서 론

재발성 아프타성 구내염(Recurrent aphthous stomatitis; RAS)은 흔히 발생하는 구강 점막 질환으로 심한 통증과 발적, 궤양을 수반한다[1]. 재발성 아프타성 구내염은 전세 계에서 발병하며 유병률은 연구집단에 따라 21% - 28%에 이른다[2-4]. 발병에 기여하는 위험인자로 유전적 요인, 미 생물 감염, 전신질환, 영양상태 불균형, 기계적 자극, 스트 레스 등 다양한 인자가 거론되고 있으나 발병원인은 명확 하게 밝혀지지 않았다[5-6]. 전신질환 없이 단독으로 발병 하는 경우가 많으나, 베체트 증후군, 후천성 면역 결핍 증 후군, 염증성 장 질환 등 면역결핍 혹은 자가면역질환의 특징적인 증상으로 수반될 수도 있다[1]. 현재 사용되는 대표적인 치료법은 국소적 스테로이드제를 이용한 염증조 절과 국소도포 마취제나 진통제를 이용한 통증조절 등이 다[7]. 이들은 모두 대증치료법으로 근원치료가 되지 않기 때문에 다시 재발하게 된다.

재발성 아프타성 구내염의 병인에서 미생물이 미치는 영향에 대한 많은 연구들이 이루어졌다. 구강 내 존재하는 streptococci 등 세균뿐만 아니라 바이러스도 구내염의 발 병에 관련 있다고 의심되었지만 명확한 연관성은 밝혀지 지 않았다[2, 6, 8]. 우리는 선행연구에서 재발성 아프타성 구내염의 발병과 관련된 세균 종을 보고하였다[9]. 대조군 과 재발성 아프타성 구내염 환자군의 구강점막과 타액 세 균총을 16S 라이보솜 RNA유전자의 pyrosequencing을 통해 동정했으며, 그 결과 구강점막 세균총에서 Acinetobactor johnsonii의 증가와 Streptococcus salivarius의 감소가 재발 성 아프타성 구내염의 발병위험과 유의한 연관이 있음을 확인하였다. A. johnsonii가 배양접시에서 구강상피세포의 증식을 억제하고 세포독성을 보였기 때문에[9], A. johnsonii 를 유해균으로 정의하였고, 타액과 구강점막에 존재하는 대표적인 상주균인 S. salivarius는 유익균으로 정의하였다.

본 연구의 목적은 항생제 민감성 검색을 통해 재발성 아프타성 구내염 위험과 연관된 유해균인 A. johnsonii의 성장은 억제하면서 유익균인 S. salivarius와 구강 상주균의 성장에는 최소 영향을 주는 항생제와 그 농도를 찾고자 하 였다.

재료 및 방법

세균 배양

S. salivarius KCTC 5512, S. salivarius KCTC 3960, A. johnsonii KCTC 12405과 Rothia mucilaginosa KCTC 19862는 한국생명공학연구원 미생물자원센터 (KCTC/BRC, Daejeon, Korea)에서 구입하였다. Veillonella dispar KCOM 1864는 한국구강미생물자원은행 (KCOM, Gwangju, Korea)에서 구 입하였다.

S. salivarius는 10 μg/ml의 비타민K (Sigma, St. Louis, MO, USA)와 5 μg/ml의 hemin (Sigma, USA)을 보충한 BHI (BD, Flanklin Lakes, NJ, USA) 액체배지에, A. johnsonii와 R. mucilaginosa는 BHI 액체배지에 배양하였다. V. dispar는 Veillonella 액체배지 (0.5% Trypticase peptone, 0.3% Yeast extract, 80 mM Sodium lactate, Sodium 6.57 mM thioglycollate, 0.1% Tween 80, 5.56 mM Glucose, pH7.5)에 배양하였다. S. salivarius와 V. dispar는 37℃의 혐기조건 (CO₂ 10%, H₂ 10%, N₂ 80%)에서 배양했으며, A. johnsonii와 R. mucilaginosa는 각기 30℃와 37℃ 호기조건에서 배양하였다.

최소억제농도 (minimal inhibitory concentration, MIC) 측정

여러 종류의 항생제 중에서 치과 임상에서 자주 사용되 는 항생제를 선별하였다[10-12]. Gentamicin은 대부분의 구 강 상주균이 그램양성인데 반해, A. johnsonii가 그램 음성 균이며 구강점막에 외용으로 적용할 수 있기 때문에 선택 하였다.

Metronidazole (TCI, Tokyo, Japan)은 1 M dimethyl sulfoxide (Sigma, USA) 용액에 용해했으며, cefotaxime (Calibochem, La Jolla, CA, USA)과 clindamycin (TCI, Japan)은 증류수, amoxicillin (Sigma, USA)은 1 M ammonium water (Sigma, USA)에 용해하여 0.2 μm 크기의 필터에 거른 후 사용하였다. Gentamicin (Gibco, Grand Island, NY, USA)은 액체형태로 나온 것을 구매하였다.

항생제에 대한 민감도 검색을 위해, 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 μg/ml 농도의 항생제를 포함하는 액체배지에 세균을 5x10⁶ CFU/ml로 부유시켜, 96 well plate에 100 μl씩 분주하고 각 세균 별 배양 조건에서 24시간 동안 배양하였 다. 최소억제농도는 맨 눈으로 관찰해 세균의 성장을 완전 히 억제하는 최소농도이나 일관성이 떨어지는 단점이 있 다. 따라서, 600 nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 세균 의 성장 정도를 측정하고, 다른 연구를 참고해 항생제를 포함하지 않은 배지에 배양한 대조군과 비교해 세균의 성 장을 90% 이상 억제하는 농도를 최소억제농도로 결정하 였다[13-14].

Gentamicin의 최소억제농도 이하에서 과성장한 S. salivarius의 항생제 내성 획득 평가

최소억제농도보다 낮은 농도의 gentamicin이 있을 때 항 생제가 없는 조건에서보다 더 많이 성장한 S. salivarius KCTC 5512를 항생제가 없는 액체배지에서 24시간 배양한 후, 0.25 - 4 μg/ml의 gentamicin에 대해 항생제 민감도를 다시 측정하였다. 이 후 최소억제농도보다 낮은 농도에서 과성장 한 세균을 이용해 위와 같은 실험을 반복함으로써 최소억제 농도의 변화가 있는지 관찰하였다.

결 과

베타-락탐계 항생제인 amoxicillin과 cefotaxime이 최대 4 μg/ml의 농도에서 A. johnsonii와 S. salivarius KCTC 5512의 성장을 90% 이상 억제하는 것을 확인 할 수 있었다. 린코 사마이드계 항생제인 clindamycin도 최대 16 μg/ml의 농도 에서 A. johnsonii와 S. salivarius KCTC 5512의 성장을 억제 하는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 이들 항생제의 경우 유해균인 A. johnsonii의 최소억제농도가 S. salivarius KCTC 5512에 대한 최소억제농도보다 높았다. 니트로이미 다졸계 항생제인 metronidazole은 A. johnsonii와 S. salivarius KCTC 5512에 대해 사용한 농도 범위에서는 성 장억제효과를 보이지 않았다. 아미노글리코사이드계 항생 제인 gentamicin은 최대 4 μg/ml의 농도에서 A. johnsonii와 S. salivarius KCTC 5512의 성장을 모두 억제 하였고, 유해 균인 A. johnsonii를 저농도에서 더욱 효과적으로 억제하는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig. 1).

이를 바탕으로 다른 S. salivarius 균주인 KCTC 3960과 구강 점막 상주균인 R. mucilaginosa, N. oralis, V. dispar에 대한 gentamicin의 최소억제농도를 확인하였다. S. salivarius KCTC 3960과 R. mucilaginosa, N. oralis, V. dispar 모든 균에 서 A. johnsonii의 최소억제농도보다 높은 농도에서 성장이 억제되는 것을 확인하였다 (Fig. 2). 따라서, gentamicin 1 μ g/ml의 농도에서 재발성 아프타성 구내염 관련 유해균인 A. johnsonii의 성장을 90% 이상 억제하면서, 시험해 본 다 른 구강 점막 상주균의 성장은 억제 하지 않는 것을 확인하 였다.

흥미롭게도 S. salivarius를 비롯 몇 가지 구강 상주균이 최소억제농도보다 낮은 농도 중 특정 농도의 gentamicin이 포함된 배양액에서 항생제가 없는 배양에서 보다 더 잘 자 라는 현상을 보였다. 일반적으로 최소억제농도보다 낮은 농도의 항생제에 노출된 세균은 그 항생제에 대한 저항을 획득하게 된다. S. salivarius KCTC 5512 균주를 이용해 최 소억제농도보다 낮은 gentamicin 존재 하에 과성장한 세균 이 gentamicin에 대한 저항을 획득했는지 확인하기 위해 다시 항생제 민감성 검색을 수행하였다. 세 번에 걸친 연 속실험에서 최소억제농도에서 과성장한 세균은 gentamicin 에 대한 민감성을 상실하지 않았고, 여전히 최소억제농도 보다 낮은 농도에서는 항생제가 없는 조건보다 더 잘 자라 는 특성을 유지하였다 (Fig. 3).

고 찰

본 연구에서는 재발성 아프타성 구내염과 연관된 세균 A. johnsonii의 성장을 선택적으로 억제하는 항생제를 검색 한 결과, 1 - 2 μg/ml gentamicin이 A. johnsonii의 성장을 억제 하는 반면 유익균인 S. salivarius를 포함한 몇 가지 구강점막 상주균의 성장은 오히려 촉진할 수 있음을 발견하였다.

일반적으로 최소억제농도보다 낮은 농도의 항생제는 세 균의 형태나 부착능을 변화시키거나 항생제 저항을 유발하 는 것으로 알려져 있다[15]. 특히 아미노글리코사이드계 항 생제는 최소억제농도 이하에서 Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium abscessus 등의 바이오필름 형성을 촉진 하는 것이 잘 알려져 있다[16-18]. 그러나 최소억제농도보다 낮은 농도의 항생제가 부유상태로 자라는 세균의 성장을 증가시 킨다는 보고는 찾을 수 없었다. 저농도 gentamicin에 의한 S. salivarius의 과성장은 항생제 저항성과는 연관이 없었으 며, 동일한 아미노글리코사이드계인 tobramycin에 의해서는 관찰되지 않았다 (발표하지 않은 실험결과). 정확한 기전은 알 수 없으나, Linares 등이 제안한 것과 같이 항생제를 세균 에 대한 무기가 아닌 세균집단의 항상성을 조절하는 신호물 질로 설명해 볼 수 있다[19]. 즉, 자연생태에서 경쟁을 위해 다른 세균을 죽이기도 하지만 자신 또는 자신에게 이로운 세균의 성장을 도울 가능성이다. 이에 대해서는 앞으로 추 가 연구가 필요하다.

사람의 인체에는 다양한 균들이 공생 또는 상생하며 균 형을 이루고 있지만, 이 균형이 깨져 불균형 상태가 되면 상주균의 성장은 저해되고 병원균이 과증식하게 된다[20]. 이러한 인간 세균총의 불균형이 당뇨, 대장염, 암, 자가면 역질환 등 다양한 질병의 병인에 관여한다는 보고가 증가 하고 있다[21-23]. 마찬가지로 구강 내 세균총의 균형이 깨 지면 치주염과 같은 구강질환뿐 아니라 암이나 염증성 전 신질환의 발병 가능성이 높아진다는 보고가 있다[24-25]. 재발성 아프타성 구내염 환자의 구강세균총은 S. salivarius, S. parasanguinis, V. dispar, R. dentocariosa와 같은 대표적 인 구강세균은 감소하는 반면, A. johnsonii, Myxococcus, Blautia와 같이 구강의 상주세균이 아닌 세균이 증가하여 전형적인 불균형 양상을 보였다[9]. 재발성 아프타성 구내 염 환자에서 관찰된 구강세균총 불균형이 질병의 원인이 라는 증거는 아직 부족하나, 구강세균총 불균형을 회복시 켜 주면 아프타성 구내염의 재발을 막고 근원치료를 제공 할 수 있을지도 모른다.

본 연구는 구강에 존재하는 다양한 세균을 모두 검색하지 않았고 균주에 따라 항생제 감수성이 다를 수 있다는 큰 한계가 존재 한다. 그러나, 구강 내에 존재하는 수많은 세균 을 모두 검색하는 것은 불가능하기 때문에 파일롯 임상시험 을 통해 저농도 gentamicin의 국소적용이 구강점막 세균총 구조에 미치는 영향을 high throughput sequencing으로 분석 하는 것이 현실적인 접근법이라고 생각된다.

결론적으로 본 연구는 한계는 있으나 재발성 아프타 성 구내염 환자에서 관찰된 구강세균 불균형 회복에 저 농도 gentamicin 을 활용할 가능성을 제시하였다.