서 론

치주염은 구강 내 치주병인균의 독소에 의해 나타나 게 되는데 염증이 진행되는 동안 여러 염증인자 및 면 역반응인자들이 조직 내 쌓이게 되고 결과적으로 지지 조직 파괴와 치아상실을 야기한다[1-3]. 치주인대섬유모 세포인 Periodontal ligament (PDL)세포는 치아와 치조골 을 연결하는 조직에 많이 존재하며 치주인대와 백악질, 치조골의 생산과 유지, 개조 등의 기능을 하는 세포로써 치조골과 치아를 연결하는 치주인대의 형성과 유지에 중요한 역할을 한다[4]. 치주염이 발생하면 Interleukin 1 beta (IL-1β), Tumor necrosis factor alpha (TNF-α), IL-12, IL-23, IL-32와 같은 일차면역 반응과 염증반응을 활성 화 시키는 염증성 전구 cytokine이 증가하고, 호중구의 화학주성 역할을 하는 Chemokine (C-X-C motif) ligand 8 (CXCL8)이 증가한다[5-8]. 그리고 기질분해효소인 Matrix metalloproteinase 1 (MMP1), MMP3, MMP8, MMP11 등이 증가하는데 이는 세포외기질(Extracellular metrix, ECM)의 리모델링과 분해, turnover에 중요한 역할을 한다[9]. 또한 염 증이 유발되었을 때 염증매개 역할을 하는 Cyclooxygenase 2 (COX2 또는 PTGS2) 등의 인자들도 증가한다[10]. 이러 한 치주의 염증 진행과정에서 다양한 염증매개 유전자들 의 작용 억제는 치주염의 진행을 막을 수 있고 결과적으 로 치주염의 치료 및 예방에 적용할 수 있을 것이다.

Transglutaminase (TGM)는 혈관생성, 세포사멸, 분화, 부착, 세포외 기질의 변화에 영향을 주며 세포의 안정화 와 기질 단백질의 중합에 중요한 기능을 하는 칼슘-의 존적 효소이다[11]. 세포 내 칼슘농도는 일반적인 상황 에서는 낮게 유지되나 염증과 같은 특별한 상황에서는 높게 유지되는데, 이때 TGM이 작용하게 된다. TGM은 지혈과정에서 섬유소 응고 안정화와 정액 응고, 각질화 에서 각화된 외피 형성 및 세포외기질의 안정화에 중요 한 역할을 한다. 구조적 역할을 수행하는 것 외에도 세 포기질과 상호작용 할 뿐만 아니라 성장인자, IL-2와 같 은 신호 분자의 생물학적 활성을 조절함으로써 세포에 중대한 영향을 미치는 것으로 나타났다[12,13]. 또한 TGM은 세포외기질의 안정화와 세포부착과 관련된 단백 질의 가교역할에 의해서 세포의 모양을 결정하는데 기 여하는 것으로 알려져 있다[14]. 현재까지 9종류의 TGM 이 알려져 있는데 Fibrin stabilizing factor로도 알려진 Factor XIII은 혈액 응고와 상처치유에서 기능을 하고, Band 4.2는 Erythrocyte에서 구조적인 단백질의 기능을 한다. TGM1, 3은 표면 상피조직에서 각화된 외피 형성 에 작용한다고 알려져 있고, TGM4는 정액응고와 관련 된 역할을 하며, TGM5는 상피분화에 영향을 주는 것으 로 보고되었다. 그리고 TGM6, 7은 아직 기능적인 역할 이 밝혀지지 않았다[15].

Tissue transglutaminase라고도 알려진 TGM2는 세포 부 착, 세포외기질의 변경, 세포예정사, 상처치유, 종양성장, 뼈광화 과정에 영향을 미친다[16]. 최근 연구들에서 TGM2 는 임플란트 주변의 치은 성장에 영향을 준다는 보고가 있 다[17]. 또한 PDL 세포에서 TGM2 발현의 증가는 Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL)/ Osteoprotegerin (OPG) 경로와 관련이 있다는 보고가 있다 [18]. 하지만 PDL 세포에서 염증이 유발되었을 때 TGM2 의 역할에 대한 연구는 아직 미미하다.

본 연구에서는 PDL 세포에 pro-inflammatory cytokine인 IL-1β 및 TNF-α를 이용하여 염증반응을 유도하고 PDL 세 포에서 생성되는 염증매개인자들의 발현과 TGM2의 연관 성 및 조절 효과를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

Periodontal ligament (PDL) 세포의 배양 및 처리

실험에 사용된 PDL 세포는 전남대학교 치과병원에 내 원한 환자 중 치주질환이 없는 건강한 환자(5명)와 치주염 을 앓고 있는 환자(5명)의 동의를 얻은 후 발치된 치아 샘 플에서 얻었다. 본 연구는 전남대학교 치과병원의 기관감 사위원회로부터 승인받았다. 발치된 치아의 치근 중간 부 위에 붙어 있는 PDL 조직을 채취하여 3 mg/ml의 Type Ⅰ collagenase (Roche)와 2.4 U의 dispaseⅡ (Roche, Mannheim, Germany)를 처리하여 세포를 분리하였다. 분리된 PDL 세 포는 10% Fetal bovine serum과 1% Penicillin/Streptomycine 이 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco) 배지에서 배양하였고 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 PBS (phosphate buffered saline)로 씻어준 후 trypsin-EDTA를 넣어 세포를 떼어내어 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에 부유시킨 다음 100mm dish에 옮겨 CO₂배 양기 (37℃)에서 배양하여 passage 6-10 사이의 세포를 실 험에 이용하였다. 배양된 세포에 IL-1β (Genscript) 및 TNF α (Millipore)를 24시간 처리하여 염증반응을 유도하였고, TGM2 과발현 실험을 위해 pcDNA3.0 (Invitrogen)에 human TGM2를 cloning한 vector를 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 을 이용하여 transfection한 뒤 36시간 배양하였다. TGM2 발현 저해에 따른 유전자의 활성을 관찰하기 위해 TNFα 가 처리된 세포에 TGM2 inhibitor인 LDN27219 (Tocris Bioscience)를 처리하여 24시간동안 배양하였다.

RNA isolation, Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 및 quantitative real time- PCR (qRT-PCR)

치근으로부터 채취된 PDL 조직을 실험 직전까지 액체 질소를 이용하여 동결시켜두었고 막자사발을 이용하여 조직을 잘 갈아주어 TRI reagent를 이용하여 total RNA를 추출하였고 또한 배양된 PDL 세포도 TRI reagent를 이용 하여 total RNA를 분리하였다. 조직 및 세포에서 분리한 1 ㎍의 RNA를 주형으로 cDNA를 합성한 뒤, RT-PCR을 수 행하여 유전자 발현을 확인하였고 각 cDNA 샘플은 duplication하여 qRT-PCR을 통해 정량화하였다. 본 실험에 사용된 primer 정보는 Table 1과 같다.

면역형광염색 (Immunofluorescence)

PDL 세포 내 단백질 발현을 관찰하기 위해 면역형광염 색법을 이용하였다. Glass coverslips 위에 세포를 배양한 뒤 3.5% Paraformaldehyde (PFA)를 이용하여 세포를 고정하였 고 PBS를 이용하여 세척하였다. 0.1% Triton X-100을 10분 간 처리한 뒤 PBS로 용해된 1% Bovine serum albumin으로 1시간 동안 반응시켰다. 1차 항체와 1시간 반응 시키고 alexa-488이나 alexa-594가 표지 된 2차 항체 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 1시간 반응하였고 DAPI를 이용하여 핵을 염색한 뒤 형광현미경(Carl Zeiss, Cambridge, CA, USA)을 이용하여 이미지를 관찰하였다.

자료 분석 및 통계처리

모든 실험 결과는 mean ± SEM으로 나타내었고 대조 군과 각 실험군의 평균 차이는 Student’s t-test로 분석한 뒤 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단 하였다.

결 과

염증이 유발된 치주조직에서 TGM2의 발현 양상

염증성 환경에서 치주세포 내 TGM2의 유전자 발현 양상을 알아보기 위해 치주염을 앓고 있는 환자의 치주 조직과 건강한 치주조직에서 RNA를 추출하여 비교하였 다. 그 결과 잘 알려진 대로 기질분해효소 MMP1, MMP3, 염증성 cytokine IL-6, chemokine CXCL8, 그리고 대표적인 염증성 인자 PTGS2의 유전자 발현이 건강한 치주조직보 다 증가함을 RT-PCR로 확인하였고 qRT-PCR을 통해 정 량화 하였다. 이렇게 검증된 조직에서 TGM2의 발현도 5 배 이상 증가되어 있음을 확인하였다(Fig. 1A, 1B). TGM2 와 치주염의 직접적 연관성이 확인된 바, 세포 수준의 검 증을 위해 PDL세포를 대표적인 염증성 cytokine인 IL-1β (0, 1, 2.5, 5 ng/ml)와 TNF-α (0, 25, 50, 100 ng/ml)로 각각 처리하고 24시간 배양하여 확인해 본 결과 환자 조직과 마 찬가지로 MMP1, MMP3, IL-6, CXCL8, PTGS2의 발현이 IL-1β 및 TNF-α의 농도 의존적으로 증가하였고 TGM2의 발현도 증가됨을 확인하였다(Fig. 2A, 2C). 각 유전자의 양적인 발현차이를 비교하고자 qRT-PCR을 수행한 결과 역시 IL-1β 및 TNF-α를 처리한 모든 농도에서 유전자들 의 발현이 무처리 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하 게 증가함을 확인하였다(Fig. 2B, 2D). 단백질 수준에서 확인하기 위해 PDL세포에 IL-1β (5 ng/ml), TNF-α(100 ng/ml)를 처리하여 24시간 배양한 후, TGM2의 단백질 발 현을 면역형광염색법으로 확인하였다. 그 결과 염증성 환 경을 유도한 PDL 세포의 세포질에서 염증성 cytokine인 IL-6의 발현이 증가하였고 동일 위치에서 TGM2 발현의 증가가 관찰되었다(Fig 2E). 결론적으로 치주염환자의 염 증이 유발된 치주조직 및 염증성 환경이 유도된 PDL 세 포에서 TGM2의 발현이 증가함을 통해 TGM2가 염증과 정을 조절할 가능성을 유추할 수 있었다.

TGM2가 과발현된 PDL세포에서 염증매개인자들의 발현 변화

염증이 유도된 치주조직 및 PDL세포에서 TGM2가 증 가하는 것으로 관찰되었기 때문에 PDL세포 내 TGM2의 과발현이 염증성 인자들의 발현에 영향을 미치는지 알아 보고자 하였다. TGM2 유전자(1, 2 μg)를 PDL 세포 내로 transfection하여 36시간 배양 후 유전자들의 발현 양상을 확인한 결과 MMP1, MMP3, IL-6, CXCL8, PTGS2의 발현 이 대조군과 비교하여 증가됨을 RT-PCR을 통해 확인했 다(Fig. 3A). 그리고 염증성매개 인자들의 발현을 정량적으 로 확인한 결과 empty vector 대조군과 비교하여 TGM2가 과발현 된 PDL 세포에서 발현이 유의적으로 증가됨을 확인 할 수 있었다(Fig. 3B). 면역형광염색을 통해 단백질 발현양 상을 확인한 결과 TGM2를 과발현한 PDL 세포의 세포질에 서 TGM2 단백질 발현이 증가하였고 동일한 위치에서 IL-6 의 단백질 발현이 증가하였다(Fig. 3C). 이러한 결과는 TGM2가 염증이 유발된 치주조직에서 조직손상을 심화시 키는 염증매개인자들 조절에 중요한 역할을 함을 보여준다.

TGM2의 기능억제 시 PDL세포 내 염증매개인자들의 발현 변화

PDL세포에서 염증인자들의 조절에 대한 TGM2의 역할 을 좀 더 검증하기 위해 TGM2의 활성을 억제하였을 때 염증매개인자들의 발현양상을 살펴보았다. PDL세포에 TNF-α (100 ng/ml)와 TGM2 inhibitor인 LDN27219 (200 μ M)을 동시 처리하여 유전자의 발현 변화를 확인하였다. LDN27219는 가역적으로 TGM2의 GTPase site에 결합함 으로써 TGM2의 기능을 억제한다. PTGS2를 제외하고 TNF-α 처리에 의해 증가되었던 MMP1, MMP3, IL-6, CXCL8의 발현이 LDN27219를 함께 처리했을 때 감소함 을 RT-PCR 및 qRT-PCR을 통해 확인하였다(Fig. 4A, 4B). 이는 염증성 환경에서 TGM2의 활성 억제를 통해 염증매 개인자들의 발현을 조절할 수 있음을 시사한다.

고 찰

치주염이 진행되어 염증상황에 놓이면 대표적인 면역 세포인 호중구, 대식세포, 비만세포 등에서 cytokine들과 같은 염증성인자들이 분비되어 염증환경을 심화시킨다 [19, 20]. 치주를 둘러싸고 있는 PDL세포 역시 cytokine 및 chemokine의 생성을 촉진시켜 치주조직의 염증 반응에 깊 게 관여하기 때문에 PDL세포에서 생성되는 염증성인자 의 조절은 치주염 치료에 중요한 부분으로 다룰 수 있다 [21]. TGM2는 혈관생성, 세포사멸, 분화, 부착, 세포 외 기질의 변화에 영향을 미치며 세포의 안정화와 기질 단백 질의 중합에 중요한 기능을 하는 효소이다. 치주조직과 TGM2와 관련된 연구들에서 다양한 형태의 TGM이 사람 의 치은조직(gingival tissue)에서 발현이 나타나는데 Factor XIII은 건강한 조직이나 손상된 조직에서 유사하게 발현 되며 TGM2는 만성 치주염에서 약간 증가함을 보이고 TGM1과 TGM3은 현저히 감소한다는 보고가 있다[19]. 그 리고 임플란트 시술 후 세포외기질에서 TGM2가 증가되 어 나타나는데, 이것은 임플란트 주변의 치은 성장의 발 달에 유의한 영향을 준다고 한다[21].

본 연구에서는 국소적인 요인에 의한 치주염에 초점을 맞추어서 염증성 자극에 따라 TGM2가 염증매개인자들의 발현에 어떤 영향을 미치는지 그 상관관계를 규명하고자 하였다. 그 결과 치주염을 앓고 있는 환자의 치주조직에 서 TGM2의 발현이 증가하였고 in vitro 실험에서도 PDL 세포가 염증성 환경에 놓이자 TGM2의 발현이 증가하였 다. 이는 TGM2의 상향조절이 RANKL/OPG 경로와 관계 가 있다는 연구에서 만성 치주염 환자의 치주조직에서 TGM2의 발현이 증가되었다는 결과와 동일하게 나타났다 [18]. TGM2가 직접적으로 염증매개인자들의 발현을 조절 하는지 알아보기 위해 TGM2의 발현 및 활성을 조절하였 더니 TGM2가 과발현 되었을 때는 염증매개인자들의 발 현이 함께 증가되었으며 TGM2 inhibitor인 LDN27219를 처리하여 활성을 억제하자 염증성 환경에 의해 증가되었 던 IL-6, CXCL8, MMP1, MMP3의 염증매개인자들의 부분 적인 발현 감소를 확인하였다. 이는 TNFα에 의해 여러 catabolic factor들이 작용하여 염증매개인자들을 조절하는 데 그 중 하나로 TGM2가 역할을 하는 것으로 사료되며 그로인해 TNFα에 의해 증가된 염증매개인자들의 발현이 LDN27219의 처리로 부분적 발현 감소가 나타난다고 유 추해 볼 수 있으며 LDN27219에 의해 오히려 증가된 PTGS2의 발현은 TNFα에 의한 PTGS2의 발현 증가에 TGM2가 역할을 하지 않는 것으로 볼 수 있다. PTGS2를 제외한 다른 인자들의 결과들을 통해 TGM2가 치주조직 의 염증매개인자들의 조절을 통해 염증 반응에 깊게 관여 하고 있음을 유추해 볼 수 있다.

실제 치주염은 구강 내 세균에 의해 촉발되는 염증이 므로[22] Porphyromonas gingivalis와 Escherichia coli의 Lipopolysaccharide (LPS)를 처리하여 염증성 환경을 재현 하였을 때 TGM2의 발현이 증가되는지 추가적으로 확인 해볼 필요성이 있으며 또한 구강 내 염증 발생 시 PDL세 포 외에 백악질, 치은결합조직, 치조골 등도 영향을 받는 데 근접한 다른 조직의 염증에도 어떤 영향을 미치는지에 대한 후속 연구도 뒷받침 되어야할 것이다.

현재 치주염 치료는 스케일링이나 치근활택술 같은 비 외과적 방법과 치은절제술 같은 외과적 방법에 의해서 행 해진다. 하지만 치주염이 많이 진행되어 다량의 골소실이 나타날 때 파괴된 치주조직은 재생능력에 한계가 있기 때 문에 치료 후에도 발병 전 상태로 원상복귀가 불가능하 다. 그러므로 건강한 골조직이 많이 남아있는 상태에서 치료해야 예후가 좋다. TGM2가 초기 염증 반응에서 표적 치료법으로 사용될 시 이러한 일반적인 치주염 치료의 한 계를 극복하는데 중요한 의미를 갖는다고 볼 수 있다. 본 연구에서는 TGM2가 IL-6, CXCL8, MMP1, MMP3과 같은 염증매개인자들을 조절함을 확인함으로써 치주염과의 연 관성을 실험적으로 확인하였으며 이를 통해 향후 치주염 치료에 중요한 조절인자로서의 가능성을 보았다.