서 론

세포가 유전자에 의해 제어되는 세포사의 한 형태인 apoptosis는 정상적인 세포를 새로 바꾸거나 이상이 생 긴 세포를 제거하여, 세포의 항상성과 조직성장의 조절 에 중요한 역할을 담당하고 있다[1-3]. 또한 항암물질의 대부분은 apoptosis를 야기하여 암세포 증식을 억제함으 로서 암의 치료제 역할을 하기 때문에, 이러한 항암물질 을 사용하여 발생하는 암세포의 apoptosis는 암 치료법 의 결과에 대한 중요한 지표가 되었다[4-7]. Apoptosis는 외인성의 death receptor-dependent pathway 또는 내인성의 mitochondria-dependent pathway를 따라 일어나는 것으로 보이며, 이는 암의 화학적 치료제에 의해서 일어나기도 한다[8,9].

Tyrosol(2- (4- Hydroxyphenyl) ethanol)은 phenylethanoid의 한 종류로서 phenethyl alcohol 유사체이다[10-11]. 올리브 오일 등 천연물들에 존재하는 tyrosol은 천연 항산화제 로 널리 알려져 있으며, 특히 생체 이용률이 다른 항산 화제들에 비해 매우 우수하다고 보고된 바 있다[11-14]. 또한 tyrosol은 심장보호 작용이 있어 심장의 노화 치료 제로 고려되고 있으며[12,13], 사람의 대장암 세포의 성 장을 억제한다는 연구결과도 보고된 바 있다[15]. 그러 나 현재까지 대장암을 제외한 다른 암세포들의 성장억 제에 관한 보고는 없었으며, 특히 구강암에서 tyrosol의 효과에 대해서는 알려진 바 없다.

따라서 본 연구에서는 사람 구강암세포주 KB 세포를 이용하여 tyrosol의 구강암 세포 성장억제에 미치는 효과 와 세포성장 억제기전을 밝히고자 하며, 아울러 tyrosol에 의한 구강암 치료의 효용성을 제시 하고자 한다.

재료 및 방법

1.실험재료

Tyrosol, N-methylthiotetrazole(MTT) 및 4',6-diamidino-2- phenylindole(DAPI)는 Sigma(St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였으며, ECL detection kit는 Amersham Biosciences Corp.(Piscataway, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였다. Anti-cleaved caspase-3, anti-cleaved caspase-7, anti-cleaved caspase-8, anti-cleaved caspase-9 및 anti-cleaved PARP 항체 는 Cell Signaling Technology, Inc.(Danvers, MA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 기타 분석시약들은 analytical grade를 구입하여 사용하였다. 사람 구강암세포 KB는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 제공받아 실험에 이용하였다.

2.세포주와 세포배양

사람 구강암세포 KB는 5% fetal bovine serum(FBS, Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA), 항생제(100u/ml penicillinm, 100㎍/ml streptomysin) 및 1% non-essential amino acids(NEAA, Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)가 함유된 37°C의 성장배지 minimal essential medium(MEM, Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) 하에서 배양하면서 실 험에 이용하였다[16].

3.세포성장 억제실험(MTT 분석)

Tyrosol에 의한 세포성장 억제효과를 관찰하기 위해, 24well plate에 5 X 10³cells/well의 KB 세포를 접종하였 다. 24시간 배양한 후, tyrosol을 다양한 농도와 시간에 서 처리하여 37℃에서 반응시킨 후, 세포성장 억제효과 를 MTT 분석으로 측정하였다[17]. MTT 분석은 tyrosol 을 처리한 KB 세포에 MTT 용액(MTT 최종농도 0.5㎍/ ㎕)을 37℃에서 4시간 처리한 후, MTT 용액을 제거하고 0.04N HCl이 함유된 isopropanol로 녹여내어 570nm에서 흡광도를 측정하여 시행하였다.

4.DAPI 염색에 의한 세포핵 형태 관찰

Tyrosol에 의한 KB 세포 증식억제가 apoptosis 유도와 연관성이 있는지를 조사하기 위하여 DAPI 염색을 이용 한 세포핵의 형태학적 변화를 관찰하였다. 10cm 배양접 시에 5 X 10⁵개의 KB 세포를 접종하여 24시간 배양한 후, tyrosol 1000μM을 처리하여 96시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양한 KB 세포를 37% formaldehyde 용액 과 PBS를 1:9의 비율로 섞은 fixing solution을 이용하여 상온에서 10분 동안 고정한 후 DAPI 용액을 이용하여 15분 동안 염색하였다. 염색한 KB 세포를 형광현미경 (Ⅸ71, Olympus, Japan)을 이용하여 핵의 형태학적 변화 를 관찰하였다.

5.DNA fragmentation 분석

세포사멸의 기전 중 apoptosis의 지표가 되는 DNA fragmentation 분석을 시행하였다. Tyrosol에 의한 세포 DNA fragmentation 효과를 관찰하기 위해, 10cm 배양접 시에 5 X 10⁵개의 KB 세포를 접종하였다. 24시간 배양 한 후, tyrosol 1000μM을 처리하여 96시간 동안 37℃에 서 배양한 후, 세포를 수집하여 lysis buffer(0.1M NaCl, 0.001M EDTA, 0.3M Tris-HCl(pH, 7.5), 0.2M sucrose)를 이용한 통상의 phenol-chloroform extraction법으로 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 2% agarose gel에서 전기영 동(50volts, 90분) 하였으며, ethidium bromide로 염색하여 관찰하였다.

6.Immunoblotting

세포 apoptosis의 지표가 되는 caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 및 PARP(anti-cleaved caspase-3, anti-cleaved caspase-7, anti-cleaved caspase-8, anti-cleaved caspase-9 및 anti-cleaved PARP) 분석을 위해 immunoblotting 을 시행하였다[18]. 10cm 배양접시에 5 X 10⁵개의 KB 세포 를 접종하고 24시간 배양한 후, tyrosol 1000μM을 처리하여 96시간 동안 37℃에서 배양한 후 세포를 수집하였다. 세포 를 4℃의 PBS로 2회 세척한 후, 4℃의 lysis buffer(1% Triton X-100, 0.5mM EDTA, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 5 ㎍/ml aprotinin 및 5㎍/ml leupeptin이 포함된 PBS)에서 30분 반응시켰다. 세포 용해물을 12,500 x g에서 20분간 원심분리 한 후, 단백질 시료를 정량하였다. 단백질 시료를 2배의 SDS sample buffer(60mM Tris-HCl(pH, 6.8), 4% SDS, 25% glycerol, 14.4mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue) 에 넣고 100℃에서 5분간 변성 시킨 후, 12% SDSpolyacrylamide gel에 120volt에서 2시간 전기영동 한 다음, 단백질 transfer를 이용하여 nitrocellulose membrane(Millipore Co., Billerica, MA, USA)으로 이동시켰다. Membrane을 5% fat-free dry milk-PBST buffer(PBS, 0.2% Tween-20)에서 2시 간 동안 blocking하였고, PBST buffer로 15분간 3회 세척하였 다. 일차항체로 anti-caspase-3, anti-caspase-7, anti-caspase-8, anti-caspase-9 및 anti-PARP(anti-cleaved caspase-3, anti cleaved caspase-7, anti-cleaved caspase-8, anti-cleaved caspase-9 및 anti-cleaved PARP) 항체를 1,000배 희석하여 사용하였으며, anti-β-actin 항체는 2,000배 희석하여 사용하 였다. 이차항체로 horseradish peroxidase conjugated antirabbit IgG를 5,000배 희석하여 사용하였으며, ECL detection kit를 사용하여 X-ray 필름에 현상한 후 분석하였다.

7.실험자료의 통계학적 검정

모든 실험성적은 mean ± SEM으로 나타내었고, 각 실 험군 간의 유의성 검정은 ANOVA 후에 Student's t-test를 하였으며, p value가 0.05 미만(p<0.05)의 경우에서 통계 적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 또한 본 연구의 통계적 검정은 SPSS ver. 12.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분석하였다.

결 과

1.세포성장에 영향을 미치는 tyrosol의 효과

KB 세포에서 tyrosol에 의한 세포성장 억제효과를 조사 하기 위해 MTT 분석을 시행하였다. Tyrosol을 10, 30, 100, 300, 1000 및 3000μM의 다양한 농도로 24, 48, 72 및 96시간 동안 KB 세포에 투여한 후 MTT 검사를 시행한 결과, tyrosol 처리 24시간과 48시간의 경우에서는 대조군 과 비교하였을 때 세포성장 억제의 차이를 볼 수 없었다 (Fig. 1A, 1B). 그러나 tyrosol 처리 72시간과 96시간의 경 우, tyrosol 처리군은 대조군과 비교하여 볼 때 뚜렷한 세 포성장 억제효과를 볼 수 있었으며, 이 효과는 농도(Fig. 1A)와 시간(Fig. 1B)에 의존적임을 확인할 수 있었다. KB 세포성장 억제에 대한 tyrosol의 IC₅₀(최대 억제량의 50% 를 유발시키는 농도)은 tyrosol 처리 24시간과 48시간의 경우에서는 결정할 수 없었으며, 72시간과 96시간에서는 각각 약 942μM과 192μM이었다(Table 1).

2.DAPI 염색에 의한 세포핵 형태 관찰

Tyrosol 처리에 따른 KB 세포의 성장억제가 세포 apoptosis 유발과 상관성이 있는지 조사하기 위하여 0과 1000μM의 tyrosol을 처리한 배지에서 96시간 동안 배양한 후, DAPI 염색을 통해 세포핵의 형태학적 변화를 관찰하 였다. 세포핵에 특이적으로 결합하는 형광물질인 DAPI 염색을 실시하고 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과, Fig. 2A에 나타낸 바와 같이 tyrosol을 처리하지 않은 대조 군 KB 세포에서는 대부분의 세포에서 핵의 형태가 뚜렷 하게 정상으로 염색이 되었으나, tyrosol 1000μM을 처리 한 세포에서는 apoptosis 발생 세포에서 전형적으로 관찰 되는 염색질 응축에 의한 apoptotic body가 다수 관찰되었 다(Fig. 2A). Apoptosis가 발생하지 않은 정상세포를 100% 로 기준하여 apoptotic body를 비율로 나타내어 비교한 결 과, tyrosol을 처리하지 않은 대조군 KB 세포에서는 약 4.1%, tyrosol 1000μM을 처리한 세포에서는 약 89.7%로, tyrosol 농도가 증가함에 따라 apoptotic body의 비율이 증 가함을 알 수 있었다(Fig. 2B).

3.DNA fragmentation 분석

Tyrosol에 의한 KB 세포의 성장억제 기전을 확인하기 위 하여 DNA fragmentation 분석을 시행하였다. Tyrosol 0과 1000μM을 처리한 배지에서 96시간 동안 처리한 KB 세포의 DNA를 추출하여 전기영동으로 확인한 결과, 대조군에서는 DNA fragmentation 현상을 볼 수 없었으나, tyrosol 1000μM 을 처리한 실험군에서는 DNA fragmentation 현상을 볼 수 있었다(Fig. 3).

4.Tyrosol에 의한 caspase의 활성

Caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 및 PARP가 세 포 apoptosis의 지표가 되므로[8,9,19-21], tyrosol을 처리한 KB 세포에서 cleaved caspase-3, cleaved caspase-7, cleaved caspase-8, cleaved caspase-9 및 cleaved PARP 발현분석을 위해 immunoblotting을 시행하였다. Tyrosol을 처리한 KB 세포의 단백질을 추출하여 확인한 결과, 대조군에서는 procaspase-3, procaspase-7, procaspase-8, procaspase-9 및 PARP의 단백질 가수분해(proteolytic cleavage) 현상을 볼 수 없었으나, tyrosol 1000μM을 96시간 동안 처리한 실험 군에서는 단백질 가수분해 현상을 뚜렷이 볼 수 있었다 (Fig. 4-8).Fig. 5Fig. 6Fig. 7

고 찰

올리브 오일 등 천연물들에 존재하는 tyrosol은 phenylethanoid의 한 종류로서 천연 항산화제로 널리 알려 져 있으며[10-14], 심장보호 작용이 있어 심장의 노화 치 료제로 고려되고 있다[12,13]. 그러나 tyrosol의 항암효과 에 관한 자료는 매우 부족하며, 특히 구강암에서 tyrosol 의 효과에 대해서는 알려진 바 없다. 따라서 본 연구에서 는 사람 구강암세포주 KB 세포를 이용하여 tyrosol의 구 강암 세포 성장억제에 미치는 효과와 세포성장 억제기전 을 밝히고자 하며, 아울러 tyrosol에 의한 구강암 치료의 효용성을 제시 하고자 하였다.

세포성장 억제효과를 조사하기 위한 MTT 분석에서 tyrosol은 시간과 농도에 의존적으로 KB 구강암 세포의 성장을 억제시켰다(Fig. 1). 이는 시간과 농도에 의존적으 로 암세포 사멸을 유도하는 항암효과를 지닌 여러 생약 유래 물질(curcumin, resveratrol, β-carotene)에서의 연구결 과와 유사한 것이었다[22-24]. 더욱이 다른 생약 유래 물 질과 비교하여 상대적으로 낮은 농도의 tyrosol에서도 충 분히 KB 구강암 세포의 사멸을 유도하였다[22-24]. 이러 한 결과는 tyrosol이 구강암 세포 성장억제에 대한 특이적 인 효과를 가지고 있다는 것을 시사하며, 또 tyrosol의 항 암치료제로서의 잠재적인 가치를 시사하고 있다.

암세포 성장억제 과정에서 apoptosis의 유도는 생약 유 래 물질로부터 항암물질의 개발에 유용한 전략이 된다 [25]. 그러므로 과학자들은 생약을 포함한 다양한 천연물 로부터 암세포들의 apoptosis를 유도하는 연구들을 시행하 고 있다. 본 연구에서도 tyrosol에 의한 KB 세포 성장억제 기전에 apoptosis가 포함되는지를 확인하기 위하여, DAPI 염색을 이용한 세포핵의 형태학적 변화 관찰 및 DNA fragmentation 분석을 시행하였다. 핵산에 특이적으로 결 합하는 형광물질인 DAPI 염색을 실시하고 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과, tyrosol을 처리하지 않은 대조군 KB 세포에서는 대부분의 세포에서 핵의 형태가 뚜렷하게 정상으로 염색이 되었으나, tyrosol을 처리한 세포에서는 세포 밀도의 감소와 더불어 apoptosis 발생 세포에서 전형 적으로 관찰되는 염색질 응축에 의한 apoptotic body가 다 수 관찰되었다(Fig. 2). 또한 apoptosis 유발의 또 다른 증 거에 해당하는 DNA fragmentation 여부를 조사한 결과, tyrosol을 처리하지 않은 대조군에서는 DNA fragmentation 현상을 볼 수 없었으나, tyrosol 처리 실험군에서는 DNA fragmentation 현상을 볼 수 있었다(Fig. 3). 이는 암세포의 성장을 억제시키는 항암효과를 지닌 여러 생약 유래 물질 들이 DNA fragmentation을 유도하는 apoptosis 과정에 의 해 암세포를 사멸시킨다는 연구결과[22-24]와 일치하는 것으로서, tyrosol에 의해 유도되는 KB 구강암 세포 성장 억제 과정에는 endonuclease가 활성화되어 세포핵의 DNA 가 fragmentation 되는 apoptosis 기전이 포함되는 것으로 사료된다.

Cysteine protease인 caspase의 세포 내 활성은 다양한 자극 에 의해 유도된 apoptosis를 개시하고 실행하는데 중요한 역 할을 한다[19-21]. 사람의 세포에서 확인된 caspase 아형 중 에 caspase-3, caspase-7, caspase-8 및 caspase-9 등이 apoptosis 유도의 실행 caspase로 알려져 있으며, 이들은 각각 다양한 자극에 의해 apoptosis가 일어날 때 proteolytic cleavage 현상 이 일어난다[19-21]. 본 연구에서 caspase-3, caspase-7, caspase-8 및 caspase-9의 proteolytic cleavage 현상을 확인하 기 위해 이들의 항체를 이용하여 immunoblotting을 시행한 결과, tyrosol 처리 실험군에서 caspase들의 proteolytic cleavage 현상을 볼 수 있었다(Fig. 4-7). PARP는 apoptosis의 기전 중 외인성 death receptor-의존적 경로의 중요한 조절인 자이며, PARP 또한 어떤 자극에 의해 apoptosis가 일어날 때 proteolytic cleavage 현상이 일어난다[24]. 본 연구에서도 tyrosol 처리 실험군에서 PARP의 proteolytic cleavage 현상을 볼 수 있었다(Fig. 8). 이러한 실험결과들은 tyrosol에 의해 유도되는 KB 구강암 세포 성장억제 과정에 caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 및 PARP를 통한 외인성의 death receptor-dependent pathway와 내인성의 mitochondriadependent pathway를 경유하는 apoptosis가 포함되어 있음을 시사한다. 그러나 tyrosol이 유도하는 구강암 세포 성장억제 에 관한 세포 및 분자적 기전연구는 더 추구하여야 할 과제 로 생각된다.

결론적으로, tyrosol은 사람 구강암 세포주 KB 세포의 apoptosis를 유도하여 구강암 세포성장을 억제시키는 것으 로 사료된다. 또한 본 연구의 결과로, tyrosol을 이용한 암 세포 성장억제에 관한 하나의 방향을 제시할 수 있을 것 으로 생각된다.