, 72°C에서 20초간 중합 과정을 40회 반복하였으며, 60~94°C에서 1°C씩 1초간 스캔하여 melting curve를 분석하였다.

결 과

일반적인 PCR법으로 P. intermedia의 검출을 위해 설계 된 qPCR 프라이머(RTPi-F2/RTPi-R2)의 종-특이성을 조사 한 결과, P. intermedia 균주(표준균주를 포함한 서양인 유 래 2주 및 임상균주 10주)에서만 130 bp의 PCR 증폭물이 확인되었으며, 본 연구에서 사용된 P. intermedia 종이외 의 구강에 존재하는 52종(52 균주) 지놈 DNA에서는 PCR 증폭물이 확인되지 않았다 (Fig. 1).

본 연구에서 설계된 qPCR 프라이머 쌍(RTPi-F2/ RTPi-R2) 의 최소검출한도를 측정하기 위해 P. intermedia ATCC 25611^T의 유전체 DNA를 40 ng부터 4 fg까지 10배씩 희석하 여 qPCR을 수행하였다. 그 결과 RTPi-F2/ RTPi-R2 프라이머 쌍은 P. intermedia ATCC 25611^T 지놈 DNA 40 fg까지 검출할 수 있는 것을 확인하였다(Table 2 및 Fig. 2A).

qPCR 프라이머(RTPi-F2/RTPi-R2)에 의한 비특이적 PCR 산물 유무를 검증하기 위해 melting curve 분석을 실 시한 결과, melting curve가 단일한 패턴을 보여 비특이적 PCR 산물이 증폭되지 않음을 확인할 수 있었다(Fig. 1B).

고 찰

본 연구 결과 P. intermedia를 종-특이적으로 검출하기 위해 설계된 RTPi-F2/RTPi-R2 프라이머는 qPCR에 의해 P. intermedia 지놈 DNA를 40 fg까지 종-특이적으로 검 출할 수 있음을 알 수 있었다(Table 2 & Fig. 2). P. intermedia ATCC 25611의 세균 지놈 크기가 약 2.57 Mb (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_JAEZ00000000.1) 인 점을 감안하면, RTPi-F2/RTPi-R2 프라이머 쌍은 P. intermedia를 qPCR법에 의해 15 균주에 해당하는 세균 지놈 DNA까지도 검출할 수 있음을 의미한다.

qPCR 프라이머 설계 시 여러 컴퓨터 프로그램을 사 용하는 데, 프로그램에서 제시하는 최적결합온도(optimal annealing temperature)는 실제와는 다른 경우가 많다 [10,11]. 본 연구에서도 PrimerSeclect (DNASTAR Inc.)를 사용하여 얻은 RTPi-F2/RTPi-R2의 최적결합온도는 53. 5°C였지만, 실제 최적결합온도는 60°C였다(data not shown). 즉, P. intermedia와 유전자 수준에서 가장 가까 운 P. nigrescens ATCC 33563^T 균주와 P. intermedia ATCC 25611^T의 지놈 DNA를 이용하여 gradient PCR (결 합온도를 51-62°C 사이에서 1°C 간격으로)을 실시하여, P. intermedia ATCC 25611^T의 지놈 DNA만 검출되는 온 도 중 PCR 증폭물 밴드 진하기가 동일하게 유지되는 온도를 최종 결합온도로 정하였다. 이러한 결과들을 고 려하면, 세균 종-특이 PCR (qPCR 포함) 최적결합온도를 정할 때에는 컴퓨터 프로그램에서 제시해주는 온도보다 는 표적 세균 종 및 그와 가장 유전자 수준에서 가까운 종의 지놈 DNA를 이용한 gradient PCR을 수행하여 얻 는 것이 더욱 효율적이다는 것을 알 수 있었다.

최근 16S ribosomal DNA gene (16S rDNA) 염기서열을 바탕으로 P. intermedia를 종-특이적으로 검출할 수 있는 qPCR 프라이머 쌍이 소개되었다[12]. 그 연구에서 소개된 qPCR 프라이머는 TaqMan 프로브법에 사용하기 위한 것 이었으며, P. intermedia를 10²-10⁷ 마리에 해당하는 지놈 DNA를 10배씩 연속 희석하여 민감도를 측정하였다. 일 반적으로 TaqMan 프로브 법은 qPCR 프라이머와 더불어 종-특이적 프로브를 더 이용하기 때문에 본 연구에서 이 용한 SYBR Green 법에 비해 특이성이 더 좋은 것으로 알 려져 있다. 하지만, P. intermedia, Porphyromonas gingivalis 및 Actinobacillus actinomycetemcomitans 검출을 위한 두 방 법을 비교한 연구 결과에 의하면, 두 방법의 특이성, 정확 성 및 민감도의 차이가 유의성이 없었다[13]. TaqMan 프 로브 법을 수행하기 위해서는 종-특이적 프로브가 필요하 고, 프로브에 6-carboxylfluorescein와 6-carboxytetramethylrhodamine 같은 reporter 및 quencher 염 색물질들이 필요하기 때문에 SYBR Green 법에 비해 번 거롭고 비경제적이다. 그러므로 많은 수의 구강 내 세균 감염성질환 병소 샘플에서 구강 세균 종을 정성 및 정량 적으로 비교하기 위해서는 SYBR Green 법을 이용하는 것이 실용적이라 생각된다.

qPCR 프라이머를 설계하기 위해서는 표적 유전자가 있어야 한다. 현재까지 가장 많이 선호되는 표적 유전자 는 16S rDNA이다. 왜냐하면, 16S rDNA는 세균분류학적 측면에서 기준이 되고, 같은 종에 속하는 균주들간에 상 동성이 잘 보존되어 있으며, 지금까지 알려진 최소한 모 든 세균 종 표준균들의 핵산염기서열이 알려져 있어 프 라이머 제작이 용이 하기 때문이다[14,15]. 하지만 16S rDNA는 세균 종간에 copy 수에 차이가 있기 때문에 임 상 샘플에서 세균 종들의 정량적 비교에는 한계가 존재 한다. 또한, 특정 세균 종들간의 16S rDNA 핵산염기서 열 상동성이 99.9% 이상인 경우가 있기 때문에 종-특이 qPCR 프라이머 설계가 불가능할 경우가 있다[16]. 16S rDNA의 qPCR 프라이머 설계 시 표적유전자로써의 단 점을 보완할 수 있는 표적유전자가 rpoB이다. 즉, rpoB 는 16S rDNA와 같이 세균분류학적 측면에서 세균 종 내 핵산염기서열 상동성이 잘 보존되어 있고, 대부분의 세균들에서 copy 수가 하나이기 때문에 임상 샘플에서 세균 종의 존재 비율을 정량적으로 정확히 비교할 수 있다는 장점이 있다[17]. 하지만, 모든 세균 종 표준균주 들에 대한 rpoB 핵산염기서열이 결정되지 않은 단점은 있다. 그러므로 향 후 모든 세균 종 표준균주들에 대한 rpoB 핵산염기서열이 결정되어 데이터베이스화된다면 16S rDNA를 대신해서 rpoB가 세균 종-특이 qPCR 설계 를 위한 표적 유전자가 될 것으로 생각된다.

이상의 연구결과를 요약하면, 본 연구에서 개발된 P. intermedia 종-특이 qPCR 프라이머(RTPi-F2/RTPi-R2)는 종 특이성 및 균주 15 마리까지 검출할 수 있는 높은 민감도를 갖는 것이 확인되었으며, 향 후 치주질환을 포 함한 구강 내 세균감염정질환의 분자역학 연구에 있어 서 P. intermedia을 종-특이적으로 검출하는 데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각된다.