서 론

치과에 내원하는 환자 중 많은 경우는 냉자극에 의해 야 기되는 치아의 냉각과민(dental cold hypersensitivity) 증상을 호소한다. 그러나 치아에서 무해한 냉감각 혹은 냉통증이 어떠한 기전에 의해 야기되고 전달되는지에 대해서는 아직 잘 밝혀져 있지 않다.

Transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8)는 비선택 적인 양이온채널(nonselective cation channel)인 TRP채널 superfamily의 일원으로서 26 ℃ 이하의 무해한 냉각 및 냉통 증에 의해 활성화된다[1-3]. 또한 이는 menthol, eucalyptol과 같은 수용성 menthol유도체와 icilin과 같은 합성화합물에 의해서도 활성화되며[4-6], 냉자극에 의한 급성통증, 염증 및 신경손상 시 야기되는 통각과민에도 중요한 역할을 한다 [2, 7, 8].

최근 Kim 등[9]은 TRPM8이 주로 민말이집 C신경섬유와 작은 말이집 Aδ신경섬유에서 발현되며, 특히 전통적인 민 말이집 C신경섬유의 분류인 펩티드성(peptidergic) 및 비펩 티드성 C신경섬유가 아닌 특별한 종류의 C신경섬유에서 발현됨을 보고하고 있다. 이는 TRPM8에 의해 매개되는 무 해한 냉각 및 냉통증이 특별한 형태(type)의 C신경섬유를 통해 전달될 것임을 시사한다. 또한 삼차신경절 및 치수에 서 TRPM8을 발현하는 신경세포와 신경섬유는 glutamate의 소포(vesicle) 내 저장 및 분비에 관여하는 vesicular glutamate transporter 2 (VGLUT2)를 발현하지만 VGLUT1은 발현하지 않는다[10]. 또한 치수의 염증 시 삼차신경절 세포에서 TRPM8의 발현은 증가하지 않지만, VGLUT2의 발현은 증 가한다고 보고되고 있다[10]. 이러한 연구는 치수의 염증 시 치수신경에 발현되는 TRPM8의 활성이 증가하기 보다는 TRPM8의 활성에 의한 VGLUT2의 활성이 증가할 것이며, 이로 인한 glutamate의 분비증가에 의해서 치수신경이 민감 (sensitization)하게 되어 치수의 냉각과민증이 야기될 것임 을 시사한다.

이와 같이 치수의 냉각, 냉통증, 그리고 병적인 상황에서 의 냉각과민에 대한 많은 연구가 있어 왔으나, 마우스 어금 니 및 앞니에서 TRPM8을 발현하는 신경섬유의 치수 내 분 포, 치아주위조직에서의 분포에 대한 연구는 크게 부족한 실정이다. 본 연구에서는 이들 다양한 부위의 냉각 그리고 냉통증에 대한 민감도와 직접적인 연관이 있을 것으로 생각 되는 TRPM8+ 신경섬유의 분포양식을 TRPM8^GFP마우스의 어금니 치수, 앞니 치수, 그리고 치아주위조직에서 면역조 직화학기법을 사용하여 분석하였다.

재료 및 방법

실험동물 및 조직처리

이 실험과 관련하여 실험동물의 보호 및 처치는 경북대학 교 동물실험윤리위원회에서 승인(KNU 2011-44)을 받아서 진행하였다.

본 실험에서는 TRPM8 유전자를 knock-out시키고, green fluorescent protein (GFP)를 knock-in 시킨 체중이 30-35g 사 이의 유전자변형 수컷 마우스 3마리를 사용하였다. 이 마우 스는 University of southern California의 McKemy 교수 그룹 에서 제공받았다. 실험동물을 sodium pentobarbitar (60 mg/kg, I.p.)을 사용하여 깊이 전신마취를 시키고 오름대동 맥을 통하여 10 ml의 헤파린을 함유한 생리식염수로 관류하 여 혈관 내 혈액을 제거한 후, 50 ml의 4% paraformaldehyde (PFA, in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4)를 사용하여 관류고 정을 하였다. 관류고정 후 앞니와 어금니 부위를 포함한 조 직을 분리하여 10% Ethylenediaminetetraacetic acid용액에 약 92시간동안 탈회를 시켰다. 탈회된 앞니와 어금니는 0.1 M 인산완충용액(phosphate buffer; PB)에 10분간 3회 세척한 후 동결 시 손상을 최소화하기 위해 30% sucrose 용액에 약 16시간 동안 처리한 후, 동결절편기를 이용하여 30 μm 두께 로 절편을 제작하고 형광면역조직화학법을 시행하였다.

형광면역조직화학법

형광면역염색 과정의 모든 반응은 실온에서 그리고 진탕 을 하면서 시행하였다. 본 실험에서 시행한 형광면역염색 과정을 간략히 기술하면 다음과 같다. 조직절편 내 항체의 침투를 용이하게 하기 위해 50% ethanol에 30분간 절편을 침적하였으며, 0.01 M phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) 으로 5분간 3회 세척한 후 10% normal donkey serum (NDS, Jackson ImmunoReserch, West Grove, PA)에서 30분간 반응 시켜 비특이적 반응을 최소화 하였다. 그 후 GFP 항체 (1:1000; Rabbit anti-GFP, Invitrogen Calsbad, CA)를 20시간 동안 처리하였으며, 0.01 M PBS로 치수 절편을 10분간 3회 세척한 다음, 2% NDS로 30분간 반응하였다. 이후 2차 항체 로서 형광물질이 결합된 항체(FITC-conjugated donkey antirabbit IgG antibody; 1:200, Jackson ImmunoResearch)를 3시간 반응시킨 후, 0.01 M PBS 그리고 증류수로 다시 10분간 3회 씩 세척한 다음 형광용 슬라이드 위에 절편을 올린 후 공초 점레이저주사현미경(LSM 510 META; Carl Zeiss, Gottingen, Germany)으로 관찰 및 분석을 실시하였다. 이들 현미경 영 상은 TIFF 확장자 파일로 저장하였으며, Adobe Photoshop 7.0 (Adobe System, San Jose, CA)을 이용하여 명도와 대비를 조정하였다.

본 연구에서 사용한 일차 및 이차항체의 특이성 검증을 위하여 일차 및 이차항체 대신 면역글로블린 G 혹은 PBS 용액을 사용하여 동일한 면역염색 과정을 수행하였으며 이 때 특이적 항원항체반응은 관찰되지 않았다.

결 과

본 연구에서는 TRPM8^GFP마우스의 앞니 및 어금니의 치 수와 치아주위조직에서 TRPM8 면역양성(+) 신경경섬유의 분포를 관찰하였다.

어금니의 치아뿌리치수(radicular pulp)에서 TRPM8+ 신 경섬유가 다수 관찰되었다. 관찰된 TRPM8+ 신경섬유들의 대부분은 실모양으로 나타났으며, 염주알 모양의 형태를 보 이는 것도 소수 관찰되었다. TRPM8+ 신경섬유들은 치아뿌 리치수에서는 거의 가지를 형성하지 않았으며, 치아머리속 질(coronal pulp)을 향하여 주행하였다(Fig. 1). 치아머리속질 에서 TRPM8+ 신경섬유는 여러 갈래의 가지를 광범위하게 형성하였다. 이들은 상아질모세포(odontoblast)에 인접한 치 아머리속질의 가쪽(peripheral pulp) 그리고 속질뿔(pulp horn coronal pulp)에서 밀도가 대단히 높았으며 이 부위에서는 대다수의 TRPM8+ 신경섬유가 염주알 모양을 보였다. 이들 중 일부는 상아질모세포층을 지나 상아질세관(dentinal tubule) 안으로 주행하였다(Fig. 2).

앞니의 치수에서는 TRPM8+ 신경섬유가 소수 관찰되었 으며 이들의 밀도는 치아뿌리치수와 치아머리속질 사이에 서 차이가 없었다. TRPM8+ 신경섬유는 어금니 치수와 동일 하게 실모양과 염주알 모양 두가지의 형태가 관찰되었다. 그러나, 어금니 치수에서와는 달리, 상아질모세포에 인접한 치아머리속질의 가쪽, 상아질모세포층 그리고 상아질세관 에서는 TRPM8+ 신경섬유가 거의 관찰되지 않았으며, 치아 머리속질의 중심부에서 TRPM8+ 신경섬유가 소수 관찰되 었다(Fig. 3).

어금니 및 앞니의 상아질(dentin)과 이틀뼈(alveolar bone) 사이의 치주인대(periodontal ligament)에서 그리고 치은 (gingiva)하방에서는 TRPM8+ 신경섬유가 간혹 관찰되었으 며, 이들의 밀도는 치수에 비해 현저히 낮았다. 치주인대부 위에서 TRPM8+ 신경섬유의 분포는 어금니부와 앞니부의 치주인대 간 차이가 없었다(Fig. 4).

고 찰

본 연구를 통해 밝힌 주된 발견은 다음과 같다. 1) TRPM8 면역양성(+) 신경섬유는 마우스 어금니의 치아머 리속질의 주변부, 속질뿔에서 밀집되어 분포하였으며, 일 부는 상아질모세포사이를 지나 상아질세관내로 주행하였 다. 2) 이에 비해 앞니의 치수에서는 TRPM8+ 신경섬유가 소수 관찰되었다. 3) 치아주위조직 즉, 치주인대, 치은상피 하부의 결합조직에서는 TRPM8+ 신경섬유가 대단히 드물 게 관찰되었다. 이러한 소견은 TRPM8에 의해 매개되는 냉각의 감수성은 어금니 치수 부위사이, 어금니 치수와 앞 니 치수사이, 치수와 치아주위조직 사이에서 각기 다를 것 이라는 것을 시사한다.

TRPM8는 2001년 전립샘 암세포에서 처음 발견된[11] 이 후, 이에 대해 많은 연구가 진행되고 있다. 감각신경세포에 서 발현되는 TRPM8은 섭씨 26℃ 이하의 무해냉각(innocuous cool)과 유해냉각(noxious cold)을 감지한다[1, 2]. TRPM8-/- 마우스에 Complete Freund's Adjuvant를 주입하여 염증성 통 증 혹은 신경손상을 유도한 신경병성 통증 모델을 이용한 많은 연구들을 통하여 TRPM8는 염증 혹은 신경손상 시 야 기되는 통각과민(pain hypersensitivity)에 중요한 역할을 한 다고 알려져 왔다[7, 12, 13]. Kim 등[10]은 TRPM8이 C신경 섬유, Aδ신경섬유에서 발현되며, Aβ신경섬유에서는 발현 되지 않는다고 보고하여 TRPM8에 의해 매개되는 냉각은 C와 Aδ신경섬유에 의해 전달될 것이라고 시사하였다. 또 한, 삼차신경절에서 TRPM8+ 신경세포의 28%는 펩티드성 신경세포이며, 약 1.3%는 비펩티드성 신경세포이라는 것을 보고하였다. 이러한 보고들과 TRPM8+ 신경섬유의 76.3% 가 C신경섬유라는 것[10]을 함께 감안하면 대다수의 C신경 섬유를 가지는 TRPM8+ 신경세포는 기존의 펩티드성, 비펩 티드성 신경세포의 분류에 속하지 않으며, 특별한 종류의 C신경세포라는 것을 의미한다. 이는 TRPM8 매개에 의한 냉각정보는 다수의 특별한 종류의 C신경섬유에 의해 전달 될 것이라는 것을 시사한다. 한편으로 치수를 지배하는 대 다수의 신경섬유는 Aδ신경섬유이며, 이들은 주로 치수의 주변부로 투사한다는 것[14]을 감안하면, 치아머리속질 주 변부에서 TRPM8+ 신경섬유는 C신경섬유 보다는 Aδ신경 섬유일 것으로 생각된다.

본 연구에서 TRPM8+ 신경섬유의 분포는 어금니 치수내 의 부위에 따라 달랐다. 치아뿌리치수에서는 소수의 TRPM8+ 신경섬유가 가지를 내지 않고 주행하였으나 치아 머리속질의 주변부 및 속질뿔에서는 TRPM8+ 신경섬유가 수많은 가지를 내었으며 이들의 밀도가 대단히 높았다. 또 한 이들 중 일부는 상아질모세포 사이를 지나 상아질세관내 로 주행하였다. 이는 상아질 노출 시 야기되는 냉각에 의한 통각과민(cold hypersensitivity)을 설명할 수 있는 중요한 관 찰로 생각되며, TRPM8에 의해 매개되는 냉각, 냉통증, 그리 고 통각과민은 주로 치수의 가쪽에서 야기되며 치아뿌리치 수에서는 치아머리속질 보다는 TRPM8에 의한 냉각 혹은 통증에 대한 감수성이 낮을 것이라 예측된다. 상아질과민증 (dentin hypersensitivity)을 설명하는 여러 이론 중 최근에 많 이 받아들여지는 가설은 상아질이 자극을 받으면 상아질세 관 내 액체의 이동이 일어나고, 이것이 치수내의 자유신경 종말에 의해 감지된다는 유체역학 이론(hydrodynamic theory)이다. TRPM8을 발현하는 신경섬유가 치수주변 부위 에서 밀집된 분포, 일부 TRPM8을 발현하는 신경섬유의 상 아질세관 내 주행을 보여주는 본 연구 결과는, 냉각에 의한 통각과민은 유체역학설 뿐 아니라 상아질세관내에 분포하 는 신경섬유에서 발현되는 TRPM8의 직접적인 활성화에 의 해 야기될 것이라는 것을 시사한다.

설치류의 앞니 치수에서는 혈관과 연계되어 혈관의 수 축에 관여하는 교감신경이 많이 분포하고 있다. 또한, 감 각신경은 어금니보다 훨씬 적게 분포하며, 이들은 대부분 이 민말이집 C신경섬유이고, 치수주변부에서 얼기(plexus) 를 형성하지 않으며, 상아질내로 투사하지 않는 특징을 보 인다[15]. 본 연구에서, 어금니 치수에서는 TRPM8+ 신경 섬유가 치수의 주변부에서 대단히 많이 관찰되는데 비해 앞니 치수에서는 소수의 TRPM8+ 섬유가 관찰됨으로써 설치류의 앞니 치수에서의 감각신경의 분포특징과 일치하 였으며, 이는 냉각 혹은 냉통증에 대한 민감도에 있어서 마우스 어금니 및 앞니 사이에 큰 차이가 있을 것임을 시 사한다.

치주인대 그리고 치은하부의 고유조직에서 TRPM8+ 신 경섬유가 간혹 관찰되었으며, 치은상피에서는 관찰되지 않았는데, 이는 glabrous skin에서 TRPM8+ 신경섬유가 상 피내로는 주행하지 않고, 상피아래의 고유조직에 국한되 어 분포한다는 연구결과[16]와 유사하였다. 또한 치주인대 에는 고유감각을 전달하는 신경섬유 및 통증을 전달하는 신경섬유가 많이 분포한다는 연구결과와 비교되었다 [17-22]. 치주인대 및 인접 고유조직에서 소수의 TRPM8+ 신경섬유의 분포는 이들 조직에서 냉감각, 냉동통에 대한 민감성이 치수에 비해 훨씬 낮을 것이라는 형태학적인 증 거로 생각된다.

본 연구에서 TRPM8+ 반응은 선모양 혹은 가는 선으로 연결된 팽창된 염주알 모양으로 관찰되었다. 선에서 관찰 되는 TRPM8+ 반응은 주로 말초부위로 이동중인 TRPM8 으로 생각되며, TRPM8이 주로 염주알 모양 부위에서 강 하게 반응하는 것으로 보아 냉각에 의한 TRPM8의 활성화 는 주로 이 부위에서 일어날 것으로 생각된다. 이전의 연 구에서 신경의 염주알 모양 부위에서 신경소포내로 glutamate의 이동에 관여하며, glutamate의 분비에 중요한 역할을 하는 vesicular glutamate transporter[23, 24]의 면역 반응이 강하게 나타난다고 보고하였다[9, 25, 26]. 이를 감 안하면, 염주알 모양 부위에서 냉각에 의해 TRPM8이 활 성화되면 이 부위에서 vesicular glutamate transporter에 의 해 glutamate가 분비되며, 이는 인접 신경섬유에서 발현되 는 glutamate 수용체를 활성화시킴으로써[27, 28], 통각과 민화 반응에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.