서 론
혐기성, 그람음성세균인 P. gingivalis는 만성 염증성 질환인 구강 내 치주질환을 일으키는 주요 세균으로 잘 알려져 있다 [1]. P. gingivalis가 가진 lipopolysaccharide (LPS), 펩티도글리칸, fimbriae, gingipain과 같은 독성인 자들이 급성 또는 만성 치주염의 시작 및 진행을 촉진 하는 병인인자들로 작용하게 된다 [2].
최근에는 치주염이 동맥경화증, 관상동맥질환, 뇌졸중, 당뇨병, 그리고 조산 및 미숙아 출산 등의 전신성 질환 의 발병에 관련되어 있다는 사실이 많은 역학적 연구로 제시되고 있다[3]. 특히 동맥경화증 환자의 구강 외 혈 관 및 혈장에서 치주질환 병인균이 발견되고 있으며, 심 혈관계 질환의 진행과정에 치주질환 병인균 감염이 중 요한 위험인자로 알려지고 있다 [4]. 이들 연관성을 설 명할 수 있는 기전에 대해서는 명확히 규명이 되어 있 진 않지만, P. gingivalis 및 P. gingivalis LPS가 전신성 혈류에 침투하여 혈관세포의 항상성을 붕괴하고 염증반 응의 증가를 초래할 것으로 제안되고 있다 [5,6].
혈관평활근세포는 특히 혈관평활근세포의 증식 및 이 동은 혈관성형술후 재협착증, 관상심장질환, 동맥경화증 을 포함한 혈관계 질환의 진행과정에서 필수적인 단계 로 여겨지고 있다 [7]. 정상적인 혈관평활근세포는 수축 성 형질의 특징을 가지고 있지만, 혈관손상이 있는 경우 는 염증성 형질로 전환이 된다. 이러한 변화는 혈관평활 근세포에서 혈관평활근 특이적 표식자들의 발현을 감소 시키고, 염증유발물질을 분비하게 된다 [8]. 이렇게 분비 된 염증유발물질들이 혈관평활근세포의 증식, 이동, 화 학주성등을 조절하게 된다고 알려져 있다 [9].
본 연구에서는 P. gingivalis LPS가 혈관평활근세포의 이동에 미치는 영향을 조사하고 그 기전을 조사하였다. P. gingivalis LPS는 혈관평활근세포에서 대표적인 염증 성 사이토카인인 interleukin-6 (IL-6)의 발현 및 분비를 증가시키며, 이것이 혈관평활근세포의 이동에 관여하고 있음을 확인하였다.
실험재료 및 방법
실험재료
P. gingivalis LPS는 Invivogen (USA)에서 구입하여 사 용하였으며, Phospho-ERK1/2, ERK1/2, phospho-Akt, Akt, phospho-p38MAPK, p38MAPK 항체들은 Cell signaling technology (USA)에서 구입하여 사용하였다. Anti-α-tubulin 항체는 Biogenex (USA)에서 구입하였다.
혈관평활근세포배양
Sprague-Dawley 쥐 (45~55 g) 3주령 수컷을 에테르로 마취 시켜 희생시킨 다음 대동맥을 적출하여 지방조직과 남은 혈액을 제거한 후 6-well plate에 각각 조직을 적절하게 잘라 혈관의 안쪽 면이 아래쪽으로 향하도록 놓고 cover slip (22mm*22mm)을 덮어 조직을 지지시켰다. 여기에 10% FBS (GibcoBRL, USA)과 1% Penicillin-streptomycin (GibcoBRL, USA), 5 ㎍/ml Plasmocin (invivogen, USA) 이 첨가된 DMEM (GibcoBRL, USA) 배지를 첨가하여 5% CO2가 공급되는 3 7℃ 세포 배양기에서 7일간 배양하였다. 이후 현미경으로 혈관평활근세포가 자라는 것을 확인한 후 3-5일마다 계대 배양하며 5-8 세대 사이의 세포를 실험에 사용하였다.
RNA 분리와 중합효소연쇄반응 (Reverse transcriptionpolymerase chain reaction; RT-PCR)
혈관평활근세포에서 Total RNA를 추출하기 위해 RiboEx reagent kit (GeneAll Biotechnology, korea)를 사용 하였다. Reverse transcription kit (Promega, USA)를 사용 하여 2 ㎍의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 는 β-actin (sense: 5′-GACTACCTCATGAAGATC- 3′, antisense: 5′-GATCCACATCTGCTGGAA-3′), rat IL-6 (sense: 5′-CAAGAGACTTCCAGCCAGTTGC3′, antisense: 5′-TTGCCGAGTAGAC
CTCATAGTGACC-3′)의 primer를 이용하여 역전사중 합효소연쇄반응을 시행하였다. Real-time PCR 은 power SYBR Green (Applied Biosystems, USA) 시약을 사용하 였으며, 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) 기기를 사용하여 실시하였다. PCR 반응 조건은 95℃에서 10분간 1주기, 변성 (denaturation) 반응은 95℃ 에서 15초, 결합 (annealing) 반응을 60℃에서 60초, 중합 (extension) 반응을 72℃에서 7초간 40주기를 반복하여 반응시켰다. 각각의 primer는 다음과 같다. GAPDH (sense: 5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′, antisense: 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′), rat IL-6 (sense: 5′ -AGAGACTTCCAGCCAGTTGC-3′, antisense: 5′-AGCCTCC GACTTGTGAAGTG-3′).
효소결합면역흡착분석법 (Enzyme-linked immunosorbent assays: ELISA)
Sprague-Dawley 쥐 6주령 수컷의 대동맥을 적출하여 지방조직과 남은 혈액을 제거한 후 작은 조각으로 잘라 10% FBS와 1% Penicillin-streptomycin, 5 ㎍/ml Plasmocin 이 첨가된 DMEM 배지에 넣은 후 P. gingivalis LPS (5 ㎍/mL)을 2, 8시간 동안 처리하여 배양액을 수집하였다. 이 배양액을 4°C에서 12,000 rpm, 1분 원심 분리하여 상 층액을 얻어 효소결합면역흡착검사키트 (BioLegend, USA) 및 포함된 제품 설명서에 의거하여 배양액에 분비된 IL-6 단백질의 농도를 측정하였다.
Western immunoblot analysis
수확한 혈관평활근세포를 3회 차가운 PBS로 세척한 후 세포용해 용액 (RIPA buffer, Proteinase inhibitor, 1 mM PMSF, 10 mM NaF 및 10 mM Na3VO4)으로 용해시 켰다. 각 단백질의 양은 BCA (Sigma Aldrich, USA) 정 량법으로 측정하였다. 25 ㎍의 전체 단백질을 SDSPAGE (poly acrylamide gel electrophoresis)로 변성 분리하 였고, 이를 nitrocellulose membrane (Amersham Pharmacia Biotech, USA) 막에 전이시켰다. Membrane의 blocking을 5% skim milk가 함유된 TBS-T (TBS, 0.1% Tween 20) 용액으로 상온에서 1시간 동안 실시한 후, 단백질의 발 현을 측정하기 위해 적절한 1차 항체를 4°C에서 16시간 동안 반응시켰다. 이어서 TBS-T용액으로 10분 간격으로 3회 세척한 다음 Horseradish peroxidase가 결합된 이차항 체를 실온에서 2시간 반응시키고, 다시 TBS-T용액으로 10 분 간격으로 3회 세척한 다음 화학발광제 (ECL: Amersham PharmaciaBiotech, USA)를 반응시킨 후 LAS4000 (GE Healthcare Life Sciences, Sweden) 기기로 단백질 발현을 확인하였다.
혈관평활근세포의 이동성 분석 (Transwell migration assay)
세포이동의 측정은 transwell chamber법을 사용하였다. Transwell migration chamber (Corning Life Science, USA)의 low chamber에 1% FBS를 함유한 DMEM에 혈관평활근세 포의 이동을 유도하는 P. gingivalis LPS (5 ㎍/mL)와 IL-6 중화항체 (Abcam, UK) (20 ㎍/mL)을 넣었다. Upper chamber의 insert에는 IL-6 중화항체 (20 ㎍/mL)와 각 well 당 5 × 104개의 혈관평활근세포를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 filter의 아랫면을 메탄올 (SK chemical, Korea)로 고정시키고, hematoxilin 및 eosin (DAKO, Germany)으로 염색시킨 후 insert 내면을 면봉으로 닦아 이동하지 않은 세포를 제거 한 뒤 염색된 세포를 광학현미경 (Nikon, Japan)으로 관찰 하며 계수하였다.
통계처리
모든 실험치는 세 번 실험하여 얻어진 평균 및 평균의 표준 편차로 표시하였고 그룹간의 통계적 차이는 Student's t-test를 적용하여 분석하였다. 대조군과 비교하여 P < 0.1인 경우에 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
결 과
혈관평활근세포 이동에 미치는 P. gingivalis LPS의 효과
혈관평활근세포의 이동은 다양한 혈관계 질환의 진행 과정에서 필수적인 단계로 여겨지고 있다[7]. 따라서 본 실험에서는 P. gingivalis LPS가 혈관평활근세포의 이동 에 어떠한 영항을 미치는 지 transwell chamber를 이용하 여 조사하였다. Low chamber에 P. gingivalis LPS를 5 ㎍ /mL 처리하여 24시간 배양 후 transwell chamber에 이동 된 세포를 hematoxilin과 eosin 염색을 통해 확인하였다 (그림 1A). 대조군에 비해 P. gingivalis LPS를 처리하였 을 때 혈관평활근세포의 이동이 확연히 증가함을 확인 하였고, 이동한 세포의 수를 계수한 결과 2배 이상 증가 함을 확인하였다 (그림 1B).
혈관평활근세포에서 P. gingivalis LPS가 IL-6 발현 에 미치는 영향
혈관평활근세포의 이동에 IL-6가 관여한다는 여러 사실 이 보고되고 있다 [10,11]. 따라서 P. gingivalis LPS가 IL-6의 발현을 변화시키는 지를 조사하였다. P. gingivalis LPS가 혈 관평활근세포에서 IL-6 mRNA 발현에 어떠한 영향을 미치 는지를 관찰하기 위해 P. gingivalis LPS를 시간별로 처리하 여 IL-6의 mRNA 발현을 RT-PCR법으로 조사하였다. 그 결 과, 그림 2A에서 보는 바와 같이 P. gingivalis LPS를 시간대 별로 처리하였을 때, IL-6의 mRNA의 발현이 1시간과 2시간 에서 대조군에 비해 증가되었음을 확인하였다. 뿐만 아니라 유전자들의 발현 차이를 정량적으로 비교하고자 Real-time PCR을 수행하였다. GAPDH의 발현양에 대해 상대적인 발 현차이를 비교하였을 때 IL-6의 경우 P. gingivalis LPS 2시간 처리시 눈에 띄는 발현차이를 보였다 (그림 2B). 따라서 RT-PCR 과 Real-time PCR을 통해 P. gingivalis LPS가 혈관평 활근세포에서 IL-6의 mRNA 발현을 증가시키고 있음을 확 인하였다. 그렇다면 P. gingivalis LPS가 분비성 IL-6 단백질 의 양을 증가시키는지 알아보기 위해 쥐로부터 대동맥을 얻어 효소결합면역흡착법 (ELISA)을 실시하였다. 쥐 대동 맥에 P. gingivalis LPS을 처리하여 얻은 배양액을 수집하여 배양액에 분비된 IL-6 단백질의 농도를 측정하였다. 측정 결과 대조군에 비해 P. gingivalis LPS 2시간 처리한 실험군 에서 10배 이상 증가된 IL-6 분비성 단백질량이 관찰되었고, 8시간 처리하였을 때 역시 대조군에 비해 IL-6 단백질의 농 도가 2배 가까이 증가함을 확인하였다 (그림 2C). 따라서 효소결합면역흡착법을 통해 P. gingivalis LPS가 분비성 IL-6 단백질의 양을 증가시킴을 알 수 있다.
P. gingivalis LPS가 혈관평활근세포의 신호전달경로 의 활성에 미치는 영향
치주인대세포에서 P. gingivalis LPS가 ERK1/2 및 Akt 신호전달 경로를 활성화 시켜서 IL-7 및 IL-23의 발현을 유도한다고 알려져 있다 [12]. 본 연구에서도 P. gingivalis LPS가 혈관평활근세포에서 이러한 신호전달경로를 활성 화시키는 지에 대하여 조사하였다. P. gingivalis LPS가 혈 관평활근세포에서 ERK1/2, p38 MAPK, Akt의 활성을 자 극하는지를 각각의 특정 항체를 이용한 Western blot 법으 로 확인하였다. P. gingivalis LPS는 ERK1/2와 p38MAPK, Akt의 총단백질량에는 큰 영향을 끼치치 않고, 인산화를 유도하였음을 확인하였다 (그림 3A). 이는 ERK, p38MAPK, Akt의 인산화는 혈관평활근세포를 자극을 준지 10분 이 내에 증가하는 양상을 보였다. 따라서 혈관평활근세포에 서 P. gingivalis LPS가 유도하는 IL-6의 발현에 ERK, p38MAPK, Akt 신호전달경로가 관여하는 지를 이들의 신 호전달 인산화 효소 저해제를 처리하여 조사하였다. 그림 3B에서 보는 바와 같이 phosphatidylinositol 3-kinase 저해 제인 LY294002, MEK 특이적 저해제인 U0126, p38MAPK 의 선택적 저해제인 SB203580를 혈관평활근세포에 전처 리하였을 때 P. gingivalis LPS가 증가시켰던 IL-6 mRNA 발현이 감소되었다. 그리고 신호전달 인산화 효소 저해제 들에 의한 IL-6 mRNA 유전자들의 발현 변화를 정량적으 로 확인하기 위해 real-time PCR을 수행하여 발현 변화를 다시 한 번 확인하였다 (그림 3C).
P. gingivalis LPS가 촉진하는 혈관평활근 세포의 이동 능에 IL-6의 관련성
P. gingivalis LPS가 유도하는 혈관평활근세포의 이동에 P. gingivalis LPS가 증가시킨 분비성 IL-6가 매개하는 지를 확인하기 위해 transwell의 low chamber 및 upper chamber에 IL-6 중화항체 (neutralizing antibody)를 20 ㎍/mL 처리하여 P. gingivalis LPS가 촉진시키는 이동능에 어떠한 영향을 끼 치는지 조사하였다. 대조군과 비교하여 P. gingivalis LPS에 의해 3배 이상 증가된 혈관평활근세포의 이동능이 IL-6 중 화항체를 전처리 하였을 때 절반 이상 감소됨을 확인하였다 (그림 4A와 4B). 이러한 결과로 미루어 보아 IL-6가 P. gingivalis LPS가 유도하는 혈관평활근세포의 이동에 관여 하고 있음을 알 수 있다.
고 찰
여러 가지 역학조사에서 P. gingivalis가 심혈관계 질환, 당뇨병, 미숙아 출산, 류마티스성 관절염등과 같은 전신성 질환의 진행에 관여하고 있는 것으로 보고 되어 있다 [13]. 특히 P. gingivalis를 포함한 치주질환 병인균들이 동맥경 화증, 관상심장질환, 하지동맥질환, 심내막염의 심장판막 등을 포함한 여러 가지 심혈관질환을 가진 환자들에게서 발견되고 있다 [14]. 또한 ApoE 결손생쥐와 같은 콜레스테 롤혈증 동물모델 및 고지방식 섭취 동물모델에서 P. gingivalis 감염에 의해 동맥경화증이 촉진된다는 사실이 밝혀졌다 [15]. 이러한 결과들은 P. gingivalis 감염이 동맥 경화증의 형성 및 진행에 중요한 위험요인으로 작용할 것 이라는 가정을 강력하게 뒷받침해주고 있으나 이를 설명 할 수 있는 정확한 기전에 대해서는 잘 알려져 있지 않다 . 동맥경화증의 초기단계에서는 사이토카인이 단핵구를 모집을 조절하게 된다 [16]. P. gingivalis와 연관된 치주염 환자의 염증성 병변 유래 염증성 세포에서 prostaglandins, interleukin-1β, interleukin-8, C-reactive protein, tumor necrosis factor 같은 여러 가지 사이토카인을 분비되며, 이 들은 전신성 순환계에서도 높은 수준으로 관찰된다 [17]. 혈류에 있는 높은 농도의 수용성 염증성 매개물질들이 더 많은 염증성 세포를 활성화 시키고 불러들이게 된다. 활성 화된 염증성 세포가 활성산소를 생산케 되고 이것이 산화 된 저밀도 리포단백질 (low-density lipoprotein) 및 거품세 포를 혈관 내에 생성하게 한다 [18]. 예전 보고에 따르면 혈관내피세포가 상처를 입은 이후 P. gingivalis가 혈관평 활근세포에 노출되어 S100 calcium-binding protein A9 (S100A9) 발현이 높아진 후 혈관평활근세포의 수축성 형 질이 증식능이 활발해진 염증성 형질로 바뀌게 된다고 알 려져 있다[19]. 따라서 본 연구에서 밝혀진 P. gingivalis LPS가 유도한 IL-6와 S100A9와의 상관관계를 규명하고 이것이 혈관평활근세포의 이동능에 어떠한 영향을 미치는 지에 대한 추가 연구가 필요할 것이다.
IL-6는 주요 염증성 사이토카인중 하나로써 단핵구, T- 세포, 섬유아세포, 혈관내피세포와 같은 여러 가지 종류의 세포에서 합성되고 분비된다 [20]. 15-lipoxygenase 2 대사 물질인 15(S)-HETE가 유도한 혈관평활근세포의 이동에 IL-6가 필요하다는 사실이 보고된 바 있다 [11]. 또한 최근 에는 toll-like receptor 4 (TLR4) 또는 TLR2 활성화에 의해 유도된 IL-6가 혈관평활근세포의 이동을 촉진시키며, 이 과정 중에 혈관평활근세포 내 p38MAPK 및 ERK1/2이 활 성화되어 있음이 보고되었다 [21,22]. IL-6는 막결합 수용 체 (IL-6R) 또는 수용성 수용체 (sIL-6R)를 통해 세포내 신 호전달을 활성화시키며, 이들 과정에서 막단백질인 gp130 의 결합을 필요로 하게 된다 [23]. 막결합 수용체를 통한 고전적 IL-6 신호기전은 주로 재생 및 보호기능을 유발하 게 되고, 반면에 수용성 수용체를 통한 IL-6 신호기전은 염 증성 반응을 일으킨다고 알려져 있다 [24]. 수용체 결합에 의한 IL-6의 세포내 신호기전은 주로 STAT (signal transducer and activator of transcription)-의존적 또는 -비의존적으로 일어난다고 한다 [25]. 본 연구에서는 P. gingivalis LPS가 혈관평활근세포에서 IL-6 발현 및 분비를 증가시킨다고 보고하고 있다. 따라서 P. gingivalis LPS에 의해 유도된 IL-6는 혈관평활근세포에 존재하는 어떠한 IL-6 수용체를 통해 혈관평활근세포의 이동을 조절하고 있는지는 향후 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다. 조절장애에 의한 IL-6의 계속적인 합성은 자가면역질환, 만성염증질환, 암 과 같은 여러 질환들의 진행과정에 관여하게 된다[26]. 최 근 많은 보고에서 IL-6 및 IL-6 수용체를 표적으로 하는 항 체 및 약물을 이용하여 IL-6 활성을 임상적으로 차단함으 로써 만성염증성 질환 및 고형암의 치료에 적용되고 있으 며 그와 관련된 연구가 활발히 진행 중이다 [27]. 따라서 본 연구를 기반으로 한 심화연구에서는 IL-6 및 IL-6 수용 체 표적약물을 이용하여 치주염 및 치주염 관련 혈관계 질 환에 적용이 가능한 지에 대해 조사해 볼 가치가 있을 것 으로 생각된다.
