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ISSN : 1226-7155(Print)
ISSN : 2287-6618(Online)
International Journal of Oral Biology Vol.42 No.2 pp.63-70
DOI : https://doi.org/10.11620/IJOB.2017.42.2.063

Development of a Novel Subunit Vaccine Targeting Fusobacterium nucleatum FomA Porin Based on in silico Analysis

Correspondence to: Kwangjoon Jeong, Department of Microbiology, Chonnam National University Medical School, 322 Seoyang-ro, Hwasun-eup, Hwasun-gun, Jeonnam, 58128, Republic of Korea +82-61-379-8461, +82-61-379-8455dr.photon@gmail.com
May 13, 2017 June 7, 2017 June 8, 2017

Abstract

Selecting an appropriate antigen with optimal immunogenicity and physicochemical properties is a pivotal factor to develop a protein based subunit vaccine. Despite rapid progress in modern molecular cloning and recombinant protein technology, there remains a huge challenge for purifying and using protein antigens rich in hydrophobic domains, such as membrane associated proteins. To overcome current limitations using hydrophobic proteins as vaccine antigens, we adopted in silico analyses which included bioinformatic prediction and sequence-based protein 3D structure modeling, to develop a novel periodontitis subunit vaccine against the outer membrane protein FomA of Fusobacterium nucleatum. To generate an optimal antigen candidate, we predicted hydrophilicity and B cell epitope parameter by querying to web-based databases, and designed a truncated FomA (tFomA) candidate with better solubility and preserved B cell epitopes. The truncated recombinant protein was engineered to expose epitopes on the surface through simulating amino acid sequence-based 3D folding in aqueous environment. The recombinant tFomA was further expressed and purified, and its immunological properties were evaluated. In the mice intranasal vaccination study, tFomA significantly induced antigen-specific IgG and sIgA responses in both systemic and oral-mucosal compartments, respectively. Our results testify that intelligent in silico designing of antigens provide amenable vaccine epitopes from hard-to-manufacture hydrophobic domain rich microbial antigens.


Kwangjoon Jeong1*, Puth Sao1,2, Mi-Jin Park1,2, Hansol Lee1, Shi Ho Kim1, Joon Haeng Rhee1,2, Shee Eun Lee2,3
1Department of Microbiology, Chonnam National University Medical School, 322 Seoyang-ro, Hwasun, Jeollanamdo, Republic of Korea
2Clinical Vaccine R&D Center, Chonnam National University Medical School, 322 Seoyang-ro, Hwasun, Jeollanamdo, Republic of Korea
3Department of Pharmacology and Dental therapeutics, School of Dentistry, Chonnam National University, 77 Yongbong-ro,
Gwangju, Republic of Korea

초록


    © The Korean Academy of Oral Biology. All rights reserved

    This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

    서 론

    백신은 에드워드 제너의 종두법 발견 이래 항생제와 더불어 인류가 보유한 가장 강력한 감염성 질환 제어 수 단으로 알려져 있다. 특히, 20세기 중반 이후로 개발된 다 양한 백신 및 이를 이용한 국가백신접종사업(National Immunization Program, NIP) 덕택에 인류는 적지 않은 감 염성 질환의 위협으로부터 벗어날 수 있었다[1]. 백신의 유효성 및 중요성에도 불구하고 인류는 여전히 수많은 감 염성 질환의 위협에 노출되어 있는데, 에볼라나 에이즈, 지카 바이러스와 같은 신종 감염성 질환[2-4] 및 기존에는 잘 통제되었다고 생각된 백일해 및 다제내성 결핵균 등의 재래 감염성 질환의 등장[5, 6]은 신개념 백신 개발을 강 력히 요구하고 있다. 그리고 사람 평균수명의 급격한 증 가로 인해 인구의 고령화 및 노령 인구에서의 낮은 백신 효과 등은 해당 인구에 최적화된 새로운 백신에 대한 수 요를 더욱 강력히 견인하고 있다[7, 8]. 대부분의 기존 백 신은 주로 치사율과 이환율이 높은 급성 감염성 질환을 대상으로 개발되고 접종 되었다. 그러나 의생명과학 연구 결과의 축적으로 인해 만성 감염성 질환의 발생이 다른 전신적 질환의 병인론에 중요한 역할을 하는 것으로 알려 짐에 따라[9, 10] 치주염을 비롯한 만성 감염성 질환의 효 과적인 제어를 위한 새로운 백신 개발은 더욱 절실하다.

    치주염(periodontitis)은 대표적인 만성 감염성 염증질환 으로 구강 점막부위에서 발생하며 성인의 치아소실 및 여 타 치주질환에 있어 중요한 질환으로 알려져 있다[11-13]. 치주염은 다른 감염성 질환과는 달리 여러 미생물군과 숙 주(사람) 염증반응의 상호작용으로 유발되는 질환으로 알 려져 있는데[11-13], 염증성 대장질환(inflammatory bowel disease, IBD)[14]과 더불어 미생물총(microbiota)의 변화가 병인론에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 [15-17]. 치주염의 발병 기전 연구를 통해 바이오 필름 기 반 치태 형성의 역할은 이미 알려져 있으며, 이 과정에서 Fusobacterium nucleatum의 기여도는 매우 높은 것으로 알 려져 있다[18, 19]. 즉, 치은 점막조직 상부에 형성되는 바 이오필름의 정착인자(early colonizer)들을 매개하는 중계 자로서 F. nucleatum이 작용하는 것으로 알려져 있는다 [20]. 이와 같은 치주염 병인론 연구결과를 바탕으로 F. nucleatum의 성장 억제를 통해 치은연하 치면 세균막의 형성을 견제하며, 그 결과로서 치주염 발생 가능성 역시 크게 낮출 수 있다는 예측을 할 수 있다[20-22]. F. nucleatum은 그람음성 혐기성 세균으로 배양이 까다로울 뿐 아니라 세균 자체의 낮은 면역원성 등으로 인해 높은 효과를 갖는 백신의 개발은 여전히 요원하다. 그러나 F. nucleatum에 대한 연구결과의 축적으로 인해 막 단백질인 FomA가 해당 세균에 대한 항체 형성을 유도할 수 있음이 알려져 있다. 이에 따라 재조합 FomA 단백질을 항원으로 이용하는 아단위 백신(subunit vaccine)의 개발에 관한 연 구가 활발하다. 그럼에도 불구하고 FomA 단백질 특유의 높은 소수성(hydrophobicity)과 낮은 면역원성 등으로 인해 재조합 FomA 단백질의 발현 및 정제는 아단위 백신 개발 의 가장 큰 걸림돌이 되고 있다[21].

    전술한 바와 같이, 치주염은 대표적인 구강 점막 감 염성 질환으로서 효과적인 방어 면역능 유도를 위해서 는 강력한 구강점막 부위의 면역반응의 유도가 필수적 이다[12, 21, 23]. 효과적인 점막 면역반응의 유도를 위 해서는 적절한 백신의 투여 경로 선택 뿐 아니라, 강력 한 점막면역증강제의 도입 역시 중요하다. 특히, 병원성 미생물 전체가 아닌 특정 항원 기반의 아단위 점막면역 백신에서는 항원의 포획 과정과 국소 림프절에서 강력 한 면역증강 효과를 보유한 효과적인 면역증강제 도입 은 필수적이다[24, 25]. 더욱이 치주염의 발생률과 연령 의 비례적 상관관계를 고려할 경우, 효과적인 치주염 예 방 점막면역 백신의 개발에는 노령인구에서도 충분한 정도로 면역을 유도할 수 있는 면역증강제의 적용 또한 중요하다. 본 연구진은 기존 연구를 통해 패혈증 비브리 오균 유래 플라젤린, FlaB의 강력한 점막면역 유도효능 을 보고한 바 있다[26-29]. 뿐만 아니라, FlaB 면역증강 제는 노화 마우스 모델에서 강력한 점막면역 유도능을 보이는 것으로 확인된 바[30] 위에서 언급한 치주염에 대한 효과적인 점막면역 아단위 백신용 면역증강제로서 는 최선의 선택지 중의 하나라 할 수 있다.

    이에 본 연구진은 기존에 시도되었던 FomA 단백질 전장 서열이 아닌 정제 효율과 면역원성이 높은 재조합 truncated FomA (tFomA) 단백질을 항원으로 하는 새로 운 치주염 아단위 백신을 개발하고자 하였다. 이를 위해 본 연구진은 생물정보학적 분석 기법 및 서열기반 3차 원 구조예측을 바탕으로 최적의 tFomA 서열을 확보하 였으며, 이를 이용해 재조합 항원을 정제하였다. 또한 FlaB 점막면역증강제 기반의 tFomA 아단위 백신을 마 우스 비강접종하여 FomA 단백질에 대한 항원 특이적 항체 형성능을 확인하였다.

    재료 및 방법

    균주 및 플라스미드

    본 연구에 사용된 균주 및 플라스미드 목록은 표 1에 정리하였다.

    유전체 DNA 획득 및 항혈청 획득에 사용한 F. nucleatum ATCC 10953 균주는 0.5% yeast extract (BD, Franklin Lakes, NJ, USA), 0.05% cysteine (Sigma Aldrich Co., St. Louis, MI, USA), 10 μg/ml of hemin (Sigma Aldrich Co., St. Louis, MI, USA)이 첨가된 tryptic soy broth (BD, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 37°C 혐기성 조건 (85% N2, 10% H2, 5% CO2)으로 정치배양 하였다 [31]. 플라스미드가 형질전환 된 대장균주는 100 μg/ml ampicillin이 포함된 Luria-Botani (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) 한천배지에서 유지하였다. Table. 1

    생물정보학 기반 절편 항원 예측 및 정제

    F. nucleatum FomA 아미노산 서열에 대한 친수성 예 측: tFomA 항원 부위를 선택하기 위하여 F. nucleatum ATCC 10953의 FomA 아미노산 서열을 Unitprot 데이터 베이스 (http://unitprot.org)로부터 획득하였다(accession ID: EMBL:EDK88768.1). 획득한 전장 FomA 아미노산 서열 에 대한 친수성 예측을 위하여 Swiss Bioinformatics Institute에서 운영하는 ExPasy 단백질 데이터베이스의 Protscale tool (http://web.expasy.org) Hydrophilicity scale derived from HPLC peptide retention times[32]를 적용하 였으며, cut-off 값은 2.1257을 적용하였다. 획득된 친수 성 예측치는 동 사이트에서 제공하는 JAVA 애플릿을 이용하여 시각화 하였다.

    F. nucleatum FomA 아미노산 서열에 대한 B 림프구 에피토프 예측: 면역원성이 보존된 tFomA 항원 부위를 선정하기 위하여 FomA 아미노산 서열을 미국 National Institute of Allergy and Infectious Disease에서 제공하는 Immune Epitope Database and Research tools (IEDB)의 B 림프구 에피토프 예측 도구를 이용하였다. 이중 가장 널 리 사용되는 Bepipred Linear B cell epitope prediction 도 구[33, 34] (http://tools/immuneepitope.org/bcell/)를 이용하 여 B 림프구 에피토프 가능성을 예측하였다. 예측 결과 는 동 사이트에서 제공하는 JAVA 애플릿을 이용하여 시각화 하였다.

    절편 FomA(tFomA) 후보서열을 이용한 단백질 3차원 구조 예측: 전장 FomA 에 대하여 친수성 및 B 림프구 에 피토프 예측 시각화를 서로 비교하여 겹치는 부분을 절편 후보로 선정하고 해당 아미노산 서열을 영국 Imperial College London의 Structural Bioinformatics Group의 Phyre2 [35] 구조예측시스템(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/servers/ phyre2/html/page.cgi?id=index)을 이용하여 단백질 구조파 일(protein database, pdb)을 생성하였다. 획득한 pdb 파일 의 시각화는 독일 Schrödinger 사(Mannheim, Germany)에 서 제공하는 오픈소스 EduPymol 1.6 소프트웨어를 이용 하여 시각화 하였다. 시각화 중, B 림프구 에피토프 점수 가 높게 예측된 부분은 마젠타색으로 나머지 부위는 초록 색으로 색을 입혀서 3차원 구조상 에피토프 부위의 표면 노출 여부를 검증하였다. Figure 1

    tFomA 재조합 항원의 발현균주 구축 및 정제

    tFomA 재조합 항원의 발현을 위해 PCR을 이용한 유전 자 클로닝을 통해 발현균주를 구축하였다. 클로닝을 위해 5’-말단 프라이머(5’-CATATGTGGTTATGCCTGCCCCCAC TCCG-3’) 및 3’-말단 프라이머(5’-GAATTCGGCATTCAC TTTGCCCGTGGC-3’) 쌍을 이용하였으며, PCR 주형 핵산 은 F. nucleatum ATCC 10953 유전체를 사용하였다[31]. PCR을 통해 획득한 증폭편의 정확성은 아가로스 젤 전기 영동과 DNA 염기서열분석을 통해 확인하였으며, 이를 New England Biolabs 사(Ipswich, MA, USA)의 pTYB12 플 라스미드에 클로닝 하였다. 클로닝된 pTYB12::tFomA 플 라스미드를 동사의 발현 대장균주 ER2566 균주에 Bio- Rad 사(Contra Costa, CA, USA)의 E. coli Pulser를 이용하 여 전기적 형질전환을 통해 도입하였으며, 형질전환의 성 공여부는 클로닝에 사용한 PCR 프라이머쌍을 이용한 PCR로 확인하였다. 구축된 발현 균주를 이용한 재조합 tFomA 항원의 발현 및 정제는 NEB 사의 IMPACT-CN 프 로토콜에 따라 시행하였다. 구축된 절편 FomA 발현 대장 균주는 100 μg/ml ampicillin이 포함된 LB broth에 37℃, 200 rpm으로 밤샘 진탕 배양 후, 새로운 100 μg/ml ampicillin이 포함 LB broth에 1:100 비율로 재접종 하여 37℃, 200 rpm 진탕 배양하였다. 배양액의 600 nm흡광도 가 0.8이 되었을 때, 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위 해 0.1 mM IPTG (Sigma Aldrich Co., St. Louis, MI, USA) 를 첨가한 후, 배양액을 20℃, 200 rpm 조건으로 24시간 동안 진탕 배양 하였다. 정제된 단백질의 확인을 위하여 10% SDS-PAGE를 이용하여 정제된 단백질의 분자량을 측정하였으며, 항 F. nucleatum 마우스 혈청을 이용한 Western blotting으로 재확인 하였다. 항 F. nucleatum 마우 스 혈청은 0.3% formalin으로 불활화 시킨 5 X 108CFU의 F. nucleatum ATCC 10953 균주를 각 마우스의 피하 경로 로 1주 간격 3회 면역하였다. 최종 면역 1주일 후, 면역한 마우스의 전혈을 채취한 후, 혈청을 분리하였다. Figure 2

    비강점막백신을 통한 항원 특이적 항체반응 유도 측정

    마우스 면역 방법 및 스케줄: 정제한 재조합 tFomA 항 원의 항원 특이적 항체유도능을 확인하기 위하여 2주 간 격으로 3회 비강점막면역을 시행하였다(Figure 3A). 이때 사용된 tFomA의 용량은 각 마우스당 1.1 μg이며, 항원-면 역증강제 혼합투여군에는 동량의 tFomA와 각 마우스당 4 μg의 FlaB를 투여하였다. 실험에 사용된 동물은 암컷 6주 령 BalB/C 마우스((주)오리엔트바이오, 경기도 성남, 대한 민국)를 사용하였으며, 각 투여군당 5마리의 마우스를 사 용하였다. 최종 면역 14일 후, 각각의 마우스로부터 침샘 분비액과 전혈을 채취하여 추후 면역분석에 사용하였다. 침샘 분비액은 500 μg/ml 농도의 Isoto Carpine® (Novartis, Bassel, Switzerland) 100 μl를 면역 마우스의 복강 내로 접 종하여 채취하였다. 모든 동물실험은 전남대학교 동물실 험윤리위원회의 가이드라인에 따라 시행하였다.

    tFomA 재조합 항원을 이용한 항원 특이적 항체 형성능 분석: 대조군과 tFomA 단독 면역군, FlaB 면역증강제와 tFomA 혼합 투여군 마우스로부터 각각 채취한 침샘 분비 액과 혈청을 이용하여 tFomA 특이적 항체 형성능을 ELISA법을 이용하여 비교하였다. 본 연구진의 기존 보고 논문에서 구축한 ELISA 실험법을 수정하여 사용하였는 데[29], ELISA용 1 μg/ml의 tFomA를 coating 항원으로 4°C 에서 24시간동안 정치하였다. ELISA용 plate를 세척한 후, 0.5% BSA (Sigma Aldrich Co., St. Louis, MI, USA)와 1 mM EDTA (Bioneer, 대전, 대한민국), 0.05% Tween 20 (Amresco LLC, Solon. OH, USA)이 포함된 blocking 버퍼 를 첨가하여 상온에서 1시간 정치하였다. 5회의 세척 후, 채취한 각 시료를 계단희석하여 ELISA plate에 추가하고 2시간 동안에서 상온 정치하였다. 사용된 2차 항원으로는 horseradish peroxidase가 접합된 항 마우스 IgG 및 IgA (Southern Biotech, Brimingham, AL, USA) 혈청을 이용하 여 1시간 동안 상온 반응 하였으며, 발색을 위하여 각각 30 μl씩의 TMB 기질 (3,3’5,5’-tetramethylbenzidine, BD, Franklin Lakes, NJ, USA)을 처리하였다. 발색반응은 동량 의 1 N H2SO4를 이용하여 정지시켰으며, SPECTRA MAX 190 흡광측정기 (Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

    통계 분석

    항체 형성능의 통계분석을 위해 미국 GraphPad 사(La Jolla, CA, USA)의 Prism 5.0c를 이용한 Student t-Test를 시행 하였으며, mean ± SEM 값으로 표시하였다. 통계적 유의성 판정에는 * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001을 적용하였다.

    결 과

    tFomA 재조합 항원의 선정

    F. nucleatum FomA 단백질로부터 재조합 단백질의 발 현 및 분리 정제가 용이하며 B 림프구 에피토프로 작용 할 수 있으며, 수용액상에서 해당 에피토프 부위가 표면 에 노출되는 절편 단백질 후보를 선정하기 위해, F. nucleatum ATCC 10953 균주에 대한 유전체 서열을 기반 으로 Parker hydrophilicity 계산을 바탕으로 전장 아미노산 서열에 대한 친수도(hydrophilicity)를 예측하였다(Fig. 1A). 또한 Bipipred linear epitope 예측을 기반으로 하여 FomA 단백질에 대한 B 림프구 에피토프 부위를 검증하였다 (Fig. 1B). 그리고 다른 두 예측값을 종합하여 서로 겹치 는 부위를 최적의 항원 후보로 선정하였다. B 림프구 에 피토프와 친수성이 높은 부위는 서로 일치하였으며 이는 FomA 단백질의 50~149번째 아미노산(FomA50~149)에 해당 하는 부위였다. 그리고 3차원 구조 예측에서 FomA50~149의 에피토프 부위는 대부분 단백질의 표면에 노출될 것으로 예측되었다(Fig. 1C 마젠타 색). 생물정보학 분석 및 3차 원 구조 예측 결과를 종합하여 본 연구진은 FomA50~149를 tFomA 기반의 아단위 백신의 후보항원으로 선정하였다.

    tFomA 재조합 항원의 발현 및 정제

    선정된 tFomA 재조합 항원의 발현을 위해 유전자 클로 닝 기법을 이용하여 해당 재조합 단백질 발현 대장균주를 구축하였으며, 이를 NEB사의 IMPACT-CN 시스템을 이용 하여 정제하였다(Fig. 2A). 발현 및 정제 중, 기존에 알려 진 FomA 재조합 단백질의 연구결과와 달리 tFomA는 높 은 친수도를 보였으며 정제 결과 14 kDa의 분자량을 갖 는 단백질로 확인할 수 있었다. 이는 본 연구진의 설정한 기준에 따른 절편부위 선정이 재조합 단백질의 정제의 편 이성 및 수율 향상에 높은 성과를 보임을 시사한다. 본 연구진은 정제한 tFomA 재조합 단백질의 확인을 위하여 F. nucleatum 균주의 접종을 통해 획득한 항혈청을 이용 하여 Western blotting 분석을 수행하였다(Fig. 2B). 분석 결과, tFomA가 F. nucleatum 균주 항혈청을 통해 검출됨 을 확인하였다. 이는 본 연구진이 제시한 절편 기반의 재 조합 단백질 항원(tFomA)이 F. nucleatum의 자연상태의 전장 FomA와 유사한 표면특성을 보일 뿐 아니라, 항원으 로서 적용 가능성이 있음을 시사한다.

    tFomA 재조합 항원 기반 점막면역 백신 투여에 따른 항체형성능 측정

    정제한 tFomA의 치주염 관련 세균인 F. nucleatum 에 대한 아단위 백신으로 사용 가능성 여부를 타진하기 위하 여 Fig. 3A의 면역스케줄을 적용하여 마우스 비강 점막 면역을 수행하였다. 또한 본 연구진은 다른 아단위 백신 항원과 비교하여 tFomA의 낮은 면역원성의 극복과 효율 적인 점막면역 유도 및 향후 예상 접종대상자인 노령인구 에 대한 높은 면역유도능을 꾀하기 위하여 패혈증 비브리 오균의 편모구성인자이자 Toll-like receptor 5 리간드인 FlaB를 점막 면역증강제로 사용하여 항원 단독 및 항원- 면역증강제 혼합물의 면역유도능을 함께 비교하였다. 세 차례 비강면역 후 획득한 마우스의 혈청 및 침샘 분비액 을 이용하여 전신적인 항원 특이적 IgG 반응과 구강 점막 의 항원 특이적 분비성 IgA 반응을 ELISA 법을 이용하여 분석하였다. 실험 결과, tFomA 항원 단독으로 면역한 경 우 대조군(PBS 처리군) 대비 유의한 항원 특이적 혈청 IgG 및 국소 점막 IgA 생성능을 확인할 수 있었다(Figure 3B3C). 흥미롭게도 FlaB와 tFomA 혼합 백신 투여군 에서는 PBS 대조군 뿐 아니라 항원 단독 투여군에 비하 여서도 통계적으로 유의하게 높은 전신 및 구강 점막에서 의 항원 특이적 면역반응을 유도함을 확인할 수 있었다 (Fig. 3B3C). 이는 본 연구진이 보고한 바 있는 FlaB 점막면역증강제의 높은 점막면역 유도능과 일치하는 결 과로서, 점막면역의 효과적인 유도에 FlaB 점막면역증강 제의 효능을 입증하는 결과로 사료된다. 위의 실험 결과 는 일련의 tFomA 기반 점막백신 연구 결과는 본 연구진 이 제시한 절편 기반 아단위 백신이 높은 항체 형성능을 보유하고 있음을 강력히 시사한다.

    고 찰

    본 연구진은 F. nucleatum FomA 단백질의 높은 소수 성으로 인한 정제의 어려움과 낮은 면역원성을 극복하 기 위하여 단백질 서열에 대한 생물정보학적 분석 기법 을 도입하여 절편 재조합 단백질을 설계하였다. 설계한 절편 단백질의 검증을 위하여 단백질 3차원 구조예측을 적용하여 에피토프 부위의 표면노출 여부를 가늠하였다. 그리고 설계한 재조합 tFomA 단백질의 발현 및 정제를 통해 항원을 확보하였고, 이를 이용하여 항원 특이적 전 신 및 국소 점막의 항체 유도능을 확인하였다.

    치주염은 다양한 미생물이 관여하는 만성 감염성 염증 질환이다[11-13, 23, 36-38]. 치주염의 발생은 심근경색을 비롯한 심혈관계 질환 및 당뇨와 같은 대사성 질환, 알츠 하이머병을 위시로 한 신경퇴행성 질환의 발병에서 중요 한 방아쇠 역할을 하는 것으로 알려져 있다[17, 39-42]. 치 주염의 발생 단계에서 바이오 필름의 형성이 중요한 역할 을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 바이오 필름 형성 방 해에서 F. nucleatum에 대한 방어 면역능의 유도가 중요 한 것으로 알려져 있다. 이에 따라 F. nucleatum에 대한 다양한 백신이 연구되었고, 주요 항원이라 할 수 있는 FomA 단백질을 항원으로 이용하는 아단위 백신의 개발 역시 활발히 진행 중이다. 그러나 전자의 경우, F. nucleatum 균이 절대 혐기성균인 까닭에 사백신으로 항원 으로 이용할 수 있는 충분한 양의 균체 확보는 매우 어렵 다. 후자 역시 FomA 단백질 자체가 높은 소수성을 보이 는 까닭에 발현시킨 재조합 단백질의 대부분이 대장균의 봉입체(inclusion body) 분획으로 포장되어 아단위 백신의 개발 역시 매우 까다롭다 [21]. 이에 본 연구진은 면역원 성과 정제 수율을 동시에 확보할 수 있는 절편 재조합 단 백질 설계 전략을 수립하여 현재의 한계를 극복 하고자 하였다. 합당한 절편 재조합 단백질의 설계를 위해서는 본 연구진이 제안하는 생물정보학적 분석 및 구조예측 복 합 전략 뿐 아니라, FomA 단백질 유래의 다양한 펩티드 혼합물을 기반으로 하는 high-throughput 스크리닝, 다른 친수성 단백질과의 재조합 융합단백질의 제조 등 다양한 방안이 있을 것이다. 본 연구에서는 현재 빠른 속도로 연 구 결과가 축적 중인 생물정보학적 분석 및 서열기반 구 조예측 복합 전략을 도입함으로써 실패의 위험도는 낮추 고 비용-편익은 극대화 하는 전략을 선택하였다. 본 전략 은 아단위 백신의 항원의 정제 뿐 아니라 다른 높은 소수 성을 지닌 재조합 단백질의 제조에도 적용이 가능하다고 사료된다.

    본 연구 도중, 생물정보학적 분석법을 이용한 tFomA 항원의 설계 시 기술한 내용 이외에 다양한 시도를 하 였다. 그중 친수성 예측과 B 림프구 에피토프 예측에서 각 아미노산 서열마다 가중치를 주어 가중치의 총합이 가장 높은 3개의 절편 항원 후보를 선별하였다. 그런데 이 경우, 3차원 구조예측 결과에서 에피토프 부위가 표 면에 노출 되지 않고, 3차원 구조의 내부에 위치하였다. 이는 소수성이 높거나 에피토프가 아닐 것으로 예측된 특정 아미노산 서열이 단백질의 3차 구조 형성에서 역 할을 하는 것으로 사료된다. 또한, 절편 단백질 설계 시 에 이들 소수성 또는 에피토프로 예측되지 않은 고유한 서열을 보존한 본 연구의 접근 전략에 대한 논거라 할 수 있다. 특히, 본 연구에서 사용한 F. nucleatum FomA 의 경우 다른 막 단백질과의 서열의 유사도가 높기 때 문에 서열기반의 3차원 구조예측에 있어서는 매우 적절 한 모형이라 할 수 있다.

    본 연구에서 사용된 FlaB 면역증강제의 경우 기존 연 구에서 탁월한 점막면역 유도능을 보일 뿐 아니라, 노화 동물모델에서 뛰어난 면역유도 효과를 보인 바가 있다 [30]. F. nucleatum 및 여타 미생물총의 복합 감염에 의한 치주염의 경우, 주로 노인 인구에서 높은 이환률 및 위험 도를 보이는 바 본 연구진은 FlaB 면역증강제와 재조합 tFomA 항원의 혼합물을 이용한 항체 유도능까지 검증하 였다. FlaB 면역증강제의 동시 투여는 통계적으로 유의하 게 전신 및 국소 점막에서 항원 특이적 IgG와 IgA의 형성 을 유도하는 것으로 나타났다. 또한 본 연구를 통해 기존 의 방법으로 발현 및 정제하기 어려운 단백질을 표적으로 한 절편 항원 제작 및 그 이용에 대해 새로운 방안을 제 시하였다. 본 연구를 기반으로 다양한 치주염 유발 미생 물의 표적항원에 대한 다가백신(polyvalent vaccine)을 개 발할 경우 치주질환 및 관련된 만성 전신성 질환의 예방 에 있어 큰 기여를 할 수 있을 것으로 사료된다.

    Conflict of interest

    No potential conflicts of interest were disclosed.

    Figure

    IJOB-42-63_F1.gif

    Target selection for recombinant truncated FomA antigen. (A) AA 50~150 of FomA was calculated as most hydrophilic region among whole FomA sequence by hydrophilicity prediction using a Parker’s method. (B) AA42~150 of FomA was predicted as most epitope-rich region by Bepipred linear epitope prediction. (C) The tFomA showed surface exposed epitope-rich region after protein 3D structure prediction by using a Phyre2 protein folding system. The epitope-rich regions (magenta) and the others (green) were visualized, respectively.

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    Characterization of purified recombinant truncated FomA (tFomA). Purified recombinant tFomA was characterized by (A) SDS-PAGE and (B) Wetstern blot analysis with an anti-F. nucleatum sera.

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    Comparison of antigen-specific antibody production by immunization of tFomA based subunit vaccine. (A) Scheme of mice vaccination study. Female 8 weeks BALB/c mice (n = 5) were intranasally given PBS, 1.1 μg of tFomA alone, or tFomA combination with 4 μg of FlaB three times in 2 week interval. Fourteen days after the last immunization, blood samples (saliva) were collected and tFomA-specific serum IgG titers (B) and tFomA-specific saliva IgA titers (C) were measured by ELISA. Values represent the mean endpoint (log2) antibody titer. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001.

    Table

    Bacterial strain, plasmids and nucleotides
    aAp<r, ampicillin resistance.

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