서 론
정유(essential oil)는 식물의 꽃, 잎, 줄기, 뿌리 및 천 연수지 등에서 얻은 향기가 강한 휘발성 성분을 의미한 다. 정유의 효능은 항균, 항염증, 항진균, 항바이러스 및 항암 효과 등으로 알려져 있고, 천연물에서 얻어지는 정 유는 동서양을 막론하고 오래 전부터 의약품, 향장품 및 식품첨가물로 이용되어 왔으며, 또한 정유의 독특한 향 기를 활용하여 향기요법제, 화장품, 향수 및 비누 등으 로도 사용되고 있다 [1-3]. 치아우식증은 현재 전 세계적 으로 널리 분포해 있는 구강질환으로 한국인에게도 만 연하여 치아상실의 주된 원인 중 하나이다 [4-8]. 구강 내에는 500여종의 세균이 존재하는데, 치아우식증은 이 러한 구강세균에 의하여 유발되는 것으로 알려져 있다 [9,10]. 구강세균 중 Strepotococcus mutans (S. mutans)는 치면세균막 형성과 치아우식증 발생의 주요한 원인균으 로 보고된 바 있다 [11-13]. S. mutans는 구강내 치면세 균막에 상주하며 섭취한 음식물에 포함된 당질을 분해 하여 대사과정에서 유기산을 생성하여 분비하므로 치아 의 경조직을 탈회시켜 파괴하고, 세균의 효소는 치아 경 조직 단백질의 가수 분해를 일으킨다 [14-20].
산국 (Chrysanthemum boreale; C. boreale)은 10-11월에 걸쳐 전국의 야산에서 1-1.5 ㎝ 크기의 노란 꽃을 피우는 국화과 (Compositae)의 다년생 초본으로 야국(野菊)이라 고도 하는데 감국 (甘菊, Chrysanthemum indicum)과 함께 두통 및 염증성 질환에 전통적으로 많이 사용되어 왔으 며, 산국을 소재로 만든 산국주나 국화차는 신라시대부 터 오늘날까지 음용되어 왔다 [21,22]. 산국의 성분으로 는 정유성분과 linarin, luteolin의 배당체, chrysanthemin, chrysanthemaxanthin, 다당류, coumarins, yejuhua lactone, 등이 함유되어 있고, 정유 중의 주요 성분은 camphor, comphene, carvone 등이 알려져 있다 [23-25]. 최근 연구 결과에 따르면 산국 정유는 S. mutans의 biofilm 형성을 억제하며, 주요성분 중 하나로 ɑ-pinene이 함유되어 있는 것이 밝혀졌다 [26]. 본 연구에서는 산국 정유의 주요성 분 중 하나인 ɑ-pinene이 S. mutans의 성장과 산 생성 억 제 효과, biofilm 형성 억제효과 및 인공치아에 대한 S. mutans biofilm 억제효과, 주사 현미경을 이용한 S. mutans biofilm 생성 억제에 미치는 효과를 연구하여 우 식활성억제에 미치는 영향을 분석하고자 하였다.
재료 및 방법
재료
실험에 사용한 ɑ-pinene는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
균주 및 배양
본 실험에 사용한 균주는 S. mutans ATCC 25175로 Brain heart infusion (BHI, Difco Lab., Detroit, MI, USA) 액체배지에 1-2차 계대배양 후 같은 배지에 식균하여 37℃의 항온기에 서 24시간 배양하여 사용하였다.
S. mutans의 성장과 산 생성에 미치는 효과 측정
1%의 glucose가 들어 있는 BHI 액체배지에 ɑ-pinene을 첨가한 후 균을 5×105 CFU/ml/well이 되게 접종하였다. 3 7℃의 항온기에서 24시간 배양한 후 BHI 액체배지를 기 준으로 ELISA reader (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였으 며, pH meter (HANNA instrument, philippines)를 이용하여 pH를 측정하여 산 생성 억제 효과를 관찰하였다. 대조군 은 ɑ-pinene을 넣지 않고 시행하였다.
S. mutans biofilm 생성에 미치는 효과 측정
35 mm dish에 BHI 액체 배지와 ɑ-pinene를 첨가한 후 5×105 CFU/ml가 되게 균을 접종하였다. 그 후, 37℃ incubator에서 24시간 배양한 뒤 상청액을 모두 제거하 였다. 그런 다음, 각각의 dish에 증류수를 1.5 ml씩 넣어 서 washing 하였다. 0.1%의 safranin으로 30초 동안 염색 한 후 증류수로 두 번 세척하고 건조하여 사진 촬영을 한 다음, 30% acetic acid로 safranin stain을 용해시켜 96 well plate에 100 μl씩 분주하였다. 마지막으로 ELISA reader (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA)를 이 용하여 530 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 실 험물질을 넣지 않은 군을 대조군으로 하였다. 인공치 표 면에 형성되는 biofilm을 측정하기 위하여 인공치 (Endura, Shofu Inc., Kyoto, Japan)에 BHI 액체배지와 ɑ-pinene를 첨가하여 5×105 CFU/ml 농도로 세균을 접종 하였다. 37℃ incubator에서 24시간 배양 후 여액을 모두 제거하였다. 각각의 인공치에 증류수 1.5 ml씩 넣어서 세척하였다. 0.1%의 safranin으로 30초 동안 염색한 후 증류수로 두 번 세척하고 건조하여 사진 촬영을 시행하 였다.
주사전자현미경(Scanning electronic microscope; SEM) 관찰
35 mm dish에 BHI 액체배지와 ɑ-pinene를 첨가한 후 5×105 CFU/ml 균이 되게 접종하였다. 37℃ incubator에서 24시간 배양 후 상청액을 모두 제거하였다. 각각의 dish에 증류수 1.5 ml씩 넣어서 세척하였다. 그 뒤에 2.5% glutaraldehyde 용액 (in 0.1M sodium cacodylate buffer, pH 7.2, 4℃)에서 24 시간 동안 고정시켰다. 에탄올 70%를 시작으로 80%, 95%, 100%로 농도를 상승 배열하여 세척, 탈수하였다. 동결 건조 한 후 gold로 coating하여, SEM Scanning Electron Microscopy (SEM; JSM-6360, JEOL., Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하 고 촬영하였다.
공초점 레이저 현미경(Confocal Laser Scanning Microscopy; CLSM) 관찰
ɑ-Pinene의 농도에 따른 S. mutans의 살균 효과를 관찰하 기 위하여 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 이용하여 염색을 시행 한 후 CLSM (LSM 510, Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하 였다. BHI 액체배지에 ɑ-pinene을 농도별로 첨가한 후, S. mutans를 5×105 CFU/ml로 접종한 후 상온에서 5분 동안 방 치한 후 PBS (pH 7.2)로 3회 세척하였다. 살아있는 세포를 관찰하기 위해 SYTO와 Propidium Iodide (PI)로 이중염색을 시행한 후 암실에서 CLSM을 이용하여 관찰 하였다.
통계처리
실험은 모두 3회 반복하였으며, 억제비율은 [(대조군- 실험군)/대조군]×100의 식을 이용하여 계산하였다. 얻은 결과는 통계프로그램인 SPSS (ver 10.0)를 사용하여 평 균과 표준오차로 제시하였고, α=0.05 수준에서 실험군과 대조군의 평균치를 independent sample t-test로 유의성을 검증하였다.
결 과
세균 성장에 미치는 효과
ɑ-Pinene의 S. mutans에 대한 항균 활성을 관찰하기 위하 여 BHI 액체배지에 ɑ-pinene을 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml 의 농도로 첨가한 후, S. mutans를 접종하여 37℃ 항온기에서 24시간 배양한 후 흡광도를 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. ɑ-Pinene을 넣지 않은 대조군에서 0.291±0.004 흡광도를 나 타내었다. ɑ-Pinene을 0.0625 mg/ml 농도에서 0.295±0.003 흡 광도를 나타내고, 0.125 mg/ml 농도에서는 0.244±0.053, 0.25 mg/ml 농도에서는 0.085±0.076, 0.5 mg/ml에서는 0.008± 0.006 흡광도를 나타내었다. ɑ-Pinene을 첨가한 실험군의 O.D 값은 대조군의 O.D 값에 비해 농도 의존적으로 유의한 차이를 보이며 낮아져 성장 억제 효과를 보였으며, 실험군 은 각각의 농도에서 대조군에 비하여 각각 1.53%, 16%, 71%, 97%의 성장억제효과를 보였으며, 0.25 mg/ml 이상의 농도에서 유의성 있는 결과를 보였다.
산 생성에 미치는 효과
ɑ-Pinene 첨가에 따른 S. mutans에 의한 유기산 생성 억 제 효과를 알아보기 위해 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml 농도의 시료에 S. mutans를 접종하여 24시간 배양 후에 pH meter로 pH를 측정한 결과는 Table 1과 같다. 대조군 에서 세균을 배양하기 전 배지의 pH는 7.37±0.01로 중성 pH를 유지하였으나, 세균을 배양한 후 pH는 5.49±0.015로 떨어졌다. ɑ-Pinene을 0.0625 mg/ml 농도로 투여한 군에서 는 5.48±0.006, 0.125 mg/ml 농도에서는 5.59±0.057, 0.25 mg/ml 농도에서는 6.92±0.017, 0.5 mg/ml 농도에서는 7.37± 0.006을 나타내었다. ɑ-Pinene을 0.125 mg/ml 이상 투여한 군들에서는 농도 의존적으로 유의성 있게 pH하락이 억제 되었으며, 특히 0.25 mg/ml 농도이상에서는 임계 pH (pH 5.5 - 5.6) 이상을 나타냈다.
Biofilm 형성에 미치는 효과
ɑ-Pinene의 S. mutans biofilm 생성 억제 효과를 본 결과 Fig. 2와 같다. ɑ-pinene을 넣지 않은 대조군에서 0.870± 0.008 흡광도를 나타내었다. 그러나 0.0625 mg/ml 농도에 서 0.511±0.007 흡광도를 나타내었고, 0.125 mg/ml 농도에 서는 0.301±0.026, 0.25 mg/ml 농도에서는 0.153±0.003, 0.5 mg/ml 농도에서는 0.111±0.005 흡광도를 나타내어, 0.0625, 0.12, 0.25, 0.5 mg/ml의 농도에서 대조군에 비해 S. mutans biofilm 생성 억제정도가 41%, 65%, 82%, 87%로 0.25 mg/ml 이상 농도에서 대조군에 비하여 통계적으로 유의 한 차이를 나타내었다.(p < 0.05). 특히 0.5 mg/ml 농도에서 는 양성대조군인 0.05%의 chlorohexidine과 비슷한 효과를 관찰할 수 있었다. ɑ-Pinene이 S. mutans의 인공치아에 S. mutans biofilm 생성을 억제하는지 알아본 결과 ɑ-pinene을 처리하지 않은 대조군은 S. mutans biofilm이 많이 형성된 것을 볼 수 있으며, ɑ-pinene의 농도가 높아질수록 S. mutans biofilm 생성이 억제되었다. 특히 0.5 mg/ml 농도에 서는 S. mutans biofilm 생성 억제 효과가 더욱 뛰어남을 알 수 있었다(Fig. 3). 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 ɑ-pinene의 S. mutans biofilm 생성 억제 효과를 관찰한 결 과, Fig. 4와 같이 ɑ-pinene을 처리하지 않는 대조군은 S. mutans biofilm이 많이 형성된 것을 볼 수 있으며, ɑ-pinene 의 농도가 높아질수록 전자현미경상으로도 확실히 S. mutans biofilm 생성이 억제됨이 관찰되었다. 특히 0.25 mg/ml 이상 농도에서는 S. mutans biofilm 생성 억제 효과 가 더욱 뛰어남을 알 수 있으며, 특히 0.5 mg/ml 이상 농 도에서는 S. mutans biofilm이 거의 형성 되지 않음을 알 수 있다.
공초점 레이저 현미경(CLSM)을 이용한 살균 효능
CLSM을 이용하여 관찰한 결과(Fig. 5), ɑ-pinene을 첨가 한 농도가 높아질수록 살아있는 세균(green color; SYTO stain)에 비하여 죽어있는 세균(red color; PI stain)이 증가 하는 것이 관찰되어 ɑ-pinene이 살균효과가 있다는 것이 밝혀졌으며 4 mg/ml 농도이상에서는 거의 모든 세균이 살균되는 것으로 확인되었다.
고 찰
다양한 미생물이 서식하는 인체부위 중 하나인 구강 은 병원성 감염균주 및 상주균이 서식하여 구강질환 뿐 만 아니라 전신질환 발생의 원인이 되기도 한다. 치아우 식증 및 치주질환은 세균에 의해 유발되는 구강질환인 데, S. mutans는 치아우식증 및 치면세균막 형성과 관련 된 주요한 병원성 미생물로 알려져 있다 [27,28]. 우리나 라를 비롯한 세계 각국에서 세균 유래의 구강 질환 치 료를 위하여 많은 항균물질들을 사용하여 왔다. 그럼에 도 불구하고 치아우식증과 치주질환이 치아상실의 주요 한 원인이 되는 것은 아직 기존의 구강질환 억제 물질 이 충분한 효능을 갖고 있지 못하다는 증거이다. 또한 항균물질의 남용으로 인하여 미생물은 서서히 이들 약 물에 내성을 갖게 되었다. 항균물질이 요구하는 효과는 병원성 미생물의 성장을 막거나 예방하는 것이지만, 이 약물 또한 숙주에게 해로운 방식으로 영향을 미치게 되 는데, 이러한 부작용은 대부분의 항균물질에 공통적으로 나타나게 되었다. 이에 따라, 합성 항균물질을 대체할 수 있는 천연 항균 물질을 찾거나, 천연물에서 추출한 생물학적 활성 화합물의 다양한 연구가 수행되고 있다 [29]. 또한, 인체의 감염을 최소화하기 위한 연구들이 주 목 받고 있다. 식물의 정유성분과 그 유도체는 오래 전 부터 식품 향료, 음료 및 항균제로 사용되어 왔다 [30]. 따라서, 사람의 질병 및 치료를 위한 잠재적 항균제인 정유에 관한 연구가 중요한 과제가 되고 있다. 최근 연 구결과에 따르면 산국 정유는 S. mutans의 biofilm 형성 을 억제하며, 주요성분 중 하나로 ɑ-pinene이 함유되어 있는 것으로 밝혀졌다 [26]. 본 연구에서는 산국 정유의 주성분인 ɑ-pinene이 S. mutans의 성장과 산 생성 억제 효과, biofilm 형성 억제효과 및 인공치아에 대한 S. mutans biofilm 억제효과 및 살균 효과를 연구하여 치아 우식 활성억제에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
항균 효능을 측정하기 위하여 ɑ-pinene을 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml의 농도로 사용하여 S. mutans에 대한 성장 억제효과를 관찰한 결과 대조군에 비하여 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml 농도에서 각각 21.7%, 29.1%, 70.4%, 100% 의 성장억제 효과를 나타내었다. α-Pinene은 침엽수 와 많은 다른 식물의 정유에서 발견되는 monoterpene 화 합물로 [31], 선행연구에 따르면 pinene을 함유한 식물의 정유는 항균 효과를 가지고 있는 것으로 보고된 바 있다 [32,33]. α-Pinene의 생물학적 활성으로는 살균, 살충, 항산 화 및 진정 작용이 있는 것으로 알려져 있고, 다른 pinene 과의 상승 작용을 하는 기능이 있음이 밝혀졌다 [34]. 또 한 pinene을 함유한 허브의 정유에 대한 일부 연구에서는 항염증 효능이 밝혀지기도 하였다 [35,36].
본 실험에서 ɑ-pinene이 S. mutans의 유기산 생성을 억제 하는지 실험한 결과 ɑ-pinene을 넣지 않은 대조군에서는 세균배양전 pH가 7.37±0.01로 중성 pH를 유지하였으나, 세균배양 후 pH가 5.49±0.015까지 하락하였다. ɑ-Pinene 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml 농도에서 배양한 후 pH가 각 각 5.48±0.006, 5.59±0.05, 6.92±0.017, 7.37±0.006으로, 0.25 mg/ml 농도 이상에서는 pH 하락이 억제되었다. 치아우식 증을 유발하는 원인 중 하나인 S. mutans는 산생성능과 치 면 부착능력이 뛰어난 균으로, 치면세균막 내 S. mutans는 당을 대사하여 유기산을 형성함으로서 치아의 경조직을 파괴하는 것으로 보고된 바 있다. 본 연구에서는 ɑ-pinene 의 농도가 증가함에 따라 pH 하락이 억제되는 결과를 얻 었다. 이러한 실험결과로 ɑ-pinene이 S. mutans에 의한 유 기산 생성을 억제하여 치아우식증에 억제효과를 나타낼 수 있음을 추정할 수 있다.
ɑ-Pinene을 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml의 농도별로 처리하고, S. mutans biofilm 형성을 관찰한 결과, 대조군 에서는 S. mutans biofilm이 많이 형성된 것을 볼 수 있었 으나, ɑ-pinene의 농도가 높아질수록 S. mutans biofilm 형 성이 억제됨을 확인할 수 있었다. 특히 0.5 mg/ml 농도에 서는 0.05%의 chlorohexidine과 비슷한 효과를 나타냄을 관찰할 수 있었으며, 각 농도별 ɑ-pinene으로 S. mutans가 인공치 표면에 형성하는 biofilm 형성 억제능력을 측정해 본 결과, 대조군에 비하여 ɑ-pinene의 농도가 높아질수록 S. mutans biofilm 형성을 억제함을 관찰할 수 있었다. SEM을 이용하여 관찰한 결과도 비슷하였는데 0.1 mg/ml 이상의 농도에서는 biofilm형성이 현저하게 억제되었음을 볼 수 있었다. 구강내 biofilm의 한 종류인 치면세균막은 가장 자주 발생하는 구강 질환인 치아우식증 및 치주질환 의 일차적인 원인이 된다. 미생물에 의한 biofilm은 복잡한 세균 집단이며 인체와 환경에서 흔하게 나타난다 [37-39]. 본 연구에서 ɑ-pinene이 dental biofilm 형성에 미치는 영향 을 측정한 결과 ɑ-pinene이 S. mutans에 의한 치아의 biofilm 형성 억제에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다. 식물유래 정유는 각종 세균, 곰팡이, 바이러스 등의 감염 방지와 성장억제제로 사용되어 왔고 [40], 정유의 치면세 균막 억제 항균효과에 대한 연구가 다수 수행 되었다 [41,42]. 식물유래 정유가 치면세균막의 생성을 억제하는 기전은 세균의 세포벽을 파괴하여 효소 활성을 방해하고 세균의 군집을 막아서 치면세균막의 양을 감소 시키는 것 으로 보고된 바 있다 [43,44]. Listerine® (Johnson & Johnson, New Jersey, USA)은 정유를 주성분으로 하는 대 표적인 항균 구강세정액으로 상품화되어 판매되고 있고 [45], 오렌지 정유 또한 S. mutans의 성장을 저해하여 치아 우식증을 예방한다는 보고가 있다 [46].
CLSM을 이용하여 ɑ-pinene의 살균효능을 측정한 결과 ɑ-pinene을 첨가한 농도가 높아질수록 살아있는 세균 (green color; SYTO stain)에 비하여 죽어있는 세균(red color; PI stain)이 증가하는 것이 관찰되어 ɑ-pinene이 살균 효과가 있다는 것이 밝혀졌으며, 4 mg/ml농도 이상에서는 거의 모든 세균이 살균되는 것으로 확인되었다. PI는 적 색 형광염료로 손상된 세포막을 가진 세균에만 침투하여 DNA를 염색시키는 특징이 있어 죽은 세포만을 염색시키 는 것으로 알려져 있으며, SYTO는 녹색 형광염료로 살아 있는 모든 세포내 핵산에 결합하여 형광을 나타내는 것으 로 알려져 있다. 따라서 PI와 SYTO의 이중염색은 살아있 는 세포와 죽은 세포를 구분하여 세균의 살균효능을 측정 하는데 유용하게 사용되고 있다. 대조군에서는 주로 SYTO에 의해서만 염색이 일어나 녹색형광이 주로 관찰 되나 ɑ-pinene의 농도가 높아질수록 죽은 세균수가 증가 되면서 적색형광이 증가 하는 것을 관찰함으로서 살균효 능이 증가됨을 알 수 있었다 [47].
이상의 결과를 토대로 하여 볼 때, ɑ-pinene이 S. mutans 의 성장, 유기산의 생성, biofilm 형성을 억제하며, 살균효 능을 보여 ɑ-pinene이 비교적 높은 우식활성 억제 효능을 가지고 있는 것으로 판단되며 치아우식증에 대한 억제물 질로써 사용될 수 있는 가능성을 기대할 수 있을 것으로 보인다.
