서 론
흥분성 신경전달물질로 알려진 글루탐산염(glutamate) 은 척수의 등뿔쪽(dorsal horn)에 존재하는 일차구심신경 말단에서 분비되어 통증을 전도하는 물질로 알려져 있다 [1, 2]. 분비된 글루탐산염은 수용기와 결합하여 작용을 나타내며 작용을 마친 다음에는 시냅스 틈새에서 제거된 다. 이때 시냅스전신경이나 시냅스후신경 세포막에 존재 하는 글루탐산 운반체(transporter)에 의해 신경세포 내로 유입되거나 별아교세포막에 존재하는 글루탐산 운반체에 의해 별아교세포 내로 유입되어[3, 4] 제거된다. 시냅스로 분비된 글루탐산염이 이들 운반체에 의해 신속하게 제거 되는 것은 신경흥분이 지속적으로 나타나는 것을 막기 위 한 보호 작용으로 볼 수 있다[5, 6]. 이와 같이 시냅스에서 글루탐산염을 낮은 농도로 일정하게 유지하여 주는 항상 성이 파괴되면 농도가 증가하게 되어 신경 흥분성이나 통 증이 발생할 수 있기 때문에 글루탐산염의 분비나 제거가 균형을 이루면서 글루탐산염이 낮은 농도로 유지되는 것 이 정상적인 신경활동에서 매우 중요하다.
정상적인 실험동물에서 글루탐산염의 운반체를 억제하 면 등뿔신경 활동성이 증가하고, 자발성 통증 행위반응이 나타나며, 열 통증 자극이나 기계적 통증 자극에 대한 반 응이 증가하는 등의 통증반응을 유발하였다[7, 8]. 이러한 통증 반응이 나타나는 이유는 정상 실험동물에서 글루탐 산염의 운반체를 억제하면 시냅스 틈새에 존재하는 글루 탐산염의 농도가 높아지기 때문이라고 판단된다[9, 10]. 하지만 이미 통증이 발생한 실험동물에서 글루탐산염의 운반체를 억제하면 정상 실험동물에서 나타나는 통증반 응이 나타나지 않는다. 글루탐산염 운반을 억제하는 약물 을 척수 내로 직접 투여하면 포르말린에 의해 나타나는 통 증 반응은 오히려 억제되었으며[11, 12] Complete Freund’s Adjuvant(CFA) 주입으로 발생하는 열통증 또한 유의하게 억제하였다[12]. 그러나 이와 같이 통증이 발생한 실험동 물에서 글루탐산염 운반을 억제하면 정상 실험동물과는 반대로 나타나는 진통작용 기전에 대해서는 아직 확실하 게 밝혀진 바가 없다.
신경세포뿐만 아니라 신경교세포에 존재하는 글루탐 산 운반체도 글루탐산염의 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있다[13, 14]. 특히 별아교세 포로 유입된 글루탐산염은 글루타민(glutamine)으로 바뀌 어 신경세포로 다시 전달되어 재사용됨으로써 글루탐산 염의 농도를 일정하게 유지하는 역할을 한다. 별아교세 포에서 글루탐산염을 글루타민으로 변화시키는 효소를 차단하는 methionine sulfoximine(MSO)를 척수 내로 주입 하면 삼차신경 손상[15]이나 만성 치수염[16]으로 인하 여 연수의 통증 신경세포 활동이 증가되는 것을 유의하 게 억제하였다. 이러한 실험결과는 별아교세포에 존재하 는 글루탐산 운반체도 시냅스에서 글루탐산염의 항상성 을 유지하는데 매우 중요하다는 것을 말해준다. 비록 이 러한 실험결과들이 글루탐산 운반체가 통증유발에 중요 하게 작용하다는 것을 보여주고 있으나 글루탐산 운반 체 조절이 안면에서 발생하는 이질통증에 미치는 영향 을 평가한 실험은 거의 없는 실정이다.
본 연구에서는 글루탐산 운반체의 기능을 차단하였을 때 안면에서 발생한 이질통증에 미치는 영향을 평가하였다. 먼저 정상 실험동물의 소뇌연수조(intracisternal injection)로 신경세포에 존재하는 글루탐산 운반체를 차단하는 threo- β-Benzyloxyaspartic acid(TBOA)나 별아교세포에 존재하는 글루탐산 운반을 차단하는 MSO를 각각 투여한 다음 이 질통증이 발생하는지를 관찰하였다. 염증성 이질통증을 야기하기 위하여 안면 조직의 피하로 interleukin-1β(IL-1 β)를 주입한 실험동물과 신경병성 통증을 야기하기 위하 여 안와하신경(infraorbital nerve)를 묶은 실험동물에서 소 뇌연수조로 TBOA와 MSO를 각각 주입하여 이질통증에 미치는 영향을 평가하였다.
재료 및 방법
실험동물
실험동물은 수컷 Sprague-Dawley계 흰 쥐 (230~280 g) 를 사용하였고, 경북대학교 치의학전문대학원 동물실에 서 일정한 온도와 12시간 주/야 빛의 순환주기를 갖는 환 경에서 실험동물용 사료와 물을 자유롭게 공급하여 사육 하였다. 본 연구는 경북대학교 실험동물위원회의 승인 (2015-0053)을 얻었으며, 의식이 있는 동물 실험에 관한 세계통증연구학회의 윤리적 규정을 준수하였다. 모든 행 위반응에 관한 실험은 암맹검사로 진행하였다.
소뇌연수조로 약물주입(Intracisternal catheterization)
얼굴영역의 감각정보가 전달되는 삼차신경핵의 감각핵 군으로 약물을 투여하기 위하여 실험동물의 소뇌연수조로 카테터(catheter)를 삽관하는 수술을 실시하였다[17-19]. 실 험동물은 ketamine(40 mg/kg)과 xylazine(4 mg/kg) 혼합액을 근육으로 주사하여 마취시켰으며, 마취된 쥐는 stereotaxic frame(David kopf instruments, Tujunga, CA, USA)으로 머리를 고정시켰다. 약물을 주입하기 위해 atlantooccipital membrane 과 경막을 노출시킨 다음 폴리에틸렌관(PE10, Clay Adams, Parsippany, NJ)을 소뇌연수조 내로 삽관하였다. 폴리에틸 렌관의 위치는 신경의 빗장(obex)부위에 두었으며 폴리에 틸렌관을 두개골 부위로 빼내어 금속 나사못과 치과용 레 진(Dentsply Caulk, Milford, USA)을 사용하여 머리에 고정 하였다. 선행실험과 같이 수술 후 72시간 동안 실험동물을 회복시켰다[20, 21].
실험동물 모델
IL-1β-treated animals: 항상 일정한 위치에 약물을 투 여하기 위해 마취된 쥐의 왼쪽 안면영역에서 3번째 줄 의 5번째에 위치하고 있는 수염부분에 폴리에틸렌관을 삽관하였다. 수술 후 72시간 동안 실험동물을 회복시켰 다. 안면부위에서 염증을 유발하기 위하여 선행 실험에 서와 같이[22-24] IL-1β(10 ng/20 μL)를 피하조직으로 주 입하였다. 선행실험에서 피하조직으로 주입한 IL-1β는 30분 후 유의한 이질통증을 유발하였으며 3시간 이상 지속하였다[24]. 따라서 TBOA와 MSO는 IL-1β를 주입하 고 2시간이 경과한 다음 이질통증이 유발한 것을 확인 하고 소뇌연수조로 투여하였다.
Trigeminal neuropathic animal model: 실험동물을 마취 한 뒤 선행연구에서 사용된 방법과 동일하게 수술을 하 였다[25, 26]. 실험동물의 구강 내에서 제 1 대구치 영역 의 치은과 협측(gingivo-buccal margin)선을 따라 절개하 고 안와하신경을 노출시켰다. 노출된 신경을 느슨하게 두 번 묶은 (5-0 chromic gut) 다음 절개선을 봉합하였다. 대조군으로는 신경을 노출시켰으나 신경을 묶지 않았다. 안와하신경 손상은 유의한 이질통증을 유발하였으며 나 타난 이질통증은 20일 이상 지속하였다. 신경손상 후 7 일이 경과하여 이질통증이 최고로 나타났을 때 TBOA와 MSO를 소뇌연수조로 주입하고 이질통증에 미치는 영향 을 평가하였다.
이질통증의 평가
통증 행위반응을 관찰하기 위해 실험동물이 목을 빼내 어 자유롭게 움직일 수 있도록 설계된 투명한 플라스틱 관 찰용 통에 한 마리씩 넣어 실험을 수행하였다. 기계적 이 질통증을 평가하기 위해 공기자극 테스트(air-puff test)를 이용하였는데[27-30], 삼차신경이 지배하는 안면영역에 가 해지는 연속된 10번의 공기자극을 4초 동안 10초의 간격 으로 주었을 때 머리를 회피하거나 깨무는 등의 공격적인 행동이 나타나는 것을 행위반응의 평가기준으로 삼았다. 공기자극은 금속관(26 gauge, 10 cm)을 통해 피부로부터 1 cm 떨어진 곳에서 90도 각도로 적용하였다. 공기자극 세 기와 간격은 pneumatic pump module(BH2 system, Harvard Apparatus, USA)로 조절하였다. 자극의 역치는 총 시도에 서 50% 이상의 반응을 보인 경우로 평가하였으며[30-32], 40 psi 이상의 자극에서도 반응이 나타나지 않으면 자극을 중지하였다. 정상적인 동물은 압력세기가 40 psi 이하인 경우 어떠한 통증 반응도 나타내지 않았다.
실험에 사용한 약물
신경세포막에 존재하는 glutamate/aspartate transporter (GLAST), glutamate transporter-1(GLT-1), excitatory amino acid carrier 1(EAAC1) 등을 억제하는 약물로 TBOA[33, 34]를 사용하였다. 별아교세포에서 글루탐산에서 글루타 민으로 변화시켜주는 효소인 glutamine synthetase[16, 35, 36]를 억제하는 MSO를 사용하여 글루탐산염의 이동을 억제하였다. TBOA는 Tocris Bioscience(Langford, Bristol, UK)에서 구입하였으며 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) 용액을 이용하여 용해하였다. MSO는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입하였으며 멸균된 생리식염수에 용 해하였다.
통계분석
실험결과의 유의성을 검증하기 위해 다중 그룹에서 반복 측정자료의 분산분석법과 Holm-Sidak 사후 분석법을 이용 하였다. 개별 시간에 따른 유의성을 확인하기 위해서 일원배 치분산분석(ONE-WAY ANOVA)를 실시하였다. 통계적인 비교를 위해 통계적 유의성의 표준값은 P<0.05로 설정하였 다. 모든 결과는 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표시하였다.
결 과
정상상태의 실험동물에서 신경세포의 글루탐산운반체 를 억제하는 TBOA와 별아교세포에서 글루탐산염 운반 을 억제하는 MSO를 소뇌연수조로 주입한 다음 이질통 증이 발생하는지를 평가하여 그림 1에 나타내었다. 소뇌 연수조로 TBOA(1, 10 μg)를 주입하면 주입 직후 공기자 극에 의한 역치값이 유의하게 낮게 나타났으며 이러한 억제작용은 주입 후 75분까지 지속하였다(P<0.05). 그러 나 소뇌연수조로 MSO(2, 20 μg)을 투여하였을 때는 공 기자극의 역치에 아무런 영향을 나타내지 못하였다.
그림 2는 안면 피하조직으로 IL-1β를 투여하여 염증 을 유발한 실험동물에서 나타나는 이질통증에 TBOA나 MSO를 소뇌연수조로 주입하였을 때 미치는 영향을 평 가하여 나타내었다. 안면 피하조직으로 10 ng의 IL-1β를 투여하면 공기자극의 역치를 유의하게 억제하여 이질통 증을 유발시켰다. IL-1β를 투여한 2시간이 지난 다음 이 질통증이 최고로 나타나는 시기에 소뇌연수조로 TBOA (1, 10 μg)를 투여하면 IL-1β로 유발되는 이질통증을 유 의하게 억제하였다 (P<0.05). 같은 방법으로 MSO를 투 여한 다음 이질통증에 미치는 영향을 평가하면 낮은 농 도의 MSO(2 ug)를 투여한 군에서는 공기자극 역치에 아무런 영향을 미치지 못하였지만 높은 농도의 MSO(20 μg)를 투여한 군에서는 이질통증을 유의하게 억제하였 다(P<0.05). 그러나 TBOA가 이질통증을 억제하는 효과 보다는 낮게 나타났다.
그림 3은 안와하신경을 결찰하였을 때 나타나는 이질통 증에 소뇌연수조로 TBOA나 MSO를 투여하였을 때 미치는 효과를 나타내었다. 안와하신경을 결찰하면 수술 후 2일이 지나 이질통증이 유발하였고 발생한 이질통증은 20일 이상 지속되었다. 신경손상 후 이질통증이 최고로 나타나는 7일 째 소뇌연수조로 TBOA나 MSO를 투여하였다. 소뇌연수조 로 TBOA(1, 10 μg)를 투여하면 신경손상으로 발생하는 이 질통증이 유의하게 억제되었다(P<0.05). 또한 MSO(2, 20 μ g)를 투여한 군에서도 이질통증을 유의하게 억제하였다 (P<0.05). 고농도인 20 μg의 MSO를 투여한 다음 나타나는 진통작용을 통증모델에 따라 비교하였을 때 IL-1β를 투여 한 실험동물에서 나타나는 진통작용보다 신경손상을 가한 실험동물에서 나타나는 진통작용이 더 크게 나타났다.
고 찰
본 연구에서는 소뇌연수조로 글루탐산 항상성을 조절 하는 TBOA나 MSO를 각각 투여한 다음 이질통증에 미치 는 영향을 평가하였다. 정상 실험동물에서는 신경세포의 글루탐산운반체를 차단하는 TBOA는 이질통증을 유발시 켰으나 별아교세포에서 글루탐산 운반을 차단하는 MSO 는 이질통증을 발생시키지 못하였다. IL-1β를 주입하여 염증성 통증을 유발시킨 실험동물이나 안와하신경을 묶 어 신경병성통증을 야기한 실험동물에서 TBOA는 정상동 물에서와는 반대로 진통작용이 나타났다. 소뇌연수조로 투여한 MSO는 염증과 신경손상으로 야기되는 이질통증 을 모두 감소시켰으나 신경손상으로 인한 이질통증의 억 제효과가 더 크게 나타났다. 이러한 실험결과는 글루탐산 염의 운반이 차단되면 안정상태 또는 통증이 발생한 상태 에 따라 통증반응이 서로 다르게 나타난다는 것을 보여준 다. 안정상태에서는 신경세포의 글루탐산염의 운반체가 주로 통증조절에 작용하며, 급성통증에서 만성통증으로 진행될수록 별아교세포의 글루탐산염 운반이 통증 조절 에 더 중요하다는 것으로 보여준다.
흥분성 아미노산인 글루탐산염은 일차구심신경말단에 서 분비되어 흥분신호를 조절하는데 이때 글루탄산염 운 반체가 시냅스에서 글루탐산염의 농도를 조절한다[3]. 현 재까지 포유류 신경세포에 존재하는 글루탐산염 운반체는 GLAST, GLT-1, EAAC1, excitatory amino-acid transporter 4(EAAT4), excitatory amino-acid transporter 5(EAAT5) 등 5 개가 확인되었다[3, 38, 39]. 본 연구에서는 신경세포에 존 재하는 GLAST, GLT-1, EAAC1을 억제하는 TBOA와 별 아교세포에서 글루탐산에서 글루타민으로 변화시키는 glutamine synthetase[16, 35, 36]를 억제하여 글루탐산염 농 도를 조절하는 MSO을 소뇌연수조로 주입하여 이질통증 발생에 미치는 영향을 평가하였다. 정상적인 환경에서는 굵은 신경섬유는 통증이나 이질통증을 유발하지 않는다. 그러나 염증상태와 신경손상과 같은 병적인 상태가 되면 굵은 신경섬유가 이질통증 발생에 관여한다고 알려져 있 다[24].
정상상태의 실험동물에 소뇌연수조로 투여한 TBOA는 이질통증을 유발하였으나 MSO를 투여하면 이질통증이 발생하지 않았다. 이러한 실험결과는 정상상태에서 척수 의 신경시냅스에서 글루탐산염의 농도가 일정하게 유지 되는데 신경세포에 존재하는 글루탐산염 운반체가 주로 작용하며 별아교세포에서 글루탐산염을 농도를 조절하는 기능은 정상상태에서는 중요하게 작용하지 않는다는 것 을 알 수 있다. 이와 같이 글루탐산염 운반체가 통증발생 에 중요하게 작용한다는 것은 선행연구들의 연구결과와 일치하고 있다. 글루탐산염 운반체 발현을 증가시키면 통 증이 억제되었고[40] 운반체 발현을 억제시키면 통증이 유발되었다[41]. 이러한 실험 결과는 글루탐산염 운반체 작용이 증가하여 글루탐산염의 농도가 낮아지면 통증 전 도를 억제할 수 있으며 글루탐산염 운반체 작용이 감소하 여 글루탐산염의 농도가 증가하면 통증이 유발될 수 있다 는 것을 설명하고 있다. 또한 선행연구에서 글루탐산염 운반을 차단하여 시냅스의 글루탐산염 농도를 증가시킬 경우 정상 실험동물에서 열통증을 유발시켰다[37]. 이러 한 실험결과에서 글루탐산염 농도 조절이 이질통증 전도 뿐만 아니라 열통증 발생에도 중요한 역할을 한다는 사실 을 알 수 있으며 글루탐산의 농도조절이 새로운 통증조절 방안이 될 수 있다는 것을 보여주고 있다.
본 연구에서 글루탐산염 운반체의 억제는 정상 실험 동물에서 이질통증을 유발하였기 때문에 통증이 유발된 실험동물에서는 더욱 통증을 증가시킬 것으로 예상된다. 그러나 소뇌연수조로 주입한 TBOA나 MSO는 염증이나 신경손상으로 유발된 이질통증을 오히려 억제하였다 (paradoxical antinociception). 이와 같은 역설적 진통작용 (paradoxical anti-nociception)은 선행연구에서도 관찰할 수 있었다. 선행연구에서 글루탐산염 운반을 차단하여 시냅스의 글루탐산염 농도를 증가시킬 경우 정상 실험 동물에서는 열통증을 유발시켰지만 염증에 의해 발생하 는 열통증은 오히려 억제하였다[37]. 또한 GLAST를 유 전자 조작으로 제거한 실험동물의 뇌척수액에서 글루탐 산염의 농도가 증가한 것을 직접 관찰하였으며, 포르말 린 주입으로 유발되는 통증 행위반응이 억제하였다[42]. 그러나 글루탐산염 운반체 조절로 나타나는 진통작용은 단순하게 글루탐산염의 농도조절 뿐만 아니라 다른 작 용기전이 관여할 가능성도 있어 기전을 정확하게 밝히 기 위해서는 추가적인 연구가 필요해 보인다.
별아교세포는 글루탐산염을 glutamine synthetase을 이 용하여 글루타민으로 변화시켜 세포 밖으로 배출시켜 시 냅스에서 글루탐산염의 농도를 조절하는 것으로 알려져 있다[14, 43, 44]. 본 연구에서 glutamine synthetase를 억제 하는 MSO를 소뇌연수조로 투여하여 이질통증 발생에 미 치는 영향을 평가하였다. 소뇌연수조로 투여한 MSO는 정상상태의 실험동물에서는 이질통증을 발생시키지 못하 였으나 IL-1β에 의해 야기되는 염증과 신경손상으로 발 생하는 이질통증을 유의하게 억제하였다. 그러나 상대적 으로 염증에 의한 이질통증의 억제효과보다 신경병성 이 질통증이 더 크게 억제되었다. 이러한 실험결과는 별아교 세포에서 조절하는 글루탐산염의 농도는 정상상태보다 통증이 발생한 상태에서 더욱 중요하게 작용하며, 급성통 증 보다 만성통증 발생에서 보다 중요하게 작용한다는 것 으로 알 수 있다. 또한 별아교세포에서 글루탐산염 조절 방법이 신경손상으로 나타나는 신경병성 통증 치료에 새 로운 치료방법으로 개발될 수 있다는 것을 보여 준다.
이상의 실험결과를 종합해 보면 IL-1β를 주입하여 염 증을 유발시킨 실험동물이나 안와하신경을 묶어 신경손 상을 야기한 실험동물에서 글루탐산염의 운반을 차단하 면 진통작용이 나타났다. 따라서 향후 글루탐산염의 운 반을 조절하는 것이 진통제 개발에 중요한 역할을 할 것으로 판단된다.
