서 론

중추신경계의 항상성 조절에서 다양한 기능을 하는 microglia는 중추신경계의 resident immunological cell이며 내재 및 적응 면역 반응에 관여한다. Microglia cell은 알츠 하이머병, 파킨슨병 및 다발성 경화증 같은 여러 신경 퇴 행성 질환에서 신경 손상을 일으키는 데에 관여한다고 알 려져 있다[1,2]. 최근, microglia-유도 신경독성과 apoptosis 의 관련성에 관한 여러 연구들이 보고된 바 있다[3].

Type I programmed cell death라고도 불리는 apoptosis는 세포 증식과 세포사 간의 균형을 유지하는 중요한 기능을 하는 선택적인 생리학적 과정이다. 다양한 자극으로 인해 세포사멸로 이어지는 돌이킬 수 없는 과정이 촉발된다. 대부분의 세포독성 및 신경독성 물질들은 apoptosis를 통 해 cell death를 일으킨다[4,5]. Apoptosis-유도 물질의 이점 은 잠재적으로 유해한 세포를 염증반응 없이 제거하는 것 이다.

오늘날 많은 종류의 신경퇴행성 질환 치료제들이 개 발되었지만 그저 증상만 약화시켜줄 뿐이며[6], 그 약물 들의 부작용 또한 중요한 문제가 되고 있다[7]. 따라서 부작용이 적으며, 우수한 활성을 가지는 약재의 개발이 필요하다. 최근 천연약용식물에서부터 그러한 치료제를 개발하려는 노력이 활발하게 진행되고 있다[8-11].

또한 microglia가 다양한 신경성 질병에서 neuronal cell death와 관련되어 있다는 연구가 보고되고 있으며[1,12-15], microglia cell을 조절하여 microglia나 다른 신경 세포를 보호하는 저분자 물질 혹은 추출물을 찾으려는 노력이 진행되고 있다[14,16-18]. 따라서 microglia cell의 세포사 멸 조절 물질을 찾게 된다면 microglia cell의 세포 사멸 에 대한 이해가 증가하게 되고 이러한 결과는 향 후 많 은 추가 시험 및 결과에 따라 신경성 질환의 치료제 개 발에 일부 도움 및 방향 제시의 가능성이 있다고 생각된 다. 본 연구에서는, 신경 보호 효과와 신경 독성에 대한 연구에서 광범위하게 쓰이는 대표적인 microglial cell인 BV-2 cell에서[5,16,19,20] 천연약재추출물의 cell death 유 도 효과에 대하여 알아보았다.

재료 및 방법

실험 재료

세포 배양에는 Dulbecco's modified Eagle’s medium (DMEM) (Welgene, USA), fetal bovine serum (FBS) (Gibco, USA) 그리고 penicillin/streptomycin (Gibco, USA)이 사용되 었다.

Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) (Duchefa, USA), dimethyl sulfoxide (DMSO) (Duchefa, USA), Nondet P-40 (NP40) (Sigma-Aldrich, USA) 그리고 Isopropanol (Merk Millipore, Germany)은 MTT assay에 사용되었다.

Western blot analysis에서 tween 20 (Sigma-Aldrich, USA, #P7949), NaF (Sigma-Aldrich, USA), Na₃VO₄ (Sigma-Aldrich, USA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (Sigma-Aldrich, USA), Protease Inhibitor (Roche diagnostics, USA), Protein assay dye reagent (Bradford assay reagent, Bio-Rad, USA) 및 polyvinylidene fluoride (PVDF)-membrane (Merk Millipore, Germany)이 사용되었다. Horseradish peroxidase (HRP)를 이 용한 detection에는 West pico chemiluminescent substrate solution (Thermo scientific, USA)이 사용되었다. 본 실험에 사용된 항체는 다음과 같다. Rabbit polyclonal anti-caspase-3 (Cell signaling technology, USA), rabbit polyclonal anti-PARP (Cell signaling technology, USA), rabbit polyclonal anti-Bcl-2 (Cell signaling technology, USA), rabbit polyclonal anti-human anti-Bax (Cell signaling technology, USA), mouse polyclonal anti-α-tubulin (Santa cruz biotechnology, USA), rabbit polyclonal anti-vinculin (Santa cruz biotechnology, USA), Goatanti- mouse HRP-conjugated secondary IgG antibody (Bethyl, USA) 그리고 Goat-anti-rabbit HRP-conjugated secondary IgG antibody (Bethyl, USA).

약재 및 추출법

본 실험에서 사용한 약재는 식품의약품안전처 승인 한약 규격품으로 정도약업사(Seoul, Korea)에서 구입하였 다. 약 50 g의 약재를 7배의 70% 에탄올을 가하여 24 시간 동안 상온에서 침출하거나, 1시간 동안 초음파로 추출한 후 감압 여과하였다. 여과액을 감압 농축 한 후 -60℃ 이하에서 얼려 동결 건조하여 분말화하였다. 분말 은 -20℃에 보관 후 실험 시 DMSO에 녹여 사용하였다. 건강피 [Zingiberis Rhizoma (ZR)]의 경우 상온 침출하였 고, 수율은 2.16%였다.

세포 배양 및 형태적 변화 관찰

본 연구에서 사용된 세포는 microglia BV-2 cell이다. Microglia BV-2 cell은 5% FBS와 antibiotics (100 IU/ml penicillin 그리고 100 μg/ml streptomycin)가 포함된 DMEM 에 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. BV-2 cell의 population doubling time은 본 실험의 조건에서 24시 간 미만이었다.

BV-2 cell에 여러 농도의 ZR을 24시간 동안 처리 한 후 위상차 현미경 (Primo Vert, Zeiss, Germany)으로 형태적 변 화를 관찰하였다.

세포 독성 분석

추출물의 세포 독성을 알아보기 위하여, MTT assay로 세포 생존율을 측정하였다. 세포를 96-well plate에 3 × 10⁴ cells/well로 seeding하여 여러 농도의 MPEs을 처리하였다. 20시간 배양 후, MTT를 20 μl (5 mg/ml) 처리하여 37℃에 서 4시간 동안 반응시켰다. 상층액을 제거하고 dissolving solvent (4 mM HCl and 0.1% NP-40 in isopropanol)를 150 μl 넣어 충분히 섞어 주고, microplate reader (Wallac Victor 3-V, Perkinelmer, USA)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Western blot analysis

BV-2 cell에 여러 농도의 ZR을 여러 시간 동안 처리 하 여 apoptosis 관련 단백질의 발현 변화를 관찰하였다. 세 포를 lysis buffer (20 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.1% NP-40, 50 mM NaF, 2 mM EDTA, 1 mM Na₃VO₄ and protease inhibitor, pH 7.5)로 lysis하여 Bradford assay로 단백질 농 도를 측정하였다. 각 lysate에서 5 또는 10 μg의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리 한 후 PVDF membrane에 electrotransfer하였다. Membrane은 5% non-fat milk로 상온에서 1 시간 동안 block되었고, 그 후 specific primary antibody를 1: 1,000으로 희석하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 그리고 HRP-conjugated secondary antibody를 1: 10,000으로 희석하여 상온에서 15분간 반응 시키고 chemiluminescent substrate solution을 이용하여 단백질 band를 관찰하였다.

결 과

Screening of MPEs for cytotoxicity

Microglia BV-2 cell의 cell death를 유도하는 MPEs를 찾기 위해, 세포에 MPEs (Table 1)를 100 μg/ml 농도에서 24시간 처리하여 MTT assay로 세포 생존율을 측정하였다(Fig. 1). 그 중 40% 이하의 생존율을 나타내는 MPEs를 선택하여 그 들의 농도 의존적인 세포 독성을 관찰하였다(Fig. 2). 선택된 4가지 MPEs인 E4, E5, E19 그리고 E26은 각각 Foeniculi fructus, Forsythiae fructus, Zingiberis rhizoma 그리고 Hedera rhombea이며, 그들의 IC₅₀ 값은 각각 33, 83, 67 그리고 81 μg/ml이었다. 그 중 IC₅₀ 값이 낮고 상대적으로 좁은 범위에 서 cell death 유도 반응이 관찰되는 Zingiberis rhizoma(ZR)으 로 세포사멸의 메커니즘을 살펴보았다.

ZR induced of BV-2 cell death.

BV-2 cell에 ZR을 여러 농도로 24시간 동안 처리 한 후 위상차 현미경으로 세포 형태의 변화를 관찰하였다(Fig. 3). 그 결과 살아 있는 세포 수의 감소와 형태적 변화가 농도 의존적으로 관찰되었다. Apoptotic cell의 뚜렷한 형 태적 특징인 세포의 원형화가 관찰됨과 동시에 세포가 부 착되지 않고 떠있었으며, 수축되는 양상이 관찰되었다.

Effect of ZR treatment on caspase-3 activation

ZR의 apoptosis 유도 메커니즘을 알아보기 위해, apoptosis- 관련 단백질들의 발현 변화를 관찰해보았다. Western blot analysis를 통해 ZR이 처리된 BV-2 cell의 Bcl-2, Bax, caspase-3, 그리고 PARP [poly(ADP-ribosyl)polymerase] 발현 변화를 관찰하였다. Fig. 4에 나타난 것처럼, ZR을 여러 농도 로 24시간 처리 했을 때, apoptotic signaling pathways의 중요 한 조절인자인 Bcl-2[21] 발현은 유의성 있는 변화가 나타나 지 않았다. 하지만 pro-apoptotic 단백질인 Bax의 발현은 50 μg/ml 및 100 μg/ml로 처리시에 경미한 증가 양상을 보였다. 또한 ZR은 caspase-3의 proteolytic processing을 농도 의존적 으로 유도하여 processed active caspase-3가 나타나는 것이 관찰되었다. Caspase-3의 활성은 여러 단백질의 cleavage를 일으키는데, PARP도 그 중의 하나이다. PARP가 cell death 과정에서 필수적인 단백질은 아니지만, PARP의 cleavage는 apoptosis의 전형적인 특징 중 하나다. ZR은 PARP의 cleavage 또한 농도 의존적으로 유도하였다. 마찬가지로, ZR 100 μg/ml을 여러 시간 동안 처리 했을 때 시간 의존적으로 caspase-3와 PARP의 cleavage가 일어났다(Fig. 5).

고 찰

신약개발에서의 천연물의 중요성은 꾸준히 두드러졌 고[22,23], 다양한 질병의 신약개발에서 천연물은 좋은 원천이었다[24]. 천연물과 그 구성 분자들은 의약화학에 서 약물 디자인에 유용하게 쓰여져 왔다[25].

Zingiberis rhizome (건강피, ZR)는 Zingiber officinale Rocs (Zingiberaceae, 생강과)의 뿌리를 말린 것이다. ZR은 전통적으로 암, 당뇨, 거담 약제로 사용되었다[26]. ZR의 hexane fraction이 blood-brain barrier를 통과하는 것으로 알 려져 있으며, microglia로 인한 염증반응을 억제함으로써 neuronal damage를 완화시킨다고 보고된 바 있다[27]. 본 연구에서는 천연물들의 microglial BV-2 cell에서의 cell death-유도 효과에 대해서 조사하였다. 여러 MPEs 중에서 선택된 ZR은 cell death를 유도 하였고 IC₅₀ 값은 67 μg/ml 이었다. ZR의 BV-2이외의 다른 세포에 유해한 것인지를 알아보기 위해 PC-12 cell (ATCC CRL-1721)과 U-2 OS cell (ATCC HTB-96)에도 ZR을 100 μg/ml의 농도로 처리 하여 본 결과 각각 107.7±10.1% 및 95.2±15.4%의 생존율 을 보여 ZR이 BV-2 cell에서 유의하게 세포사멸을 유도하 는 것으로 보인다. ZR이 유도하는 cell death의 경로를 탐 색하기 위해 necrosis 및 autophagy 등 cell death와 관련 있 는 경로를 조사하였으나, ZR이 BV-2 cell에서 이러한 경 로에 대한 관여는 미미하였다 (data not known).

본 연구에서 ZR의 apoptosis 유도효과를 알아보기 위해 apoptosis-관련 단백질의 발현 변화를 알아보았다. 그 결과, anti-apoptotic protein인 Bcl-2의 변화는 관찰되지 않았지만 pro-apoptotic protein인 Bax의 발현은 경미한 농도의존적인 증가가 관찰되었다. 결과적으로 apoptosis 유도에서 중요한 Bcl-2/Bax의 비율이[28] 감소하게 되어 apoptosis가 유도된 것으로 생각된다. BV-2 cell에 ZR을 처리 했을 때 농도 및 시간 의존적으로 caspase-3가 활성화 되는 것으로 나타났 다. 그에 따라 downstream 단백질인 PARP의 cleavage도 관 찰되었으며 이는 약물 처리로 유도된 caspase 활성에 의한 PARP cleavage가 관찰된 연구들과 유사한 결과를 보였다 [29,30]. 이러한 결과들은 Neuron등에 대한 안전성 실험 등 다 각도의 추가 실험을 통한다면 ZR이 신경퇴행성 질환의 신약 개발에 있어 도움이 될 가능성이 있음을 시사한다.