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ISSN : 1226-7155(Print)
ISSN : 2287-6618(Online)
International Journal of Oral Biology Vol.42 No.1 pp.9-15
DOI : https://doi.org/10.11620/IJOB.2017.42.1.009

Apoptosis Induction Effect of Zingiberis Rhizoma Extract in Microglia BV-2 Cells

Jeongbin Seo1, Myung Sook Oh1, Young Pyo Jang1, Jeong Hee Kim1,2*
1Department of Life and Nanopharmaceutical Sciences, Graduate School
2Department of Oral Biochemistry and Molecular Biology and Kyung Hee University, Seoul 130-701, Korea
Correspondence to: Jeong Hee Kim, Department of Life and Nanopharmaceutical Sciences, Graduate School and Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Dentistry, Kyung Hee University, Seoul 130-701, Korea +82-2-961-0915, +82-2-960-1467jhkimh@khu.ac.kr
January 9, 2017 February 20, 2017 February 21, 2017

Abstract

Microglia have multiple functions in regulating homeostasis of the central nervous system. Microglia cells have been implicated as active contributors to neuron damage in neurodegenerative disorders. In this study, medicinal plant extracts (MPEs) were used to evaluate the cell-death induction effect in microglia BV-2 cells. Among 35 MPEs tested in this study, 4 MPEs showed less than a 30% cell survival after 24 hours of incubation. These were Foeniculi Fructus, Forsythiae Fructus, Zingiberis Rhizoma and Hedera Rhombea. The concentration showed that 50% cell death (IC50) occurred with 33, 83, 67 Ed highlight: Please confirm wording, and 81 μ /ml, respectively. For further study, we chose Zingiberis Rhizoma (ZR) which showed a reasonably low IC50 value and an induction of cell death in a relatively narrow range. Western blot analysis showed that ZR-treated cells showed activation of caspase-3 and cleavage of PARP Ed highlight: When an acronym is first presented it needs to be spelled out in both dose- and time-dependent manners. However, the level of Bcl-2 and Bax were not changed by ZR-treatment in BV-2 cells. These results suggest that ZR-induced apoptosis in BV-2 cells occured through caspase-3 activation. The results also suggested that ZR may be useful in developing treatments for neurodegenerative diseases.


초록


    National Research Foundation
    Ministry of Education, Science and Technology
    2012M3A9C6049936
    © The Korean Academy of Oral Biology. All rights reserved

    This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

    서 론

    중추신경계의 항상성 조절에서 다양한 기능을 하는 microglia는 중추신경계의 resident immunological cell이며 내재 및 적응 면역 반응에 관여한다. Microglia cell은 알츠 하이머병, 파킨슨병 및 다발성 경화증 같은 여러 신경 퇴 행성 질환에서 신경 손상을 일으키는 데에 관여한다고 알 려져 있다[1,2]. 최근, microglia-유도 신경독성과 apoptosis 의 관련성에 관한 여러 연구들이 보고된 바 있다[3].

    Type I programmed cell death라고도 불리는 apoptosis는 세포 증식과 세포사 간의 균형을 유지하는 중요한 기능을 하는 선택적인 생리학적 과정이다. 다양한 자극으로 인해 세포사멸로 이어지는 돌이킬 수 없는 과정이 촉발된다. 대부분의 세포독성 및 신경독성 물질들은 apoptosis를 통 해 cell death를 일으킨다[4,5]. Apoptosis-유도 물질의 이점 은 잠재적으로 유해한 세포를 염증반응 없이 제거하는 것 이다.

    오늘날 많은 종류의 신경퇴행성 질환 치료제들이 개 발되었지만 그저 증상만 약화시켜줄 뿐이며[6], 그 약물 들의 부작용 또한 중요한 문제가 되고 있다[7]. 따라서 부작용이 적으며, 우수한 활성을 가지는 약재의 개발이 필요하다. 최근 천연약용식물에서부터 그러한 치료제를 개발하려는 노력이 활발하게 진행되고 있다[8-11].

    또한 microglia가 다양한 신경성 질병에서 neuronal cell death와 관련되어 있다는 연구가 보고되고 있으며[1,12-15], microglia cell을 조절하여 microglia나 다른 신경 세포를 보호하는 저분자 물질 혹은 추출물을 찾으려는 노력이 진행되고 있다[14,16-18]. 따라서 microglia cell의 세포사 멸 조절 물질을 찾게 된다면 microglia cell의 세포 사멸 에 대한 이해가 증가하게 되고 이러한 결과는 향 후 많 은 추가 시험 및 결과에 따라 신경성 질환의 치료제 개 발에 일부 도움 및 방향 제시의 가능성이 있다고 생각된 다. 본 연구에서는, 신경 보호 효과와 신경 독성에 대한 연구에서 광범위하게 쓰이는 대표적인 microglial cell인 BV-2 cell에서[5,16,19,20] 천연약재추출물의 cell death 유 도 효과에 대하여 알아보았다.

    재료 및 방법

    실험 재료

    세포 배양에는 Dulbecco's modified Eagle’s medium (DMEM) (Welgene, USA), fetal bovine serum (FBS) (Gibco, USA) 그리고 penicillin/streptomycin (Gibco, USA)이 사용되 었다.

    Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) (Duchefa, USA), dimethyl sulfoxide (DMSO) (Duchefa, USA), Nondet P-40 (NP40) (Sigma-Aldrich, USA) 그리고 Isopropanol (Merk Millipore, Germany)은 MTT assay에 사용되었다.

    Western blot analysis에서 tween 20 (Sigma-Aldrich, USA, #P7949), NaF (Sigma-Aldrich, USA), Na3VO4 (Sigma-Aldrich, USA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (Sigma-Aldrich, USA), Protease Inhibitor (Roche diagnostics, USA), Protein assay dye reagent (Bradford assay reagent, Bio-Rad, USA) 및 polyvinylidene fluoride (PVDF)-membrane (Merk Millipore, Germany)이 사용되었다. Horseradish peroxidase (HRP)를 이 용한 detection에는 West pico chemiluminescent substrate solution (Thermo scientific, USA)이 사용되었다. 본 실험에 사용된 항체는 다음과 같다. Rabbit polyclonal anti-caspase-3 (Cell signaling technology, USA), rabbit polyclonal anti-PARP (Cell signaling technology, USA), rabbit polyclonal anti-Bcl-2 (Cell signaling technology, USA), rabbit polyclonal anti-human anti-Bax (Cell signaling technology, USA), mouse polyclonal anti-α-tubulin (Santa cruz biotechnology, USA), rabbit polyclonal anti-vinculin (Santa cruz biotechnology, USA), Goatanti- mouse HRP-conjugated secondary IgG antibody (Bethyl, USA) 그리고 Goat-anti-rabbit HRP-conjugated secondary IgG antibody (Bethyl, USA).

    약재 및 추출법

    본 실험에서 사용한 약재는 식품의약품안전처 승인 한약 규격품으로 정도약업사(Seoul, Korea)에서 구입하였 다. 약 50 g의 약재를 7배의 70% 에탄올을 가하여 24 시간 동안 상온에서 침출하거나, 1시간 동안 초음파로 추출한 후 감압 여과하였다. 여과액을 감압 농축 한 후 -60℃ 이하에서 얼려 동결 건조하여 분말화하였다. 분말 은 -20℃에 보관 후 실험 시 DMSO에 녹여 사용하였다. 건강피 [Zingiberis Rhizoma (ZR)]의 경우 상온 침출하였 고, 수율은 2.16%였다.

    세포 배양 및 형태적 변화 관찰

    본 연구에서 사용된 세포는 microglia BV-2 cell이다. Microglia BV-2 cell은 5% FBS와 antibiotics (100 IU/ml penicillin 그리고 100 μg/ml streptomycin)가 포함된 DMEM 에 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. BV-2 cell의 population doubling time은 본 실험의 조건에서 24시 간 미만이었다.

    BV-2 cell에 여러 농도의 ZR을 24시간 동안 처리 한 후 위상차 현미경 (Primo Vert, Zeiss, Germany)으로 형태적 변 화를 관찰하였다.

    세포 독성 분석

    추출물의 세포 독성을 알아보기 위하여, MTT assay로 세포 생존율을 측정하였다. 세포를 96-well plate에 3 × 104 cells/well로 seeding하여 여러 농도의 MPEs을 처리하였다. 20시간 배양 후, MTT를 20 μl (5 mg/ml) 처리하여 37℃에 서 4시간 동안 반응시켰다. 상층액을 제거하고 dissolving solvent (4 mM HCl and 0.1% NP-40 in isopropanol)를 150 μl 넣어 충분히 섞어 주고, microplate reader (Wallac Victor 3-V, Perkinelmer, USA)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

    Western blot analysis

    BV-2 cell에 여러 농도의 ZR을 여러 시간 동안 처리 하 여 apoptosis 관련 단백질의 발현 변화를 관찰하였다. 세 포를 lysis buffer (20 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.1% NP-40, 50 mM NaF, 2 mM EDTA, 1 mM Na3VO4 and protease inhibitor, pH 7.5)로 lysis하여 Bradford assay로 단백질 농 도를 측정하였다. 각 lysate에서 5 또는 10 μg의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리 한 후 PVDF membrane에 electrotransfer하였다. Membrane은 5% non-fat milk로 상온에서 1 시간 동안 block되었고, 그 후 specific primary antibody를 1: 1,000으로 희석하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 그리고 HRP-conjugated secondary antibody를 1: 10,000으로 희석하여 상온에서 15분간 반응 시키고 chemiluminescent substrate solution을 이용하여 단백질 band를 관찰하였다.

    결 과

    Screening of MPEs for cytotoxicity

    Microglia BV-2 cell의 cell death를 유도하는 MPEs를 찾기 위해, 세포에 MPEs (Table 1)를 100 μg/ml 농도에서 24시간 처리하여 MTT assay로 세포 생존율을 측정하였다(Fig. 1). 그 중 40% 이하의 생존율을 나타내는 MPEs를 선택하여 그 들의 농도 의존적인 세포 독성을 관찰하였다(Fig. 2). 선택된 4가지 MPEs인 E4, E5, E19 그리고 E26은 각각 Foeniculi fructus, Forsythiae fructus, Zingiberis rhizoma 그리고 Hedera rhombea이며, 그들의 IC50 값은 각각 33, 83, 67 그리고 81 μg/ml이었다. 그 중 IC50 값이 낮고 상대적으로 좁은 범위에 서 cell death 유도 반응이 관찰되는 Zingiberis rhizoma(ZR)으 로 세포사멸의 메커니즘을 살펴보았다.

    ZR induced of BV-2 cell death.

    BV-2 cell에 ZR을 여러 농도로 24시간 동안 처리 한 후 위상차 현미경으로 세포 형태의 변화를 관찰하였다(Fig. 3). 그 결과 살아 있는 세포 수의 감소와 형태적 변화가 농도 의존적으로 관찰되었다. Apoptotic cell의 뚜렷한 형 태적 특징인 세포의 원형화가 관찰됨과 동시에 세포가 부 착되지 않고 떠있었으며, 수축되는 양상이 관찰되었다.

    Effect of ZR treatment on caspase-3 activation

    ZR의 apoptosis 유도 메커니즘을 알아보기 위해, apoptosis- 관련 단백질들의 발현 변화를 관찰해보았다. Western blot analysis를 통해 ZR이 처리된 BV-2 cell의 Bcl-2, Bax, caspase-3, 그리고 PARP [poly(ADP-ribosyl)polymerase] 발현 변화를 관찰하였다. Fig. 4에 나타난 것처럼, ZR을 여러 농도 로 24시간 처리 했을 때, apoptotic signaling pathways의 중요 한 조절인자인 Bcl-2[21] 발현은 유의성 있는 변화가 나타나 지 않았다. 하지만 pro-apoptotic 단백질인 Bax의 발현은 50 μg/ml 및 100 μg/ml로 처리시에 경미한 증가 양상을 보였다. 또한 ZR은 caspase-3의 proteolytic processing을 농도 의존적 으로 유도하여 processed active caspase-3가 나타나는 것이 관찰되었다. Caspase-3의 활성은 여러 단백질의 cleavage를 일으키는데, PARP도 그 중의 하나이다. PARP가 cell death 과정에서 필수적인 단백질은 아니지만, PARP의 cleavage는 apoptosis의 전형적인 특징 중 하나다. ZR은 PARP의 cleavage 또한 농도 의존적으로 유도하였다. 마찬가지로, ZR 100 μg/ml을 여러 시간 동안 처리 했을 때 시간 의존적으로 caspase-3와 PARP의 cleavage가 일어났다(Fig. 5).

    고 찰

    신약개발에서의 천연물의 중요성은 꾸준히 두드러졌 고[22,23], 다양한 질병의 신약개발에서 천연물은 좋은 원천이었다[24]. 천연물과 그 구성 분자들은 의약화학에 서 약물 디자인에 유용하게 쓰여져 왔다[25].

    Zingiberis rhizome (건강피, ZR)는 Zingiber officinale Rocs (Zingiberaceae, 생강과)의 뿌리를 말린 것이다. ZR은 전통적으로 암, 당뇨, 거담 약제로 사용되었다[26]. ZR의 hexane fraction이 blood-brain barrier를 통과하는 것으로 알 려져 있으며, microglia로 인한 염증반응을 억제함으로써 neuronal damage를 완화시킨다고 보고된 바 있다[27]. 본 연구에서는 천연물들의 microglial BV-2 cell에서의 cell death-유도 효과에 대해서 조사하였다. 여러 MPEs 중에서 선택된 ZR은 cell death를 유도 하였고 IC50 값은 67 μg/ml 이었다. ZR의 BV-2이외의 다른 세포에 유해한 것인지를 알아보기 위해 PC-12 cell (ATCC CRL-1721)과 U-2 OS cell (ATCC HTB-96)에도 ZR을 100 μg/ml의 농도로 처리 하여 본 결과 각각 107.7±10.1% 및 95.2±15.4%의 생존율 을 보여 ZR이 BV-2 cell에서 유의하게 세포사멸을 유도하 는 것으로 보인다. ZR이 유도하는 cell death의 경로를 탐 색하기 위해 necrosis 및 autophagy 등 cell death와 관련 있 는 경로를 조사하였으나, ZR이 BV-2 cell에서 이러한 경 로에 대한 관여는 미미하였다 (data not known).

    본 연구에서 ZR의 apoptosis 유도효과를 알아보기 위해 apoptosis-관련 단백질의 발현 변화를 알아보았다. 그 결과, anti-apoptotic protein인 Bcl-2의 변화는 관찰되지 않았지만 pro-apoptotic protein인 Bax의 발현은 경미한 농도의존적인 증가가 관찰되었다. 결과적으로 apoptosis 유도에서 중요한 Bcl-2/Bax의 비율이[28] 감소하게 되어 apoptosis가 유도된 것으로 생각된다. BV-2 cell에 ZR을 처리 했을 때 농도 및 시간 의존적으로 caspase-3가 활성화 되는 것으로 나타났 다. 그에 따라 downstream 단백질인 PARP의 cleavage도 관 찰되었으며 이는 약물 처리로 유도된 caspase 활성에 의한 PARP cleavage가 관찰된 연구들과 유사한 결과를 보였다 [29,30]. 이러한 결과들은 Neuron등에 대한 안전성 실험 등 다 각도의 추가 실험을 통한다면 ZR이 신경퇴행성 질환의 신약 개발에 있어 도움이 될 가능성이 있음을 시사한다.

    감사의 글

    This study was supported by a grant from BIO & Medical Technology Development Program of National Research Foundation of Korea grant (MEST, 2012M3A9C6049936).

    Figure

    IJOB-42-9_F1.gif

    Screening of MPEs for cytotoxicity in BV-2 cells. Cells were treated with 100 μg/ml of each MPE for 24 hrs and cell survival was measured by the MTT assay.

    IJOB-42-9_F2.gif

    Dose-dependent cytotoxicity of selected MPEs. BV-2 cells were treated with 0~100 μg/ml of E4, E5, E19 and E26 (Foeniculi fructus, Forsythiae fructus, Zingiberis rhizoma and Hedera rhombea respectively.) MPEs for 24 hrs and cell survival was measured by the MTT assay. IC50 values of 4 MPEs were measured.

    IJOB-42-9_F3.gif

    Antiproliferative effect of ZR in BV-2 cells. Morphological changes in BV-2 cells in response to ZR treatment. Cells were incubated with indicated concentrations of ZR for 24 hrs. Cell morphology was observed under a phase-contrast microscope (200X magnification) after ZR treatment.

    IJOB-42-9_F4.gif

    Dose-dependent changes in the expression of apoptosisrelated proteins in response to ZR treatment. BV-2 cells were treated with various concentrations of ZR for 24 hrs. Cell extracts were subjected to western blotting to determine immunoreactivity levels of Bcl-2, Bax, caspase-3, and PARP. Representative western blots are shown.

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    Time-dependent changes in the expression of apoptosisrelated proteins in response to ZR treatment. BV-2 cells were treated with 100 μg/ml of ZR for various time points. Cell extracts were subjected to western blotting to determine immunoreactivity levels of caspase-3, and PARP. Representative western blots are shown.

    Table

    Medicinal plant extracts (MPEs) used in this study

    Reference

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