서 론

Acetylcholine (Ach)은 중추신경계 및 말초신경계에서 작용하는 신경전달물질로서, acetylcholine 수용체(AChR) 를 활성화시킴으로써 다양한 세포활성을 매개한다 [1]. AChR는 크게 nicotinic AChR (nAChR)와 muscarinic AChR (mAChR) 두 종류로 나누어지며, 두 수용체는 신경세포는 물론, 비 신경세포에서 발현되는 것으로 알려져 있다 [2]. 흥미롭게도, 치은 keratinocyte 및 섬유아세포 내 Ach의 합 성 및 분해를 담당하는 효소들이 존재하며, Ach의 분비는 주변 세포 간 autocrine 및 paracrine 방식의 상호작용 매개 가능성을 제기하였다 [3,4]. 구강상피세포 중 keratinocyte 세포에서 외부 nicotine에 의한 nAChR 활성화는 IL-8 발 현 억제를 통해 콜린성(cholinergic) 항염증반응을 매개하 며 [5], α7 nAChR의 활성화는 Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)및 lipopolysaccharide에 의한 염증반응을 억 제함이 보고되었다 [6]. 그러나 현재 치은섬유아세포 내 AChR의 생리활성에 대한 연구는 충분히 이뤄지지 않고 있다.

만성치주염(chronic periodontitis)은 구강미생물 등의 복 합 요인에 의해 치주조직(periodontal tissue) 내 염증반응 이 만성화됨으로써 경조직 파괴를 유발하는 질병으로 잘 알려져 있다. 만성염증에 의한 과도한 면역시스템 활성화 는 파골세포 과분화를 유도하고 결과적으로 치조골 유실 로 이어진다. Receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) 은 활성화된 조골세포로부터 발현되어 파골세포 전구체 로부터 파골세포로의 분화를 유도하는 핵심인자로 최초 보고되었다 [7]. 그러나 이후 골세포(osteocyte), 면역세포, 섬유아세포 등 조골세포 이외 세포에서도 RANKL이 발 현되며 국소적 골 재형성을 조절하는 역할을 수행하는 것 으로 알려지고 있다[8,9,10]. 특히, 치은섬유아세포 및 치주 인대세포가 bisphosphonate 또는 P. gingivalis에 노출되었 을 때 세포 내 RANKL 및 osteoprotegerin (OPG) 발현이 조절된다는 보고가 있으며, 이러한 보고들은 치주조직 내 세포들이 치조골 항상성에 직접적으로 연관되어 있음을 나타낸다 [11,12]. 본 연구에서는 AChR의 활성에 의한 인 체치은세포(human gingival fibroblast; hGF-1) 내 칼슘증가 와 RANKL 발현증가를 나타내고 있다. 따라서 치주세포 내 AChR는 항염증 반응 매개뿐만이 아닌, 치조골 항상성 조절인자로서의 역할수행 가능성을 제시한다.

실험방법 및 실험재료

세포 배양 및 시약

hGF-1 세포는 ATCC (CRL-2014)에서 구입하여 사용하 였으며 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 세포 배양배지에 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin 및 100 IU/ml streptomycin 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 배양하였다. Carbachol (Cch)은 Sigma Aldrich (MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

세포독성 실험

실험 하루 전 96 well plate에 hGF-1 세포를 분주하고(1 x 10⁴/well),다음 날 각 실험군에 지정된 농도의 Cch을 처 리하고 정한 조건에 따라 세포배양기에서 배양하였다. 이 후 세포독성은 Vybrant 세포독성 키트(Vybrant® Cytotoxicity assay kit, ThermoFisher Scientific, MA, USA)를 이용하여 제조사에서 제시하는 실험방법에 따라 세포독성을 확인 하였다. 전 처리 후, 각 샘플의 배양배지를 새로운 well에 옮긴 후, 배양배지 내 존재하는 glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD)의 활성을 resazurin으로부터 생성되 는 resorufln 형광(530/590 nm, Ex/Em)을 측정함으로써 G6PD 분비량(%)을 계산하였다.

세포질 내 칼슘농도([Ca²⁺]_i)측정

hGF-1 세포를 22 x 22 mm 크기의 커버글라스에 분주한 뒤, 다음 날 실험에 사용하였다. 세포배양액에 Fura2/ AM (TEFLabs, TX, USA)를 5 μM의 농도로 첨가한 뒤 세 포배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 이후, 커버글 라스는 용액 관류 챔버(chamber)에 부착되었다. HEPES buffer (mmole/l, 10 HEPES, 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl₂, 1CaCl₂, and 10 glucose, pH7.4, 310 mOsm)를 세포에 지속 적으로 관류시킴으로써 잔류 Fura2를 씻어내고, 세포를 안정화 시킨 뒤 [Ca²⁺]i측정을 시작하였다. 세포 내 칼슘이 온의 농도는 340/380 nm dual wavelength를 이용한 excitation과 그로부터 방출된 형광을 510 nm의 필터를 이 용하여 측정하였다. 각 결과는 Ratio (F₃₄₀/F₃₈₀)값으로 표시 되었다. 각 실험에 사용된 Cch은 HEPES buffer에 희석되 어 표시된 시간 동안 처리되었다.

RT-PCR 및 PCR

6 well plate에 분주 된 hGF-1 세포에 Cch (1 mM)을 처 리한 뒤, 정해진 시간 동안 배양하였다. 다음 날 각 각의 세포로부터 mRNA를 Trizol을 이용하여 추출하였다. 추출 된 mRNA (1 μg)로부터 cDNA를 합성하였으며 각 샘플의 cDNA로부터 primer (IL-6 forward 5'-GAG GCA CTG GCA GAA AAC AA-3', reverse 5'-TTG GGT CAG GGG TGG TTA TT-3'; RANKL forward 5'-GTA CCA TGA TCG GGG TTG GG-3', reverse 5'-CGG ATC CAG TAA GGA GGG GT-3'; GAPDH forward 5'-AGG GCT GCT TTT AAC TCT GGT-3', reverse 5'-CCC CAC TTG ATT TTG GAG GGA-3'; OPG forward 5'-TCA AGC AGG AGT GCA ATC G-3', reverse 5'-AGA ATG CCT CCT CAC ACA GG-3')를 이용하여 유전자 발현의 정도를 확인하였다. 대조단백으 로 GAPDH (house-keeping gene)을 사용하였다.

통계학적 유의성 검사

대조군과 실험군의 통계학적 유의성 검사에는 SPSS 14 (SPSS Inc., IL, USA)을 사용하였다. 통계학적 유의성 검 증을 위해 one-way ANOVA를 실시하였으며, Tukey’s post hoc test로 사후검정을 실시하였다. 통계적 유의성의 표준 값은 P<0.05로 설정하였다. 모든 결과는 독립된 3 이상의 실험들로부터 얻어졌으며, 평균 ± SD로 표시되었다.

결 과

Cch 자극 정도에 따른 hGF-1 세포 내 [Ca²⁺]_i증가

세포 내 칼슘이온은 다양한 생리활성을 유도하는 이차 신호전달자(second messenger)로서 nAChR 및 mAChR의 활성화는 [Ca²⁺]i증가를 유도하는 것으로 잘 알려져 있다[13]. 치은세포 내 AchR의 생리활성을 알아보기 위해 hGF-1 세포에 Cch을 처리하고 세포질 내 칼슘이온의 농 도변화를 측정하였다. Cch은 muscarinic AChR 및 nicotinic AChR를 모두 활성화 시키는 콜린성 작용제(cholinergic agonist)로서, 치은세포 내 AChR 활성화가 [Ca²⁺]_i증가를 유도하는지, 그리고 자극의 정도에 따라 [Ca²⁺]_i증가가 조 절되는지를 확인하고자 1 μM부터 1 mM 농도의 Cch를 hGF-1 세포에 처리하였다. 실험결과, 1 μM Cch 자극에 대해서는 세포 내 [Ca²⁺]_i증가가 관찰되지 않았으나, 10, 100, 1000 μM의 Cch 자극에 따라 이상성(biphagic) 양상의 유의한 [Ca²⁺]_i증가(0.374±0.012, 0.534±0.029, 0.676±0.041, 0.874±0.04)가 확인되었다 (Figure 1).

고농도 Cch 자극에 따른 hGF-1 세포 세포독성 확인

세포 내 칼슘이온은 이차신호전달자로 다양한 생리활 성을 유도하는 반면, 고농도의 지속적 자극에 의한 [Ca²⁺]_i 증가는 미토콘드리아 및 ER 기능이상 및 세포사멸 관련 유전자의 발현을 유도함으로써 세포독성을 나타낸다 [14,15]. hGF-1 세포에의 고농도 Cch 자극에 의한 [Ca²⁺]_i 증가가 세포독성을 유도하는지 확인하기 위하여 세포 내 G6PD의 분비 정도를 측정하였다. hGF-1 세포에 1 mM 농 도의 Cch을 처리하고 Figure 2에 표시된 시간만큼 추가 배양하였다. 세포독성은 대조군과 비교하여 Cch 처리 후 10분, 30분, 1시간에 2.06±0.21, 1.93±0.14, 1.78±0.15배로 증가하였으나, 3시간부터는 차이를 보이지 않았다(Figure 2). 이는, 고농도 Cch 자극에 의한 세포독성이 약 3시간 이후부터, 자극제가 존재함에도 불구하고, 세포 스스로의 (신호전달)억제기전에 의해 조절되고 있음을 나타낸다.

고농도 Cch 자극에 의한 hGF-1 세포 내 골 재형성 관련 유전자 발현

RANKL 및 OPG는 파골세포의 분화를 조절하는 핵심인자로, 파골세포 분화도에 따라 골 재형성 정도가 결 정되는 것은 잘 알려져 있다. 또한, 기존보고들은 조골세 포 외, 특히, 구강상피세포에서 RANKL과 OPG의 발현되 며, 두 유전자 간 발현비율에 따라 치조골 재형성 조절의 가능성을 제시하였다 [10]. 앞선 두 결과는 Cch의 hGF-1 세포 자극은 세포 내 [Ca²⁺]_i증가를 조절하며 장시간 자극 시 세포염증반응이 아닌 다른 생리활성을 유도함을 나타 낸다. 이를 확인하기 위해 hGF-1 세포에 고농도의 Cch를 시간별 처리하고 RT-PCR방법을 통해 RANKL, OPG, IL-6 의 발현 정도를 확인하였다. 실험결과, OPG와 IL-6의 발 현에는 변화가 관찰되지 않았으나, Cch 자극 후 3시간 이 후부터 hGF-1 세포 내 RANKL 발현이 증가됨이 확인되 었다(Figure 3).

고 찰

신경세포는 물론, 비 신경세포 내에도 콜린성 시스템 (cholinergic system)이 존재하며, Ach의 paracrine 또는 autocrine 방식의 세포 간 상호작용은 AChR 활성 매개를 통한 다양한 세포활성을 유도 한다 [4]. 특히, 구강상피세 포 내 nAChR의 활성은 TNF-α, IL-1, IL-6 등의 염증성 싸 이토카인 발현을 매개함으로써 구강 면역 활성을 조절하 는 것으로 보고되었다 [6]. 구강상피세포 내 AChR 활성은 주로 cAMP 생성에 의한 신호전달기전이 주로 알려져 있 으나, 외부 allergen 및 arecoline 자극에 따른 구강상피세 포 활성 보고들은 구강상피세포 내 [Ca²⁺]i증가 및 관련 신호전달기전들의 관련 가능성을 제시하고 있다[16, 17]. Figure 1의 결과는 AChR 자극제인 Cch의 농도에 따라 [Ca²⁺]_i증가 양상이 정확하게 조절되고 있음을 나타내는 결과로, 치주조직 내 신경세포 또는 구강상피세포로부터 발현, 분비된 Ach이 주변 세포 내 [Ca²⁺]_i증가를 매개로 한 세포 간 상호작용의 가능성을 제시한다. 또한, Cch에 의 한 [Ca²⁺]_i반응에서 주목할 점은, 급격한 [Ca²⁺]_i증가 뒤, Cch의 존재에도 불구하고, 자극 전 [Ca²⁺]_i수준까지 감소 한다는 점이다. 췌장선세포의 경우, 지속적이고 강한 자 극은 외부 Ca²⁺의 유입을 지속시킴으로써 세포독성을 매 개하고 결과적으로 급성 췌장염을 유발 시킨다 [18]. hGF-1 세포 내 위와 같은 반응은 고농도 Cch 자극에 대 한 세포 독성이 아닌 다양한 생리활성을 매개함을 짐작하 게 한다. 예상한대로, 고농도의 Cch 자극은 짧은 시간 동 안 세포독성을 유도하는 듯 보였으나, Cch 자극 1시간 이후부터 세포독성이 점차 완화되는 것이 확인되었는데, 이 는 Ach 자극에 의한 [Ca²⁺]_i증가가 세포독성 외의 다른 생 리활성을 갖는다는 가설을 다시 한 번 확인시켜주는 결과 로, 치은세포 간 Ach에 의한 상호작용이 치주조직 생리활 성에 역할을 수행하고 있음을 짐작케 한다.

치주조직 내 만성염증에 의한 면역세포 집중은 치주조 직 내 파골세포 과분화를 초래하고 결과적으로 치조골 및 치아 유실로 이어진다. RANKL 및 OPG, IL-6는 파골세포 로의 분화 정도를 조절하는 핵심인자들로서, 치주상피세 포 내 발현되며 다양한 외부조건에 따른 치조골 재형성에 관여되어 있다 [19]. 특히, RANKL과 OPG 간의 발현비율 (RANKL/OPG ratio)은 파골세포 분화도를 결정하는 생리 지표로서 bisphosphonate 및 P. gingivalis 등의 치주구강상 피세포에의 자극은 RANKL/OPG 발현비율을 조절하고 있 음이 보고된 바 있다 [12]. 본 연구결과, Cch에 의한 hGF-1세포 내 [Ca²⁺]i증가는 위 세 인자들 중 RANKL 발 현만을 증가시키고 OPG 및 IL-6의 발현에는 영향을 미치 지 않음이 확인되었는데, 이는 AChR 활성에 따른 신호기 전이 OPG 및 IL-6 발현기전과 독립적인 신호기전에 의해 조절됨을 암시하고 있다. 또한, RANKL 발현 증가에 따라 RANKL/OPG 발현비율이 증가함이 확인되었는데, 이는, Ach을 통한 세포 간 상호작용이 치조골 재형성 과정과 직접적으로 연관되어 있음을 입증한다. 본 연구결과는 hGF-1 세포 내 AChR의 활성은 세포 내 [Ca²⁺]i증가 및 일 시적 세포독성을 유도하며, RANKL 유전자 발현을 증가 시키는 것을 확인시켜주었다. 종합적으로, 위 결과들은 치은섬유아세포 내 AChR의 활성이 치조골 항상성 유지 에 관여되어 있을 가능성을 강하게 나타내고 있다.