서 론
얼굴 및 입안의 감각은 삼차신경감각핵군으로 전달되 며 이 감각핵군은 세포구축학적으로 삼차신경주감각핵 (trigeminal nucleus principalis, Vp), 삼차신경입쪽핵(trigeminal nucleus oralis, Vo), 삼차신경중간핵(trigeminal nucleus interpolaris, Vi), 삼차신경꼬리핵(trigeminal nucleus caudalis, Vc) 등 4 부분으로 구성된다[1]. 이중 삼차신경주감각핵은 두개안 면 부위의 촉각이나 압각을 중계하여 시상으로 전달하 며 분별 촉각 등 복잡한 감각의 처리에 관여한다[2,3,4]. 삼차신경입쪽핵은 입안에서 유해자극을 전달받아 주로 삼차신경운동핵(trigeminal motor nucleus)으로 투사하여 아래턱운동이나 아래턱반사의 조절에 관여하는 것으로 생각되고 있다[4,5,6,7,8,9]. 삼차신경중간핵은 입쪽핵과 함께 촉 각의 전달에도 관여하지만 치아로부터 동통 섬유를 받 기도 하며 삼차신경꼬리핵은 주로 동통과 온도의 전달 에 관여한다고 일반적으로 알려져 있다[10, 11].
최근 형태측정법(morphometry)의 발달로 신경전달물질 의 분비와 밀접한 상관관계를 가지는 신경종말의 부피, 인접부위의 면적(apposed surface area), 사립체의 부피 (mitochondrial volume), 연접소포의 수, 활성부위(active zone)의 수와 면적 등과 같은 여러 가지 변수(parameter)에 대한 분석이 많이 수행되어 왔다. 특히 Horseradish peroxidase (HRP) 등 신경표식자를 이용하여 기능이나 기 원을 확인한 신경섬유의 종말에 대한 분석을 통해 이들 특정 신경섬유종말에서 신경전달물질의 분비와 관련된 많은 유용한 정보를 얻을 수 있게 되었다. 이와 같은 연 구로는 척수에서 Ia 들신경종말[12, 13], 고양이 삼차신경 주감각핵에서 코털 기원의 신경종말[14], 고양이 위삼차 신경핵(supratrigeminal nucleus)에서 치아인대 기원의 신경 종말[15], 삼차신경주감각핵 및 입쪽핵에서 혀유래 들신 경종말[16] 등을 예로 들 수 있다.
치수를 지배하는 신경은 대부분이 Aδ 및 C형 신경섬유 와 같은 유해성 신경섬유로 구성되어 있으며, 이들은 삼 차신경 감각핵으로 투사하여 연접을 거친 후 고위뇌중추 로 투사한다. 이전의 연구[17]는 치수지배 신경섬유종말 은 삼차신경 감각핵의 각 아핵에서 각기 다른 연접양식을 보인다고 보고하였는데 이는 각 아핵에서 치수유래 감각 정보가 처리되는 양식이 서로 다를 것이라는 것을 의미한 다. 삼차신경입쪽핵의 많은 신경세포들은 삼차신경운동 핵으로 투사함으로써 반사회로에 관여하는데, 치아에 유 해자극을 가할 때 야기되는 반사회로에서 치수지배신경 종말의 연접이전억제에 관여하는 연접이전종말의 연접분 비와 관련된 요소들의 특정에 대해서는 알려진 바가 없 다. 이를 밝히면 치수감각정보의 중추 내 전달과정 중 반 사와 연관된 회로에서의 정보처리 기전을 이해할 수 있 다. 본 연구에서는 치수신경 반사회로에서의 정보처리기 전을 이해하기 위해, 삼차신경입쪽핵에서 치수에서 유래 하는 들신경섬유종말을 신경추적자를 이용하여 표식한 다음, 이와 연접하는 연접이전종말(presynaptic ending; p-ending)의 미세구조적 특징을 살펴보고, 연접분비와 밀 접한 상관관계가 있는 요소들에 대하여 형태측정법을 이 용하여 계측하고 분석함으로써 p-ending의 연접특성을 밝 히고자 한다.
재료 및 방법
1.동물실험 및 조직처리
체중 약 260 g의 흰쥐 3마리를 사용하여 결과를 도출하 였으며, 실험동물의 보호 및 처치는 경북대학교 실험동물 위원회(Intramural Animal Care and Use Committee)의 승인 을 받아서 진행하였다. 실험동물은 sodium pentobarbital (40 mg/kg, i.p.)로 마취한 후 아래턱의 모서리를 따라 피 부를 절개한 후 뼈를 노출시켰다. 노출된 뼈의 모서리부 위를 치과용 드릴로 구멍을 뚫은 뒤 이어서 아래턱 앞니 의 뿌리부분을 확인하고 구멍을 뚫어서 치수를 노출시켰 다. Hamilton syringe에 연결한 30 gauge의 치과용 주사바늘 을 이용하여 신경추적자인 wheatgerm agglutinin conjugated horseradish peroxidase (WGA-HRP, 2% in saline; Sigma, Type IV, St. Louis, MO, USA) 0.3 μl를 치수 내에 약 30분 간 주입하였다. 36시간 정도 동물을 생존시킨 후 헤파린 을 함유한 생리식염수 100 ml를 실온에서 15초 동안 관류 한 후 500 ml의 2.5% glutaraldehyde, 0.5% paraformaldehyde 와 0.1% picric acid를 함유하는 고정액(in 0.1M PB, pH 7.4)으로 45분간 관류고정하였으며, 뇌줄기를 제거한 다 음 4°C의 동일 고정액에 3시간 정도 후고정 하였다. 그 후 뇌줄기를 진동절편기(vibratome)를 이용하여 60 μm 두께 의 횡단 연속절편으로 만들어 tungstate/tetramethylbenzidine protocol에 의해 WGA-HRP를 가시화 한 다음 diaminobenzidine (0.25 mg/ml in 0.1 M PB, pH 6.0)으로 절편을 안정화하였 다. 그 후 광학현미경하에서 숨뇌뒤뿔을 관찰하여 삼차신 경입쪽핵에서 HRP 반응산물이 풍부하게 존재하는 절편 을 골라 1% osmium tetroxide 용액에서 1시간 정도 후고 정을 시행하였다. 그 후 계열의 알코올을 거쳐 절편을 두 장의 Aclar plastic (Tedd Pella; Redding CA, USA) 사이에 넣어 Durcupan ACM (Fluka, Switzerland)으로 포매하여 58°C에서 48시간 동안 경화하였다. 표식된 축삭이 함유되 어 있는 절편부위를 취하여 레진 막대에 접착제로 붙인 다음 연속 초박절편을 형성하였다.
2.전자현미경 관찰 및 형태측정법을 이용한 분석
투과전자현미경(Hitachi H-7500)으로 HRP의 반응 산물 인 전자밀도가 치밀한 결정이 함유되어 있는 표식 축삭 종말을 모든 연속절편에서 촬영한 후 인화하여 표식종 말과 연접소포의 모양, 주위 신경그물의 미세구조 및 연 접양식 등을 관찰하였다.
11개의 표식종말에 연접하는 15개의 p-ending을 대상 으로 형태측정법을 이용한 분석을 시행하였다. P-ending 에 대한 정량적 분석을 위해서는 IBM컴퓨터에 연결한 디지털화장치(digitizer) 및 화상분석프로그램(NIH image v1.45; NIH, Bethesda, MD, USA)을 이용하였으며 1) p-ending의 면적, 2) 사립체가 차지하는 면적, 3) 활성부 위의 길이, 4) 인접부위의 길이를 측정한 다음 각 측정 값에 절편의 평균 두께를 곱하여 부피 및 면적을 계산 하였다. 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 수행한 결과, 측정결과는 실험동물별로 유의한 차이가 없어 통 합하여 분석을 시행하였다. P-ending의 부피와 사립체의 부피, 활성부위 면적 등의 상관관계분석은 피어슨의 상 관계수(Pearson’s correlation coefficient)를 이용하여 확인 하였다.
결 과
1.광학 및 전자현미경적 검경
광학현미경적 관찰에서 치수신경의 WGA-HRP 반응산 물은 삼차신경주감각핵 및 삼차신경입쪽핵의 등쪽안쪽 (dorsomedial) 부분에서 밀집되어 나타났으며 삼차신경척 수핵에서도 많이 관찰되었다. 본 연구에서는 삼차신경입 쪽핵에서 관찰된, 치수신경에서 유래하는 11개의 표식된 신경종말에 연접하는 15개의 p-ending을 대상으로 미세 구조에 대한 정량적 분석을 시행하였다.
전자현미경적 검색에서 WGA-HRP의 반응산물이 표식 종말 및 축삭 내에서 전자밀도가 치밀한 결정 혹은 막 대모양으로 관찰되었다(Fig. 1, 2). 때때로 반응산물이 표식종말의 막을 따라 존재하기도 하였으나 세포체, 가지돌기 및 아교세포(glial cell)내에 나타나는 신경세포간 표식(transsynaptic labeling) 양상은 관찰되지 않았다. 표 식종말 내에는 직경 45-55 nm의 투명하고 둥근 소포가 밀집되어 나타났으며, 때때로 직경이 90-120 nm인 1-2개 의 큰 치밀소포(dense cored vesicle)가 함유되어 있었다. 이러한 치수유래 표식종말은 대부분 중간 또는 먼쪽 가 지돌기와 연접을 이루었으며, 세포체와 연접하는 경우는 대단히 드물었다. 표식종말은 가지돌기와 연접부위가 넓 고 연접이후 치밀질이 뚜렷한 비대칭연접을 형성하였다. 이에 비해, p-ending은 타원형, 난원형, 구형 등 여러 형 태의 소포들을 함유하였으며, 일차들신경종말과 연접이 후 치밀질이 발달하지 않은 대칭 연접을 이루었다. 또한 이들은 표식된 일차들신경종말에 비해 크기가 작고 함 유하고 있는 연접소포나 사립체의 수도 적었다.
2.형태측정법을 이용한 정량적 분석
형태측정법을 이용한 분석결과 p-ending의 부피는 0.82 ± 0.45 μm3 (mean ± SD)이었고 최소값은 0.11 μm3, 최대 값은 1.78 μm3이었다. P-ending의 표면적은 4.50 ± 1.76 μm2이었고 최소값은 1.39 μm2, 최대값은 7.38 μm2이었다. 또한 p-ending에 함유된 사립체의 부피는 0.15 ± 0.07 μm3 이었고 최소값은 0.03 μm3, 최대값은 0.25 μm3이었다. 전 체 인접부위의 면적(total apposed surface area)은 0.69 ± 0.24 μm2이었고 최소값은 0.30 μm2, 최대값은 1.10 μm2이 었다. 활성부위의 면적은 0.10 ± 0.04 μm2이었고 최소값은 0.04 μm2, 최대값은 0.19 μm2이었다. P-ending에 함유된 전 체 연접소포의 수는 1045 ± 668.86 개이었으며 최소값은 120개, 최대값은 2688개이었다. 연접소포의 밀도는 1677 ± 684개/μm2이었다(Fig 3).
3.각 항목간의 상관관계
본 연구에서 p-ending의 부피는 p-ending의 표면적 (r=0.97, P<0.01), 사립체의 부피(r=0.56, P<0.05), 전체 연 접소포의 수(r=0.73, P<0.05) 등과 강한 양의 상관관계를 나타내었다. 하지만 인접부위의 면적(r=-0.12, P=0.675)이 나 활성부위의 면적(r=0.46, P=0.084) 등과는 유의한 상 관관계를 보이지 않았다(Fig 4).
고 찰
1.P-ending과 크기의 원리
Pierce와 Mendell [13]은 신경전달물질의 분비와 관련이 있는 인접부위의 면적, 사립체의 부피, 연접소포의 수, 활 성부위의 수와 면적 등이 신경종말의 부피와 직접적으로 관련을 가진다고 하는 “크기의 원리(size principle)”를 발 표하였다. 이후의 보고들은 이러한 “크기의 원리”가 운동 신경계 뿐만 아니라 삼차신경주감각핵에서 고양이 코털 기원의 신경종말[14]이나 위삼차신경핵에서 치아인대 유 래 신경종말과 축삭사이연접을 구성하는 p-ending [15] 등 에서도 역시 적용될 수 있다고 하였다. 그 후 남 등[18]은 두 점 식별이나 위치분별에 주로 관여한다고 알려진 삼차 신경주감각핵에서 치수유래 일차신경종말에 연접하는 p-ending은 GABA에 면역양성반응을 보이며 미세구조적 으로 분석한 결과, 크기의 원리를 따른다고 보고하였다.
본 실험을 통해 삼차신경입쪽핵에서 치수유래 일차들 신경종말에 연접하는 p-ending을 확인하고 형태측정법을 이용하여 분석한 결과 p-ending의 부피는 신경종말의 표 면적(r=0.97, P<0.01), 사립체의 부피(r=0.56, P<0.05), 전체 연접소포의 수(r=0.73, P<0.05) 등과 강한 양의 상관관계 를 나타냄으로써 크기의 원리가 적용된다고 할 수 있다. 하지만 인접부위의 면적(r=-0.12, P=0.675)이나 활성부위의 면적(r=0.46, P=0.084) 등의 항목은 부피와 유의한 상관 관계를 보이지 않거나 낮은 상관관계를 보였다. 이는 Bae 등[15]의 보고에서 다른 항목의 경우 상관 계수가 높은데 비하여 인접부위 면적과 활성부위 면적에서 신경종말의 부피와의 상관계수가 상대적으로 상당히 낮았던 점과 유 사하다고 생각한다. 또한 Zhang 등[16]의 보고에서도 이 런 p-ending의 특징이 나타난다. 이들은 삼차신경입쪽핵 및 주감각핵의 등쪽핵에서 혀유래 들신경종말에 연접하 는 p-ending을 분석하면서 인접면적(r=0.58, P=0.165) 및 활성부위의 면적(r=0.27, P=0.319) 등이 p-ending 부피와 양의 상관관계를 가진다고 하였으나 상관계수(r)가 비교 적 낮은 값이며 P 값은 매우 높아 신뢰도가 떨어진다. 뿐 만 아니라 남 등[18]의 보고에서도 비록 위에서 언급한 대부분의 항목에서 크기의 원리를 따르는 것으로 되어 있 으나 다른 항목에 비하여 인접부위의 면적이나 활성부위 의 면적은 상대적으로 낮은 상관계수를 나타내고 있다. 따라서 이런 경향은 비록 부위에 따라서 정도의 차이는 있지만 일차들신경섬유종말과는 다른 p-ending만이 가지 는 특징으로 생각할 수 있을 것이다. 이를 좀 더 명확히 증 명하기 위해서는 더 많은 부위에서 충분한 수의 p-ending이 형태학적으로 분석되어져야 할 필요가 있다고 생각한다.
2.P-ending의 의의 및 회로
1)P-ending에 관한 연구들
P-ending이란 다양한 형태의 연접소포(pleomorphic vesicle)를 함유하고 있는 신경종말을 일컬으며 Conradi 등[19]에 의한 신경종말이 함유하고 있는 연접소포의 형 태에 따라 신경종말을 분류한 것이 유래이다. 최근에는 다른 신경종말과 축삭사이연접(axoaxonic synapse)을 형 성하는 연접이전종말 중 다양한 형태의 연접소포를 함 유하는 신경종말의 의미로 많이 사용되고 있다.
단일축삭 내 HRP 주입법을 통해 치아인대의 저역치 기계자극 수용기에서 유래하는 일차들신경섬유 종말 및 이와 대칭연접을 이루는 p-ending의 미세구조, 연접양상 및 이들의 부피 등을 분석한 연구[15]에서 p-ending은 종 말의 부피, 사립체의 부피 등에 있어서 일차들신경섬유 종말부보다 작다고 보고하였고 아울러 분석한 모든 p-ending은 GABA에 면역양성 반응을 보인다고 하였다. 또한 Bae 등[20]은 삼차신경절에 CTB-HRP를 주입한 후 삼차신경계의 각 아핵에서 관찰되는 일차 신경종말에 연접하는 연접이전 종말 중 많은 수가 GABA에 면역양 성 반응을 보이며, 형태학적으로 GABA에 양성인 신경 종말은 다양한 형태의 연접소포를 함유한다고 하였다.
일차들신경섬유에 의한 감각정보의 전달은, 흥분성 신호의 연접이전억제에 의해 일차들신경섬유종말부의 함유 신경전달물질의 분비량이 조절됨으로써 조절되는 데 이는 형태학적으로 축삭사이연접에 의해 야기된다고 생각되어지고 있다. 많은 연구들에 의해 삼차신경계 내 에서 PAD (primary afferent depolarization)가 보고되고 있 는데, 큰솔기핵(raphe magnus nucleus) 및 인접 그물체 (reticular formation)를 전기자극하면 PAD가 야기되며 이 는 glycine 길항제인 strychinine 투여시에는 영향이 없으 나 bicuculline 투여시에는 상쇄됨으로써 GABA가 이에 관여할 것이라고 추측되고 있다[21,22,23,24,25]. 실제로 면역조직 화학적 방법으로 GABA를 함유하는 것으로 확인된 많 은 p-ending들이 이러한 PAD에 관여할 것으로 추측되며. 본 연구에서 관찰된 대칭성 연접이나 다양한 형태의 연 접소포 등도 이러한 사실을 형태학적으로 뒷받침해주고 있다.
2)회로
삼차신경입쪽핵의 들신경 및 날신경회로를 살펴보면 다음과 같이 알려져 있다: 치수로부터의 감각을 중계하는 삼차신경시상경로를 구성하는 삼차신경 아핵(subnucleus) 은 삼차신경주감각핵의 등쪽핵, 삼차신경중간핵의 꼬리 쪽 2/3, 삼차신경꼬리핵의 I 및 V 층이다. 본 실험의 연구 대상인 삼차신경입쪽핵 및 삼차신경중간핵의 입쪽 1/3은 삼차신경시상경로의 형성에 거의 관여하지 않는다[26,27,28]. 하지만 최근의 연구에 의하면 삼차신경입쪽핵의 등쪽안 쪽에서 삼차신경곁핵(juxtatrigeminal nucleus, JX)으로 투사 하며 이때 신호를 받은 신경세포가 다시 반대쪽 시상으로 투사한다고 보고되고 있다[29].
삼차신경입쪽핵은 치수뿐만 아니라 구강으로부터 유해 자극이 전달되는 경로이다[7,8,9]. 한편 팔곁핵(parabrachial nucleus)과도 회로가 연결되어 신호를 주고받는다. Yoshida 등[30]은 팔곁핵에서 삼차신경주감각핵, 삼차신경입쪽핵, 삼차신경중간핵, 삼차신경꼬리핵의 II 층 등으로 신경섬 유가 투사함을 보고하였고, Allen 등[31]은 삼차신경척수 핵 즉, 삼차신경입쪽핵, 삼차신경중간핵, 삼차신경꼬리핵 등에서 팔곁핵으로 투사하여 얼굴 및 구강으로부터의 유 해자극이 심장순환계에 영향을 미친다고 하였다.
또한 삼차신경입쪽핵의 등쪽안쪽은 삼차신경운동핵, 그물체, 삼차신경중간핵의 등쪽안쪽, 12번째 뇌신경핵 (XII) 등과 함께 삼차신경중뇌핵(trigeminal mesencephalic nucleus)으로부터 투사를 받는다[32]. 한편 삼차신경입쪽 핵은 삼차신경주감각핵, 삼차신경중간핵 등과 함께 소뇌 [33, 34] 및 시상하부[35]로도 투사한다고 알려져 있다.
이상의 보고들을 살펴보면 본 연구에서 관찰된 p-ending들은 팔곁핵이나 삼차신경중간뇌핵 등으로부터 유래할 가능성이 있으며 정확한 회로를 밝히기 위해 많은 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
