서 론

척수 아교질 신경세포(substantia gelatinosa, SG)는 신체 의 유해한 통각정보를 Aδ-섬유와 C-섬유 같은 일차 감각 신경섬유를 통해 전달받고, 이웃하는 lamina Ⅰ과 Ⅳ등의 투사신경세포(projection neuron)를 통하여 상위중추로 정 보를 전달한다[1,2]. 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)은 H₂O₂, superoxide (O₂ ∙-), hydroxyl radical, nitric oxide (NO), peroxynitrite (ONOO-)을 포함하는데, 이중에 서 NO, ONOO-는 활성질소종(reactive nitrogen species; RNS)로 분류하기도 한다. 신경조직에서 ROS는 미토콘드 리아에서 전자전달 과정 중에 O₂ ∙^-가 방출되거나, NO synthease (NOS) 활성에 의한 NO 생성, NO와 O₂ ∙-의 결합 으로 인한 ONOO^-의 생성 등으로부터 얻어진다[3,4].

ROS는 정상 이상의 농도에서는 세포손상을 일으킬 수 있으나, 세포내 항산화계의 작용으로 적정량이 유지 되면 세포내 신호전달물질로 작용한다. ROS가 통증의 발생과 조절에 관여한다는 연구는 척수신경 결찰에 의 해 신경병증성 통증을 유발시킨 흰쥐와[5], 피부에 capsaicin 투여로 통증을 유발시킨 생쥐에서[6] 척수후각 뉴론의 미토콘드리아에서 O₂ ∙^-가 증가됨이 관찰되었고, 척수에 전자전달계 억제제 투여에 의해 O₂ ∙-의 증가와 통증 행동반응의 증가[4] 등이 보고되었다. 이러한 연구 는 척수후각 뉴론에서 발생된 O₂ ∙^-가 통증을 발생시키는 데 중요하며 O₂ ∙^-의 감소가 통증을 억제시키는 요인이라 고 생각할 수 있다.

그러나 NO의 통증에 대한 역할은 확실하지 않은데, 통 증 유발효과와 진통효과가 같이 보고되어 있다. 예를 들 면, 신경손상에 의해 유발된 과민성은 NOS 억제제의 투 여나 nNOS 유전자를 제거한 생쥐에서 감소하였으며[7,8,9], 다른 연구에서는 L-arginine과 O₂ ∙^- donor인 SIN-1을 같이 뇌실에 투여하거나[10], sodium nitroprusside를 발바닥 피 하에 주입하여 진통효과를 유발함이 보고되었다[11].

본 연구실에서는 ROS의 통증조절에 대한 역할을 추 구하기 위하여 여러 가지 ROS donor의 척수 아교질 세 포의 흥분성에 미치는 영향에 관한 연구를 진행하였다. Hypochlorite (HOCl^-)을 발생시키는 NaOCl에 의해 아교 질 세포의 막전압의 변화와 세포내 칼슘농도의 증가를 확인하였고[12], NO donor인 SNP에 의해 농도에 따라 다른 막전압에 대한 효과와 이와 관련된 이온전류를 규 명하였으며[13], 최근에는 hydroxyl radical (∙OH)을 발생 시키는 tert-buthylhydroperoxide (t-BOOH)를 척수에 주입 하여 통각과민을 유발하였고 아교질 세포의 흥분성 시 냅스후 전압의 증가를 보고하였다[14].

이 연구에서는 ROS의 한 종류인 O₂ ∙^-와 대표적 RNS 인 NO가 통증전달에 1차적 중계역할을 하는 척수후각 세포의 신경 흥분성에 어떻게 작용하는지를 알아보고 그 효과에 차이가 있는지를 확인하고자 하였다. 이를 위 해 흰쥐에서 척수후각 세포의 흥분성에 대한 X/XO와 SNAP의 효과를 patch clamp 방법으로 조사하였으며, 또 한 X/XO와 SNAP가 세포내에서 실제로 ROS 농도를 증 가시키는지를 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다.

재료 및 방법

척수절편 제작

생후 12-17일 된 Sprague-Dawley 흰쥐를 사용하였으며, 이 연구는 원광대학교 동물실험 윤리위원회의 규정을 준수하였다. 흰쥐를 ether로 마취한 후 25% urethane을 복강 내 투여하였다. 흉추에서 천추까지 laminectomy로 척수를 노출한 후 요천수 팽대부에서 1 cm 정도의 척수를 절단 하였다. 조직절편기(vibratome 752M, Campden, GB)를 이 용하여 용액의 온도를 1-2 °C 정도로 낮게 유지하고 95% O_2-5% CO₂를 공급하면서 두께 300 ㎛의 척수절편을 절단 하였다. 척수절편은 32 ℃의 인공 뇌척수액에 1시간 정도 보관하여 정상적인 상태로 회복시켰고, 이후에 실험을 진 행하였다. 기록은 척수절편을 현미경(BX50WI, Olympus, Japan) 위의 기록용기에 옮긴 후 시행하였고, 실험과정 동 안 95% O_2-5% CO₂가 포함된 용액을 관류펌프(Minipuls 3, Gilson, France)를 이용하여 관류시켰다.

실험용액

막전압과 전류를 기록하기 위한 세포외 용액의 조성은 117 NaCl, 3.6 KCl, 2.5 CaCl₂, 1.2 MgCl₂, 1.2 NaH₂PO₄, 25 NaHCO₃, 11 glucose이었고 95% O_2-5% CO₂를 공급하여 pH를 7.4 상태로 유지하였다. 유리전극 내에 주입하는 세 포내 용액은 150 K-Glu, 10 HEPES, 5 KCl, 0.1 EGTA, 5 MgATP, 0.3 Na GTP를 사용하였고, pH는 KOH를 이용하 여 7.3으로 조정하였다.

실험에 사용된 xanthine, xanthine oxidase (XO), S-nitroso- N-acetyl –DL-penicillamine (SNAP), β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), 3-morpholinosydnomimine (SIN-1), N-tert-butylnitrone (PBN), Nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)는 Sigma (USA)에서 구입하였다. Manganese (III) tetrakis(4-benzoic acid) porphyrin (MnTBAP)는 Calbiochem (La Jolla, CA, USA)에서 구입하였고 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate (H2DCF-DA), dihydroethidium (DHE)는 Molecular Probes (Eugene, OR, USA)에서 구입하였다. MnTBAP는 DMSO (dimethyl sulfoxide; Sigma)에 일차적으로 녹인 후 최 종농도로 세포외 용액과 혼합하여 사용하였고, 그 외의 다 른 약물은 실험 전에 세포외 용액에 녹여 사용하였다. 세포 에 대한 실험용액의 적용은 중력을 이용한 관류장치 (BPS-4SG, Ala Scientific Instruments, USA)를 이용하여 용액 을 교환하였다.

전기생리학적 기록방법

막전압과 전류의 기록을 위하여 whole cell patch clamp 방법을 이용하였다. 기록전극은 미세전극 제조기(PP-830, Narishige, Japan)를 이용하여 외경 1.5 ㎜의 유리관 (TW150-3, WPI, USA)을 저항이 5-9 ㏁이 되도록 제작하 였다. 10배의 대물렌즈로 관찰하였을 때 밝은 띠를 형성 하고 있는 척수 아교질 부위를 확인한 후 양압을 가하면 서 미세 전극조절기(ROE-200, Sutter, USA)를 이용하여 세포에 접근하였다. Seal test를 시행하면서 세포에 접근하여 저항의 변화로 세포에 근접함을 확인한 후 음압을 주어 세포와의 gigaohm seal을 이루었다. Whole cell을 만든 후 5-10분 정도 기다려 막전압이 -45 mV 이하로 안정된 상태 에서 기록을 시작하였다. 전압과 전류측정에는 Axopatch 200B 증폭기(Axon, USA)를 사용하였고, 이 증폭기는 Digidata 1322 (Axon, USA) AD변환기를 통해 컴퓨터에 연결하였다. pCLAMP software (version 9.0, Axon, USA)를 사용하여 전기신호의 저장 및 분석에 이용하였다. 모든 실험은 실온에서 시행하였다.

형광이미지 측정

세포내 활성산소 생성 정도는 H₂DCF-DA, DHE assay로 측정하였다. 150 μm의 척수절편은 H2DCF-DA, DHE dye 를 넣은 32°C의 세포외 용액에서 각각 10-30분간 loading 하였다. 이후 척수절편은 공초점 레이저 형광현미경 (LSM 510, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 ×400 배율로 관찰 하였으며, excitation 파장은 488 nm (argon laser), emission 파장은 505 nm이었다.

실험자료의 분석

막전압과 전류의 분석은 Clampfit (version 9.0, Axon, USA)를 이용하였고, 세포내 활성산소 생성 정도는 LSM 510 image analysis software (Carl Zeiss, Germany)를 이용 하였다. 약물처리군 사이에 통계적으로 유의한 차이가 존재하는지의 여부는 independent t-test를 이용하였고 약 물처리 전후비교는 paired t-test를 이용하였으며, p<0.05 에서 통계적으로 유의하다고 판정하였다. 통계자료의 값 은 평균값±표준오차 (mean±SEM)로 표시하였다.

연구성적

척수 후각세포에서 X/XO, SNAP 투여에 의한 활성산소량 변화

Xanthine과 xanthine oxidase (X/XO), SNAP 투여가 실제 로 척수 후각 아교질 세포내 활성산소를 생성하는지를 확 인하기 위하여 공초점 레이저 형광현미경으로 광범위한 ROS에 반응하는 H₂DCF-DA와 O₂ ∙^-에 특이적으로 반응하 는 DHE의 형광강도를 측정하였다. H₂DCF-DA (10 μM)와 DHE (20 μM)로 loading된 척수절편에 5분간 X/XO (300 μ M/30 mU)을 관류하였을 때 각각 158.6±6.2% (n=12, p<0.001), 145.7±8.6% (n=12, p<0.01)로 형광강도가 유의하 게 증가하였고, 약물이 포함되지 않은 용액으로 재관류시 원래 상태로 회복되었다. H₂DCF-DA로 loading된 척수절편에 5분간 SNAP (500 μM)을 관류하였을 때는 143.2± 8.5% (n=11, p<0.01)로 형광강도가 유의하게 증가하였다 (Fig. 1).

척수 후각세포 흥분성에 대한 X/XO, SNAP 투여의 효과

활성산소종과 활성질소종이 척수 후각세포의 흥분성에 미치는 효과를 조사하기 위하여 patch clamp 방법을 이용 하여 막전압과 전류를 기록하였다. Whole cell이 되었을 때 막전압이 -45 mV 이하로 안정된 세포만을 결과분석에 이용하였다. 전류고정법을 이용하여 지속적으로 막전압 을 기록하면서 superoxide (O₂∙^-)를 발생시키는 것으로 알려진 X/XO (300 μM/30 mU), SIN-1 (1 mM), NADPH oxidase (NOX, 100 μM)을 각각 투여 하였을 때 7.3±0.5 mV (n=18), 5.8±0.5 mV (n=6), 7.6±0.7 mV (n=8)의 탈분극 이 관찰되었고, 산화질소(NO)를 발생시키는 SNAP (500 μ M)의 투여에 의해서는 6.3±0.6 mV (n=14) 크기의 탈분극 이 관찰되었다 (Figs. 2A, C). 전압고정법을 이용하여 지 속적으로 전류를 기록하면서 X/XO, SNAP, SIN-1, NOX를 각각 투여 하였을 때 –11.6±1.2 pA (n=31), -7.8±0.9 pA (n=28), -6.7±0.6 pA (n=7), -10.8±1.2 pA (n=7) 크기의 내향 성 전류가 관찰되었다 (Figs. 2B, D).

X/XO 투여에 의해 발생한 반응이 어떤 종류의 활성산 소종에 의한 것인지를 알아보고자 광범위하게 ROS와 RNS에 대해 항산화 작용을 하는 PBN (2 mM)과 주로 O₂ ∙^- 에 작용하여 항산화 작용을 나타내는 MnTBAP (40 μM), 산화질소에 대해 효과를 나타내는 L-NAME (1 mM) 등을 세포외액에 전 처리한 후 X/XO를 투여하였다. 발생된 내향성 전류는 X/XO를 단독으로 투여하였을 때보다 현저 히 감소하였다. PBN 전처리에 의해서는 –1.2±0.5 pA (n=6, p<0.001), MnTBAP 전처리에 의해 –4.8±0.6 pA(n=7, p<0.01), L-NAME의 전처리에 의해서도 –5.9±1.9 pA (n=6, p<0.05)로 통계적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 3).

또한, SNAP 투여에 의해 발생한 반응에 NO 이외의 다 른 활성산소종이 관여하는지를 알아보고자 L-NAME와 MnTBAP를 전 처리한 후 SNAP를 투여하였다. L-NAME 전처리에 의해서는 발생된 내향성 전류가 SNAP를 단독 으로 투여하였을 때보다 현저히 감소하였으나(–1.1±0.2 pA, n=7, p<0.001), MnTBAP 전처리에 의해서는 SNAP의 반응이 대조군에 비해 차이가 없었다(–6.5±1.3 pA, n=6) (Fig. 4).

고 찰

조직손상이나 증가된 유해반응에 의하여 세포내에 증 가된 ROS는 세포독성을 일으키고 세포죽음과 관련되나, 세포내부의 항산화계의 조절에 의하여 적정량으로 유지 되면 유전자 발현, 세포 분화와 증식 등 여러 가지 생리 적 기능을 조절하는 세포조절물질로서 역할을 수행한다 [15,16,17]. 최근에는 ROS가 통증발생에 관여되어 있다고 보고되고 있는데, 특히 척수 미토콘드리아의 superoxide dismutase (SOD) 양에 영향을 받으며[18,19], PBN[20], vitamin E[21]와 같은 다양한 항산화제의 투여에 의해 진통효과를 나타냄이 보고되었다. 이러한 결과들은 활성 산소가 척수에서 통증의 발생과 전달에 중요하게 관여 하고 있음을 시사한다.

공초점 현미경은 세포내 활성산소의 변화를 확인하는데 최근 많이 사용되었는데 여러 가지 ROS와 RNS를 탐지할 수 있는 탐식자를 이용한다. H₂DCF-DA는 비교적 비선택적 인 탐식자로 핵, 미토콘드리아, 세포질의 활성산소와 반응하는데[22], 세포내로 확산으로 이동하여 acetate group이 세 포내 estrase에 의해 분해되며 2,7-dichlorofluorescein (H₂DCF)는 세포내에 남아 형광을 발현한다. H₂DCF-DA는 H₂O₂ 뿐만 아니라 O₂ ·−, ·OH, NO, ONOO−도 탐지할 수 있다 [23]. 한편, DHE는 세포 내의 O₂ ·−을 측정하기 위한 선택적 인 탐식자로, 이것은 H₂O₂에 대해 매우 낮게 반응하며 ·OH, ONOO− 등과도 잘 반응하지 않는다[24].

이 연구에서는 X/XO와 SNAP를 투여하여 실제로 척수후 각 부위에서 ROS를 발생시키는지를 공초점 현미경을 이용 하여 확인하였는데 X/XO에 의해 DCF-DA와 DHE 형광발현 의 증가를 보였고, SNAP에 의해서는 DCF-DA의 증가를 확 인하였다. 이러한 결과는 척수후각에서 DCF-DA와 DHE로 O₂ ·−의 증가를 확인한 Lee와 Chun[25], Kim 등[4]의 결과와 유사하다. Park 등[13]은 NO에 특이적 탐식자인 4-amino- 5-methylamino-2,7-difluorofluorescein diacetate (DAF-FM DA) 를 사용하여 sodium nitroprusside (SNP)에 의해 증가되는 NO 를 확인하였는데, 이 연구에서는 광범위하게 ROS와 RNS를 탐지할 수 있는 DCF-DA에 의해서도 성공적으로 NO 변화 를 확인하였다.

이 연구에서는 ROS를 발생시키기 위해 X와 XO를 혼 합하여 투여하였는데 XO는 X를 산화시켜 uric acid로 만 드는 과정에서 superoxide 음이온(O₂ ∙^-)을 발생시키고 이것 은 SOD에 의해 H₂O₂로 변환된다. Hawkins 등[26]과 Sato 등[27]은 X/XO 투여에 의해 투여 직후부터 O₂ ∙^-가 발생되 어 3분에서 최고치를, 5분정도 경과하면 SOD에 의해 H₂O₂로 변환된다고 하였으며, Zhou 등[28]도 X/XO는 즉 각적이고 일시적인 변화를 H₂O₂ 투여는 느리지만 지속적 인 변화를 나타낸다고 하였다. 이 연구에서도 X/XO의 투 여는 주입 후 1분 이내부터 빠른 탈분극과 내향성 전류가 관찰되었으며 이는 이전에 보고한 H₂O₂ 투여에 의한 작 고 느린 탈분극과는 차이를 보였다[29]. 한편, 이 연구에 서는 O₂ ∙^-를 발생시키기 위하여 X/XO 외에 추가적으로 NADPH, SIN-1 등을 사용하였는데 탈분극과 내향성 전류 를 유발하여 나타난 반응은 X/XO와 유사하였다.

X/XO에 의한 반응이 어떤 종류의 활성산소에 의해서 발생하는가를 확인하기 위하여 광범위한 ROS에 작용하 는 PBN, O₂∙-를 H₂O₂로 전환시킴에 의해 O₂∙^-를 제거하는 SOD 유사물질 MnTBAP, NO에 특이적으로 작용하는 L-NAME 등을 사용하였다. PBN은 H₂O₂, O₂∙^-, NO, ONOO- 등의 다양한 ROS 형성을 억제한다[30]고 알려져 있는데, 이 연구에서도 PBN을 세포외 용액에 추가하였을 때 X/XO의 반응을 거의 완전하게 억제시켰으며 O₂∙^-를 특이 적으로 제거하는 MnTBAP도 유의한 억제작용을 보였다.

한편, O₂∙^-는 세포막의 지질층을 통과하는데 낮은 투과력 을 가지고 있고[31] 안정상태인 H₂O₂로 빠른 dismutation을 보이기 때문에[32] 세포내 신호전달물질로 작용하기는 어 려울 것이라고 여겨졌다. 그러나 최근 O₂ ∙^-가 세포내 nNOS 에 의해 생성되는 NO와 결합하여 ONOO-를 만들고 이것이 세포에 여러 가지 작용을 할 수 있음이 보고되었다[33]. 이 연구에서는 X/XO에 의한 반응이 NO scavenger인 L-NAME 에 의해 부분적으로 억제된 결과는 X/XO가 O₂ ∙^-를 발생시키 고 세포 내, 외에 존재하는 NO와 결합하여 ONOO-를 만들 었으며 이것이 아교질 뉴론의 탈분극을 유발하는데 작용하 였을 가능성을 가지고 있다고 추측할 수 있다.

결론적으로 이 연구에서는 xanthine과 xanthine 산화제 투여와 SNAP 투여에 의해 척수후각의 아교질 세포에서 활성산소를 발생시킴을 공초점 현미경으로 확인하였다. 또한 발생된 O₂∙^-와 NO는 아교질 세포를 탈분극 시키거나 내향성 전류를 발생시켜 신경흥분성을 조절할 수 있는데 이 과정에서 O₂∙^-와 NO의 결합에 의해 발생하는 ONOO- 가 작용할 수 있을 것으로 생각된다. 이러한 결과는 중추 에서 ROS와 RNS가 유사한 기전으로 중추감작을 일으켜 통증을 조절할 수 있음을 시사한다.