서 론

치수는 치아 속에 있는 신경, 혈관, 림프관, 결합조직 및 여러 종류의 세포들 (fibroblast, mesenchyma cells, odontoblast, immune cells)과 세포외기질 등이 복합적으 로 어우러져 있는 성긴 결합조직이다[1]. 치수의 기능으 로는 치아의 형성 및 유지, 손상된 치아의 수복, 치아에 가해지는 여러 자극에 대한 적절한 감각 인지, 치아의 성장과 유지를 위한 영양 공급 담당, 각종 항균성 물질 및 면역세포들의 운반을 담당하여 외부 침입균에 대한 방어 기능 뿐만 아니라 경조직 손상 시 상처 치유와 항 염증 기능 등이 있으며 건강한 치아를 위한 다양한 역 할을 수행하는 것으로 알려져 있다[2].

치아의 건강상태는 치수나 치주조직의 염증에 의해 악화되기도 하며 치아의 노화로 인해 자연스레 퇴화되 기도 한다[3-6]. 치아의 노화는 치수의 노화와 상당한 관 련성[3]이 있으므로 건강한 치아를 유지하고 관리하기 위해서 치수의 노화 기전을 규명하고 노화 과정을 조절 할 수 있는 항노화 물질에 대한 연구의 필요성이 높아 지고 있다. 치수세포의 노화는 나이가 들어감에 따라 자 연적으로 발생할 수 있으며 치수염과 같은 질환에 의해 촉발될 수도 있다[3-6]. 두 경우 모두에서 공통적인 사항 은 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 발생 및 축적에 의한 산화스트레스 유발이 노화의 주요 원인으 로 작용할 수 있다는 점이다[4-7].

H₂O₂ (hydrogen peroxide)는 세포 내 ROS를 증가시켜 산화 스트레스를 유발하고 DNA 손상을 일으킨다. 이러한 DNA 손상이 제대로 복구되지 않으면 세포는 조기 노화를 일으킨 다[7-10]. 연구에 따르면 세포 내 H₂O₂의 장기간 축적이나 준치사 용량의 H₂O₂에 의해 여러 종류의 세포에서 조기 노 화가 발생한다고 보고되었다[11-16]. 이러한 특징으로 인해 H₂O₂는 세포 노화의 기전 및 항노화 물질의 발굴 연구에 노화유발 물질로써 널리 이용되고 있다.

멜라토닌 (N-acetyl-5-methoxytryptamine, melatonin)은 송 과선으로부터 주로 분비되는 호르몬으로 수면과 각성을 조절하며 항염증 및 항산화 작용을 한다[17]. 본 연구진은 이전 연구에서 멜라토닌에 의해 iNOS-NO 생성이 감소되 고 이로 인해 대식세포에 의한 염증반응이 억제됨을 보고 한 바 있다[18]. 멜라토닌은 과도한 자유 라디칼을 제거하 고 세포 내 항산화 효소의 합성을 증가시킴으로써 항산화 작용을 한다[17,19]. 최근 연구결과에 따르면 멜라토닌은 H₂O₂와 같은 산화 스트레스가 가해진 여러 세포 (예를 들 면, 치주섬유모세포, 중간엽줄기세포, 신경세포, 그리고 심장전구세포 등)에서 유도되는 조기 노화를 억제하며 노 화모델 생쥐를 대상으로 한 연구에서도 항노화 작용을 나 타낸다는 사실이 확인되었다[11-16, 20-23]. 이러한 결과 들은 노화 연구에 있어서 멜라토닌이 유용한 항노화 물질 로 사용될 수 있음을 보여준다.

본 연구에서는 사람의 치수세포 (human dental pulp cells, HDPCs)를 연구대상으로 하여 HDPCs의 노화를 억 제할 수 있는 항노화 물질로서 멜라토닌의 기능에 관해 알아보고자 한다.

실험재료 및 방법

실험재료

본 실험에서 사용된 멜라토닌은 Sigma (St. Louis, USA) 에서 구입하였고 30% H₂O₂는 JUNSEI (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다. p21, p53, 그리고 p65 에 대한 항체 각각은 Santa Cruz (Dallas, USA)에서 구입하였고 p-IκB, Iκ B, p–JNK와 p-ERK의 항체는 모두 Cell Signaling (Danvers, USA)에서 구입하여 사용하였다. α-tubulin은 BioGenex (Fremont, USA)에서 구입하였으며 JNK의 선택적 억제제 인 SP600125는 Enzo Life Sciences (Farmingdale, USA)에서 구입하여 사용하였다.

세포배양

HDPCs는 일본 히로시마 대학의 Takashi Takata 박사 연구 실에서 분양 받았다. HDPCs는 10% FBS (Fetal Bovine Serum)와 penicillin G (10 units/ml) 그리고 streptomycin (10 mg/ml)이 혼합된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였으며, 3-5 일마다 계대 배양하면서 유지 하였다.

MTT assay

세포배양용 48-well plate에 HDPC를 1x10⁴ cells/ml로 분주 하고 16시간 동안 배양시킨 후 H₂O₂ 또는 멜라토닌을 조건 에 맞게 농도별로 처리하였다. 24시간 배양한 뒤, 0.5 mg/ml 의 농도로 3-(4,5 - dime thylthiazol – 2 – yl) - 2,5 – diphenyltetra - zolium bromide (MTT)를 처리하고 4시간 동안 CO₂ 배양기에서 반응시켰다. MTT 시약이 들어있는 상층액 배지를 제거하고 각 well에 DMSO를 200 μl씩 넣어 반응과 정에서 생성된 세포 내 formazan을 녹인 후, 96well plate에 100 μl씩 옮겨 ELISA reader (TECAN, Männedorf, Switzerland) 로 흡광도를 측정하였다.

Western blot analysis

배양 중이던 HDPCs에 lysis buffer (40 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, 120 mM NaCl, and 0.1% NP-40 with a protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 처리한 뒤 단백질을 분리하였고, 단백질 추출액 (30 μg/lane)은 SDS/PAGE에서 전기영동 한 후 nitrocellulose membrane (Amersham Pharmacia Biotech, Little Char Font, UK)에 transfer하였다. 그리고 5% skim milk를 사용하여 blocking 을 진행하였고 0.1% tween-20이 들어있는 PBS 용액에 1차 항체와 HRP 결합을 가진 2차 항체를 순차적으로 처리하여 적당한 시간동안 반응시켰다. ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Little Char Font, UK) 시스템을 이용하여 발색시 키고 암실에서 X-ray 필름에 감광시켜 특정 단백질 양을 분석하였다.

Senescence-associated beta-galactosidase (SA-β -gal) staining assay

노화된 세포를 확인하기 위해 SA-β-gal staining을 실시하 였다. HDPCs를 배양한 뒤 PBS로 2회 세척하고 fixation buffer (2% formaldehyde/0.2% glutaraldehyde)로 세포를 고정 시켰다. 고정이 끝나면 PBS로 3번 세척한 뒤 β-gal staining solution (1 mg/mL X-Gal, 40 mM citric acid-sodium phosphate buffer, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM potassium ferrocyanide, and 5 mM potassium ferricyanide; pH 6.0; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)을 첨가하여 37℃에서 12시간 동안 반응시켰다. β-gal 활성이 나타나는 노화된 세포(blue, positive)와 활성이 나타나지 않는 세포(negative)는 현미경을 통해 확인하고 사진 촬영 후 세포를 계수하였다.

통계처리

본 실험에 대한 실험결과는 세 번의 독립적인 실험에 서 얻어진 평균치 및 표준편차를 나타내었고 그룹간의 통계적 차이는 Student's t-test를 이용하여 분석하였다.

결 과

H₂O₂가 HDPCs의 조기 노화에 미치는 영향

H₂O₂는 세포의 조기노화를 일으키는 노화유발 물질로 알 려져 있다 [11,12,24]. H₂O₂가 치수 세포의 조기 노화에 어떠 한 영향을 미치는지를 관찰하기 위하여 H₂O₂를 농도별로 24시간 처리한 뒤 HDPCs 생존정도를 MTT assay로 확인하 였다. 그 결과, 그림 1A에서 보는 바와 같이 HDPCs의 생 존에는 영향을 미치지 않는 H₂O₂의 농도가 400 nM임을 확인하였고 이후의 실험에 400 nM 농도를 사용하였다. HDPCs에 H₂O₂를 처리하였을 때 조기 노화가 일어나는지 를 알아보기 위하여 SA-β-galactosidase 염색을 실시하였 다. 그 결과 400 nM H₂O₂를 24시간 처리하였을 때, 노화 마커인 SA-β-galactosidase의 세포 내 염색 정도와 SA-β -galactosidase (+) 세포 수가 대조군에 비해 크게 증가함을 확인하였다 (그림 1B와 1C).

H₂O₂-유도성 HDPCs 조기 노화에서 노화관련 단백질 p21과 p53의 발현 패턴

세포의 노화가 진행될 때 노화관련 단백질의 발현 변화 가 동반되며 특히 p21과 p53은 대표적인 노화 마커로 알려 져 있다[4,11,25]. 본 연구에서는 H₂O₂에 의한 HDPCs의 노 화과정 동안 p21과 p53 단백질의 발현변화를 조사하기 위 하여 Western blot analysis를 실시하였다. HDPCs에 200 nM 과 400 nM H₂O₂를 처리한 경우, p21 단백질의 발현은 대 조군에 비해 각각 7배, 17배 정도 증가하는 농도-의존적 발현증가 패턴을 나타내었다 (그림 2A와 2B). p53 단백질 의 경우, 400 nM H₂O₂를 처리한 HDPCs에서 그 발현이 대 조군에 비해 2배 정도 증가하였다 (그림 2A와 2C). 또한 HDPCs에 400 nM H₂O₂를 시간 별로 처리한 후 단백질들의 발현 변화를 확인한 결과, 24시간 처리된 세포에서 p21과 p53 단백질의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다 (그림 2D, 2E와 2F).

H₂O₂-유도성 HDPCs 조기 노화에 대한 멜라토닌의 작용

멜라토닌은 세포 노화에 대해 억제작용을 하는 것으로 알려져 있다[21-23]. 본 실험에서는 멜라토닌이 HDPCs에 서도 항노화 작용을 나타내는지를 조사하였다. 먼저 MTT assay를 실시하여 HDPCs 생존율에 대한 여러 농도에서의 멜라토닌 효과를 조사하였다. 그림 3A에서 보는 바와 같 이, 1 mM 멜라토닌 농도까지는 HDPCs의 생존율에 큰 영 향을 미치지 않았으나 5 mM과 10 mM에서는 세포의 생 존율이 50% 이하로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따 라서 이후의 실험에서는 HDPCs의 생존율에 영향을 미치 지 않는 멜라토닌 농도인 1 mM을 사용하였다. 멜라토닌 의 항노화 효과를 조사하기 위하여 H₂O₂ 처리 전에 멜라 토닌을 처리하였고 이후 SA-β-galactosidase 염색을 실시 하였다. 그 결과, 멜라토닌은 H₂O₂에 의한 HDPCs의 조기 노화를 억제하는 작용을 나타내었다 (그림 3B와 3C). 또 한 멜라토닌 전처리로 인해 H₂O₂에 의한 p21 단백질 발현 의 증가가 저해되는 것을 확인할 수 있었다 (그림 3D와 3E). 하지만 p53의 경우는 멜라토닌 처리에 의한 변동이 나타나질 않았다 (그림 3D).

멜라토닌의 항노화 작용에서 JNK의 관련성

H₂O₂에 의한 세포의 노화 유도과정에 관여하는 대표적 신호전달계로는 NF-kB, ERK, 그리고 JNK 가 있다[26]. H₂O₂-유도성 HDPCs의 조기 노화에 대한 멜라토닌의 항 노화 작용 기전을 규명하기 위하여 세포 내 신호전달계 단백질의 활성을 조사하였다. 그림 4A에서 보는 바와 같 이, H₂O₂ 처리 시 활성화 상태인 인산화 형태의 c-Jun N-terminal kinase (p-JNK) 발현양이 대조군에 비해 증가하 였고 이러한 증가는 멜라토닌의 전처리에 의해 억제되는 것을 확인하였다. 또한 멜라토닌 단독 처리의 경우에도, 대조군에 비해 p-JNK의 양이 감소되었다 (그림 4A와 4B). NF-κB 신호전달 단백질들의 경우엔 실험군들 사이에 유 의성 있는 차이가 없었고 ERK는 대조군에 비해 멜라토닌 단독처리한 세포에서 그 활성이 크게 증가하였으나 멜라 토닌 전처리 후 H₂O₂을 처리한 HDPCs에서는 오히려 ERK 활성이 감소하는 것으로 나타났다 (그림 4A). 이러 한 결과들로 미루어 보아 H₂O₂에 의한 HDPCs의 조기 노 화과정 동안 JNK의 활성이 증가되며 멜라토닌은 JNK 활 성 증가를 방해함으로써 H₂O₂-유도성 조기 노화를 억제할 수 있는 것으로 추정된다. 이러한 가설을 검증하기 위하 여, JNK의 선택적 저해제인 SP600125가 H₂O₂-유도성 HDPCs 조기 노화에 어떠한 영향을 미치는지를 SA-β -galactosidase 염색을 통해 조사하였다. 그 결과, H₂O₂ 처 리 시 유도되었던 HDPCs의 조기 노화는 SP600125의 전 처리에 의해 억제됨을 확인하였다 (그림 4C와 4D).

고 찰

본 연구를 통해 멜라토닌은 H₂O₂로 유도된 HDPCs의 조기노화를 감소시킬 수 있음을 최초로 밝혔다. 항산화 기능을 가진 멜라토닌의 노화방지 효과 및 기전에 관한 연구결과는 여러 종류의 세포나 동물을 대상으로 한 실험 에서 보고된 바 있다. 예를 들면, 멜라토닌에 의해 중간엽 줄기세포, 신경세포, 심장전구세포, 상피세포의 H₂O₂-유도 성 노화가 억제되었으며 이는 멜라토닌 처리된 세포 내에 서 H₂O₂에 의한 ROS 생성의 감소, p21 또는/그리고 p53 등 세포주기 억제 단백질의 증가, NF-κB, ERK, 또는/그리 고 JNK 신호전달계의 조절 때문인 것으로 알려졌다 [4,13-15,21,25,26]. 본 연구결과를 상기의 연구결과들과 비 교해 보면, HDPCs에 H₂O₂를 처리할 경우 p53 발현은 증 가하였으나 p21보다 그 정도가 낮았고 멜라토닌에 의한 감소 효과도 p21의 급격한 감소에 비해 p53의 변화는 미 비하였으며 멜라토닌에 의한 조절이 뚜렷하게 나타나는 신호전달계는 JNK라는 사실을 확인할 수 있었다. 이러한 사실로 미루어 볼 때 HDPCs에서 멜라토닌은 p21 단백질 과 JNK 신호전달을 억제함으로써 H₂O₂에 의한 조기 노화 로부터 HDPCs를 성공적으로 보호하는 효과가 있는 것으 로 생각된다.

치수는 치아의 내부에 있는 치수강과 치근관이라는 제 한적이고 한정된 공간을 채우고 있는 결합조직으로 혈관 과 신경이 풍부하게 분포하고 있어 조그마한 공간에 존재 하지만 거의 완벽한 조직구성을 하고 있는 특징으로 인해 치아분화 연구뿐만 아니라 혈관연구, 신경연구, 결합조직 연구 및 조직재생연구 분야 등에서도 좋은 연구대상이 될 수 있다[2]. 최근에는 치수 (유치 치수, 사랑니 치수, 영구 치 치수)로부터 치아줄기세포 (dental pulp stem cells)를 분 리할 수 있게 되어 향후 치과 분야 (치조골, 치아재생 등) 와 여러 임상분야 (뇌신경 관련 분야, 자가면역 관련 분 야, 당뇨병 등)에 치아줄기세포를 세포치료제로 적용할 수 있는 가능성이 보고되면서 온전한 치수 상태 유지를 위한 연구의 필요성이 매우 높아지고 있다[27-29]. 따라서 본 연구를 통해 밝혀진 멜라토닌의 HDPCs에 대한 항노 화 기능은 온전한 치수 상태를 유지하는데 응용될 수 있 을 것이며 이를 위한 후속연구로 멜라토닌을 섭취한 그룹 과 대조군 간의 치수상태에 대한 전임상 및 임상 연구가 진행되어야 한다고 생각한다.

백세 시대라 불리는 현대사회에서 노인 인구수가 증가 함에 따라 치주건강 및 치주연구에 대한 관심이 집중되었 던 반면 치수의 경우는 관심 정도가 상대적으로 덜한 편 이었다[30,31]. 하지만, 치수조직 내 줄기세포의 존재가 밝혀지고 치수줄기세포를 분리하여 분화연구에 사용하려 는 시도가 증가하면서 치수 조직은 새롭고 유용한 연구 분야로 부각되고 있다. 최근 치수 조직의 노화 정도가 치 수줄기세포 분화 능력에 영향을 미치는 주요 인자가 된다 는 보고로 인해 치수 조직의 항노화 연구에 대한 중요도 가 높아지고 있다[32]. 또한 치매모델 생쥐에 치수줄기세 포 배양액을 처리하면 치매 생쥐의 인지능력이 향상되는 것으로 보아 치수는 치아를 형성·보호·유지하는 고유 기 능뿐만 아니라 뇌기능에도 상당한 영향을 미치는 것으로 생각된다[33]. 따라서 HDPCs의 노화에 대한 기전을 밝히 고 노화로부터 HDPCs를 건강하게 유지시킬 수 있는 노 화억제 즉 항노화 물질을 발굴해 내는 연구는 건강하고 온전한 치수줄기세포를 유지하는데 중요한 역할을 할 것 이다. 따라서 본 연구결과를 기반으로 하여 치수줄기세포 에 대한 멜라토닌의 항노화 작용에 관한 연구와 멜라토닌 과 같은 HDPCs 노화억제 효과를 가진 새로운 약물의 추 가적인 발굴에 관한 연구가 추가적으로 이루어지기를 기 대하는 바이다.