서 론

치주염은 세균에 의하여 야기되는 염증성 질환으로 골 흡수 증가와 골 형성 억제에 의한 치조골 소실이 주요한 특징으로 나타나며[1], 치조골소실 뿐 만 아니라 치근 흡 수도 일어난다[2-4]. 파골세포는 뼈를, 파치세포는 치아를 흡수하는 세포로 모두 tartrate resistant acid phosphatase (TRAP)와 cathepsin K를 발현하는 다핵세포이다[5-7]. 골 수의 조혈모세포로 부터 형성된 파골세포 전구세포는 바 로 골 표면으로 이동하거나 혈관을 거쳐 골 표면으로 이 동한 후 TRAP 발현과 융합과정을 거쳐 다핵의 파골세포 로 분화하며[8-10], 활성화 과정에서 clear zone과 ruffled border을 형성하고 수소이온과 단백분해효소를 분비하여 골을 파괴한다. 파치세포는 골수의 조혈모세포 또는 치주 인대에 존재하는 세포로 부터 분화하는 것으로 여겨지고 있다[11]. 파치세포의 분화 과정과 특성은 파골세포와 유 사하나 파골세포 보다 일반적으로 크기가 작고, 핵 수가 적으며, 형성하는 흡수 와(resorption pit)의 크기가 작은 것으로 보고되어 있다[5-7,12,13].

Receptor activator of nuclear factor-κB ligand(RANKL)은 파골세포의 TRAP 발현, 융합과 활성화를 유도하는 주요 한 파골세포 분화 유도인자이며 파골세포 전구세포와 파 골세포는 RANKL에 대한 수용체인 RANK를 발현한다 [8-10]. RANKL은 골에 존재하는 세포인 조골세포, 골세 포와 파골세포, 면역세포인 T 세포와 B 세포, 치아 구성 세포인 치아모세포, 시멘트질모세포, 파치세포와 치주인 대 섬유아세포와 같은 다양한 세포가 발현하며 RANK는 파치세포 전구세포와 파치세포가 발현한다[5,12-19]. RANK 과발현 유도 생쥐에서는 치근이 흡수되는 양상과 TRAP 양성 파치세포가 관찰되었고 RANKL의 작용을 억제하는 osteoprotegerin 결여 생쥐에서는 치근흡수와 파치세포의 수가 정상 생쥐보다 증가하였다. 이들 결과는 RANKL이 파치세포의 형성에 관여함을 시사한다[20,21].

Tumor necrosis factor-α(TNF-α)는 혈관내피세포의 부착 분자 발현을 유도하여 혈관 내 호중구, 단구와 림프구의 혈관 밖 이동을 유도하는 염증유도 사이토카인으로 파골 세포 분화에도 관여한다[22,23]. 쥐 치아에 교정력을 가한 경우 치근 흡수와 파치세포가 관찰되었고 TNF-α 발현도 증가하였다. 또한 교정력이 가해지는 동안 TNF-α 억제제 를 투여하는 경우 치근 흡수가 감소되는 것을 관찰하여 [24,25] TNF-α가 교정력에 의한 치근 흡수에 관여할 수 있음이 제시되었다. 당뇨와 치주염을 유발한 쥐의 치은 열구에서 정상쥐보다 높은 TNF-α 수치를 보여 당뇨에 의 한 치주염 악화에 TNF-α의 관련성이 제시되었으나[26], 당뇨동반치주염에서 형성되는 파치세포와 TNF-α의 연관 성은 밝혀져 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 당뇨동반 치주염 쥐에 TNF-α 억제제인 infliximab를 투여하여 파치 세포 형성에 미치는 TNF-α의 효과를 평가하였다.

재료 및 방법

쥐에서 당뇨와 치주염 유발

6주의 수컷 근교계 F344 쥐(오리엔트바이오, 성남)를 구 입하고 1주일 간 순화시킨 후 동물실험을 진행하였다. 쥐는 대조군, 당뇨 및 치주염 유발군(당뇨치주염군), infliximab를 투여한 당뇨 및 치주염 유발군(억제제투여 당뇨치주염군)으 로 분류하였다. 당뇨는 하룻밤 절식 후 0.1 M citrate buffer에 녹인 streptozotocin(STZ, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, 50 mg/kg)을 정맥내 투여하여 유도하였다. 대조군에는 citrate buffer 만을 투여하였다. STZ 또는 citrate buffer 투여 일주일 후, 쥐를 zoletil 50(Virbac, Carros, France)과 rompun (Bayer, Ansan, Korea)의 1:2 혼합액으로 마취한 후 치실을 양쪽 하악 제일 대구치에 묶어 치주염을 유발하였다. 쥐는 치주염 유발 3일과 20일째에 희생하였고 실험기간 동안 치 실의 존재여부와 체중변화는 일정 시간 간격으로 확인하였 다. Infliximab(5 mg/kg, Janssen Biologics B. V., Leiden, Netherlands)는 복강 내로 투여하였으며 3일째의 경우 치주 염 유발 4시간 전에, 20일째의 경우 치주염 유발 7일과 14일 에 투여하였다. 당뇨 유발의 확인을 위하여 치주염 유발 직 전과 희생시키기 직전에 공복 혈당수치를 Accu-Check active system (Roche, Mannheim, Germany)으로 측정하였고 300 mg/dL 이상의 공복혈당을 나타내는 개체를 당뇨상태로 간 주하였다. 본 실험은 연세대학교 실험동물윤리위원회의 승 인(2014- 0393)을 받아 진행하였다.

파치세포 형성 평가

희생시킨 쥐의 하악을 적출한 후 10% 중성 완충 포르말 린에서 이틀 고정하고 10% EDTA 용액에서 2달간 탈회하였 다. 탈회된 하악을 파라핀에 포매한 후 슬라이드 절편을 제 작하였고 제일 대구치의 근심과 원심 치근의 치수가 잘 보 이는 절편을 선택하여 TRAP과 cathepsin K에 대한 염색을 실시하였다. TRAP은 TRAP 염색 kit(Sigma- Aldrich)를 이용 하여 염색하였고, cathepsin K에 대한 면역염색은 Immpress universial reagent(Vector, Burlingame, CA, USA)를 이용하여 이전 보고를 참고하여 시행하였다[27]. 슬라이드 절편을 cathepsin K 항체(희석농도 1:75; Santa Cruz Biotechnology Inc, CA, USA)로 4°C에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후 이차항 체와 streptoavidin 처리 후 DAB로 발색하고 메틸 그린으로 대조염색하였다. 음성 대조 절편은 일차항체를 반응시키지 않았다. 제일 대구치 치근의 근심, 이개부와 원심면의 TRAP 또는 cathepsin K 양성 세포를 계수한 후 치근의 길이(mm)로 나누어 파치세포의 수를 계산하였다. 치근면의 거리는 viewpoint microscope slide viewer software(Precipoint, Freising, Germany)을 이용하여 측정하였다.

통계학적 평가

SPSS software 프로그램을 모든 통계 평가에 사용하였 고, one-way analysis of variance (ANOVA)로 군간의 통 계학적 차이를 평가하였다. P 값이 0.05 이하인 경우 통 계학적 유의차가 나는 것으로 간주하였다.

결 과

TNF 억제제에 의한 치근면의 TRAP 양성 파치세포 수의 변화

TNF-α 억제제가 파치세포의 형성에 미치는 영향을 평 가하기 위하여 치주염 유발 3일과 20일째에 제일 대구치 치근면의 TRAP 양성 세포의 수를 측정하였다(Fig. 1). 3 일째에 당뇨치주염군의 TRAP 양성 세포의 수는 대조군 보다 증가하였으며, 억제제투여 당뇨치주염군의 TRAP 양성 세포 수는 당뇨치주염군보다 감소하였다. 20일째에 는 대조군, 당뇨치주염군, 억제제투여 당뇨치주염군 모두 TRAP 양성 세포의 수의 차이를 나타내지 않았다.

TNF 억제제에 의한 치근면의 cathepsin K 양성 파치 세포 수의 변화

파치세포 형성을 명확히 평가하기 위하여 cathepsin K에 대한 면역염색을 실시하여 치주염 유발 3일과 20일째에 제 일 대구치 치근면의 cathepsin K 양성 세포의 수를 측정하였 다(Fig. 2). 3일째에 당뇨치주염군의 cathepsin K 양성 세포의 수는 대조군보다 증가하였으며, 억제제투여 당뇨치주염군 의 cathepsin K 양성 세포 수는 당뇨치주염군보다 감소하였 다. 20일째에는 모든 군에서 차이를 나타내지 않았다. 또한 cathepsin K 양성 단핵과 다핵 세포를 분류하여 계수하였을 때 3일째의 당뇨치주염군에서 단핵과 다핵 세포의 수가 대 조군과 비교하여 증가하였으며, 억제제투여 당뇨치주염군 에서는 다핵 세포가 당뇨치주염군보다 감소하였다.

TNF 억제제에 의한 치근면 부위에 따른 cathepsin K 양성 파치세포 수의 변화

치근면 부위에 따른 파치세포 수의 변화를 확인하기 위하 여 치근면을 근심, 이개, 원심으로 나누어 cathepsin K 양성 세포의 수를 계수하였다(Fig. 3). 3일째 이개면의 cathepsin K 양성 세포의 수는 당뇨치주염군에서 대조군과 비교하여 증가하였으며 억제제투여 당뇨치주염군에서는 당뇨치주염 군과 비교하여 감소하였다. 원심면에서는 당뇨치주염군에 서 대조군과 비교하여 증가하였으나 억제제투여 당뇨치주 염군과는 유의적인 차이를 보이지 않았다.

고 찰

파치세포는 osteopontin과 bone sialoprotein의 탈인산화를 유도하는 TRAP과 collagen을 분해하는 cathepsin K 효소를 발현한다[11,28]. 따라서 본 연구에서는 파치세포의 형성을 명확히 파악하기 위하여 TRAP 양성 세포와 cathepsin K 양 성 세포의 수를 함께 관찰하였으며, TRAP은 효소활성측정 법으로, cathepsin K는 면역조직화학염색법으로 평가하였 다. 이를 통해 당뇨동반치주염에서 TNF-α 억제제에 의한 치근면의 파치세포 형성 감소를 관찰할 수 있었다.

당뇨동반치주염군에서 파치세포 형성증가와 함께 치조 골소실이 대조군보다 증가됨이 확인되었다(결과 제시하 지 않음). 당뇨동반치주염군의 치근면 TRAP 양성 세포의 수는 이전 연구와 동일하게 대조군과 비교하여 3일째에 증가하였으나 20일째에는 차이를 보이지 않았다[29]. 치 근면의 cathepsin K 양성 세포도 TRAP 양성 세포와 동일 한 양상을 보였으며 이는 당뇨동반치주염의 초기에 파치 세포 형성이 일시적으로 증가함을 시사한다. 당뇨동반치 주염 쥐에서 파골세포도 파치세포와 동일하게 치주염 유 발 3일째에 가장 많은 세포 수를 보였다[27]. 이는 당뇨동 반치주염의 초기에 경조직을 흡수하는 파골세포와 파치 세포 형성이 활발히 일어날 수 있음을 시사하는 것이다.

6개의 사람 유치에서 흡수 와를 형성한 총 242개의 TRAP 양성 세포 중 2.9%가 단핵세포임을 확인하여 TRAP 양성 단핵의 파치세포도 치근을 흡수할 수 있음이 제시되었다 [30]. 당뇨치주염군에서도 3일째에 cathepsin K 양성 단핵과 다핵세포 모두 대조군에 비하여 증가하였다. 이는 당뇨동반 치주염에서 단핵과 다핵의 파치세포 형성이 증가함을 나타 내는 것이다.

치주염 때문에 발치한 사람 치아 중 치근단 1/3 부위에 서 흡수를 보이는 치아는 71.2%, 중앙 1/3 부위에서 흡수 를 보이는 치아는 53%, 치은 1/3 부위에서 흡수를 보이는 치아는 27.3%로 치근단의 치근흡수 빈도가 큼이 보고되 었다[3]. 치주염 유발 쥐에서 파치세포의 수는 대조군과 비교하여 치근 근심과 이개면에서 증가하였으며 원심면 에서는 변화를 보이지 않아 파치세포 형성이 치근면에 따 라 차이가 있을 수 있음이 보고되었다[31]. 본 실험의 당 뇨동반치주염군의 TRAP 또는 cathepsin-K 양성 세포는 주 로 치근 중심 아래부위에서 관찰되었으며(결과 제시하지 않음) 이개면과 원심면에서 대조군 보다 증가하였다. 이 는 당뇨동반치주염인 경우에도 파치세포 형성이 치근면 의 위치에 따라 차이가 있음을 시사한다.

Gonçalves 등은 TNF-α 억제제인 infliximab를 5 mg/kg 농도로 치주염동물 모델에 투여하여 치조골 소실과 치은 조직의 TNF-α 수치가 감소함을 확인하였기에 본 연구에 서도 infliximab의 투여농도를 5 mg/kg로 선택하였다[32]. 흥미롭게도 억제제투여 당뇨치주염군에서 당뇨치주염군 보다 TRAP 양성 또는 cathepsin K 양성 세포의 수가 감소 하였다. 이전 연구의 당뇨치주염 동물모델에서 TNF-α 양 성 세포의 수가 대조군보다 증가하였으며[29], 당뇨치주 염군과 정상군에 LPS를 주입한 경우 당뇨치주염군의 혈 중 TNF-α 수치가 정상군보다 높았다[33]. 이들 결과는 당 뇨동반치주염에서 TNF-α가 증가하며, 증가한 TNF-α가 파 치세포 형성에 관여할 수 있음을 제시하는 것이다. TNF-α 를 생쥐에 투여한 경우 골수 기질세포의 stromal cellderived factor 1의 발현이 감소하였으며 혈액 내 파골세포 전구세포의 수가 증가하여, TNF-α가 골수의 파골세포 전 구세포의 혈관 내 이동에 관련될 수 있음이 제시되었다 [34]. 또한 세포배양법을 통해 사람 내피세포에 TNF-α를 처리하였을 때 부착분자인 ICAM-1과 CD44을 발현하며 이를 통해 CD14 양성 파골세포 전구세포의 이동이 유도 됨을 관찰하여, 혈관 내 파골세포 전구세포의 혈관 밖 이 동에 TNF-α의 관련성이 제시되었다[35]. TNF-α는 치주인 대세포와 조골세포의 RANKL 발현과 파골세포 전구세포 의 RANK 발현을 증가시켜 파골세포 형성을 촉진시킬 수 있음이 보고되었다[18,19,36,37]. 이는 TNF-α가 다양한 기 전을 통해 파골세포 형성을 증가시킬 수 있음을 나타내는 것이다. 당뇨동반치주염군에서 다핵의 파치세포 형성이 치주염 유발 3일째에 대조군에 비해 증가하나 20일째에 는 증가함이 사라지며, 다른 부위에 비하여 치근 이개부 위에서 많이 관찰되는 것은 당뇨와 치주염 유발 후 경과 시간 또는 치조골 위치에 따라 나타내는 TNF-α 발현의 차이와 관련성이 있을 수 있을 것으로 추정하며, 치조골 위치에 따른 TNF-α 발현의 차이가 TNF-α 억제제의 효과 차이로 연결될 수 있을 것으로 생각한다. 본 연구에서 TNF-α 억제제는 당뇨치주염군의 다핵 파치세포 수는 감 소시켰으나 단핵 파치세포의 수는 감소시키지 않았다. 이 러한 현상과 관련된 TNF-α의 작용 기전에 대한 연구가 앞으로 필요할 것으로 판단된다.

종합하여 볼 때 당뇨동반치주염 쥐에 TNF-α 억제제를 투여한 경우 TRAP 양성과 cathepsin K 양성 파치세포의 수가 감소하였고, cathepsin K 양성세포의 수 감소는 치근 이개 부위에서 나타났으며, 주로 다핵의 파치세포 수를 감소시켰다. 이들 결과는 TNF-α가 당뇨동반치주염에서 파치세포 형성을 증가시켜 치근 흡수에 관여할 수 있음을 시사한다.