서 론

구강암은 인체에 발생하는 전체 암종의 3~5%로 매우 적은 비중을 차지하나 눈에 보이는 범위이상으로 공격적 인 침범, 경부 림프절의 전이 등 악성도가 높아 5년 생 존율이 약 50%로 매우 치명적인 질병이다[1,2]. 구강암은 입술, 혀, 치주, 하인두 등 얼굴과 목의 거의 모든 부위 에 발병되는 암을 통칭하며, 90% 이상이 구강 편평세포 암종(oral squamous cell carcinoma)이다[3]. 주로 음주, 흡 연, 식습관, 그리고 인간유두종바이러스(human papilloma virus, HPV)가 그 위험인자로 알려져 있으며, 인도 스리 랑카, 타이완과 같은 씹는 담배를 많이 사용하는 지역에 서 높은 빈도로 발생한다[4,5]. 가장 광범위하게 사용되 고 있는 치료 방법은 항암제와 병행하는 수술이나 방사 선 치료이지만 항암제 병행은 소화기계 합병증, 면역력 저하, 골수 기능 저하, 약물내성 등의 심각한 부작용을 일으킨다[6]. 따라서 최근에는 기존의 합성 항암제를 대 체하기 위한 일환으로 생체 독성이나 부작용이 적을 것 으로 생각되는 식품, 천연식물 등에서 항암효과를 나타 내는 유효성분을 분리⋅정제하고, 항암기전을 밝히는 연 구들이 활발히 진행되고 있다[6]. 그 예로, Taxus brevifolia L.에서 분리 추출된 paclitaxel(Taxol®), Catharanthus roseus G. Don에서 분리 추출된 vincristine(Oncovin®)과 Podophyllum peltatum L.로부터 분리 추출된 podophyllotoxin 등이 있지 만[7], 아직까지 효능 및 약리작용과 그 기전이 알려지지 않은 천연물이 많은 것으로 확인되고 있다.

본 연구에서 사용된 청각(Codium fragile)은 청각과에 속하는 녹조류로 동아시아, 오세아니아 등 해안에 넓게 분포해 있으며, 우리나라에서는 김치의 속재료 또는 일부 지역에서는 나물 등의 음식 재료로 사용되고 있다[8]. 또, 예로부터 청각은 pinworm에 의한 감염, 배변장애, 수종 등을 치료하기 위해 전통의학 치료제로 사용되어져 왔으 며, 청각의 메탄올 추출물이 항염증, 항산화, 그리고 항암 효능을 가지고 있다고 보고되어 있다[8-11]. Dilshara과 그 의 연구팀은 유방암 세포인 MDA-MB-231에서 청각 메탄 올 추출물이 NF-kB의 활성을 억제함으로써 MMP9의 발 현이 억제되어 암세포의 침입(invasion) 성질이 억제된다 고 하였으며, Kim과 그의 연구팀은 청각 추출물에서 유 래된 clerosterol이 사람 흑생종 세포인 A2058 세포에서 세 포독성을 유도한다고 보고하였다[11,12]. 또, 청각 열수추 출물은 mouse 대장암 세포인 CT26에서 강력한 세포독성 활성을 나타낸다는 것을 보고하였다[13]. 그러나 청각 메 탄올 추출물의 구강암에 대한 항암활성 연구는 전무한 상 태이며, 그 기전 역시 보고된 바가 없다.

본 연구에서는 청각 메탄올 추출물이 구강암 세포에 서 세포 성장 억제 효과 및 그 억제 기전을 밝히고자 하며, 이를 통해 구강암 치료를 위한 천연물 신약 개발 등과 같은 임상적 응용을 위한 기초를 제공하고자 한다.

재료 및 방법

1 실험재료

청각(Codium fragile)은 전라남도 완도에서 채취한 청각을 구입하였으며, 3-(4,5–Dimethylthiazol 2-yl)-2,5- diphenyltertrazolium bromide(MTT)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Minimum Essential Media (MEM), Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640과 Penicillin-streptomycin은 Welgene(Gyeonggi-do, Korea) 에서 구입하였으며, Fetal bovine serum(FBS)는 Corning (Corning, NY, USA)에서 구입하여 사용하였다. Live & Dead Viability/Cytotoxicity kit는 Molecular probes(Eugene, OR, USA)에서 구입하였으며, 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)는 Vector Laboratories(Burlingame, CA, USA)에서 구입하였고, Propidium Iodide(PI)는 BD Biosciences(San Jose, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 1차 항체인 Cleaved caspase-9, -3 및 -7, PARP, Bcl-2, Bax, p21, CDK4, p-Rb와 Tubulin은 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

2 청각(Codium fragile) 메탄올 추출물 제조 방법

구입한 청각 100g을 1L의 메탄올에서 24시간 동안 추 출하고 거름종이를 이용하여 추출액을 거른 뒤 감압 농 축하였다. 이를 동결건조 하여 분말로 만든 후 DMSO에 500mg/mL로 녹여 filtering한 후 -20℃에 보관하였으며 실험에 사용할 때는 여러 가지 농도로 세포배양액에 희 석하여 사용하였다.

3 세포 배양

실험에 사용된 사람 유래 구강암 편평암세포주인 YD-38 (KCLB No, 60508)과 FaDu(ATCC No, CCL17)는 각각 RPMI 1640과 MEM에 10% fetal bovine serum(FBS) 및 penicillin (100 units/ml), streptomycin(100 units/ml)이 첨가된 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃incubator에서 배양하였다.

4 세포 증식 효과 검증

청각(Codium fragile) 메탄올추출물에 대한 YD-38 세 포와 FaDu 세포의 증식억제 효과는 MTT assay를 통해 분석하였다. 12-well cell culture plate에 2×105 cells/well세 포를 seeding하고, 24시간 후 대조군에는 DMSO(2㎕/mL) 를, 실험군에는 추출물을 다양한 농도(0.125, 0.25, 0.5, 1mg/mL)로 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 반응 후 배양액을 제거하고 인산 완충 용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 가볍게 세정한 다음, MTT solution (5mg/mL)을 1:10으로 배양액에 첨가하여 37℃의 5% CO2배양기에서 추가적으로 4시간동안 반응하였다. 4시 간 후 배양액을 제거하고 살아있는 세포에 의해 형성된 formazan 염을 DMSO 1mL을 첨가하여 교반기에서 완전 히 용해시키고 Epoch Bioteck ELISA reader(Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 590 ㎚ 흡광도에서 세포 생존율을 측정하였다. 결과 분석은 시 료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도를 생존율 100%로 하고 시료를 처리한 실험군의 흡광도를 대조군에 비교 하여 백분율(%)로 표시하였다.

5 Live & Dead assay

Live & Dead Viability/Cytotoxicity kit(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)는 살아있는 세포와 죽은 세포를 형광 염색하여 세포 생존 여부를 분석하는 실험으로 live-dye 인 Calcein-AM은 살아있는 세포의 esterase에 의해 분해 되어 녹색 형광을 나타내며, dead-dye인 Ethd-1(Ethidium bromide homodimer-1)는 plasma membrane이 손상된 죽은 세포에 침투하여 핵산에 결합하면서 붉은 형광을 나타 낸다. 4-well chamber slide의 각 well에 1×105cells/mL 세 포를 seeding하고 24시간 배양 후 0.125, 0.25와 0.5 mg/mL의 추출물을 각각 처리하여 24시간 동안 반응하 였다. 반응 후 배양액을 제거하고 PBS로 가볍게 세정한 다음, PBS에 Calcein-AM과 Ethd-1의 1:1 혼합하여 각 well에 500㎕씩 첨가하였다. 호일로 감싸 차광한 후 3 7℃ incubator에서 20분간 반응시킨 뒤, 염색약을 제거하 고 mounting하여 형광현미경(Eclipse TE2000; Nikon Instruments, Melville, NY, USA)을 이용하여 살아있는 세 포와 죽은 세포를 관찰하였다.

6 DAPI stain

DAPI stain은 DAPI 분자가 DNA에 결합하여 cyan색의 형 광을 나타내는 것으로, 핵의 응축과 염색질의 분절화를 확 인할 수 있다. 4-well chamber slide의 각 well에 1×105cells/mL 세포를 seeding하고 24시간 배양 후 0.125, 0.25와 0.5mg/mL 의 추출물을 각각 처리하여 24시간 동안 반응하였다. PBS로 가볍게 세정한 다음 4% paraformaldehyde(PFA)에 5분간 고 정하고 DAPI(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 첨가하여 10분간 염색한 뒤, cover glass를 덮어 형광현미경 (Eclipse TE2000; Nikon Instruments, Melville, NY, USA) 하에 서 핵의 응축과 염색질의 분절화를 관찰하였다(100x). 염색 질이 조각나 있거나 막 투과성이 비정상적으로 증가되어 염색된 핵이 밝게 빛났을 때 세포사멸이 일어난 세포로 판 단하였다. 막대그래프는 각 4분기로 나누어 정상세포와 세 포사멸이 일어난 세포를 counting하여 사멸된 세포를 백분 율(%) 나타내었다.

7 단백질 면역 발색법

세포사멸에 관련된 단백질 발현을 확인하기 위해 FaDu 세포를 6-well cell culture plate에 seeding하고, 24시간 배양 후 0.125, 0.25와 0.5mg/mL의 추출물을 각각 처리하여 24시 간 동안 반응하였다. 반응 후 PBS로 두 번 세정하고, protein lysis buffer(iNtron, Sungnam, Korea)를 이용하여 단백질 분리 한 후 BCA Protein Assay Kit(Pierce, Rockgord, IL, USA)을 이용하여 단백질을 정량하였다. 20ug/lane 단백질을 12%와 15% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에서 분리한 후 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane에 옮겼다. Membrane은 5% blocking solution(5% Bovine Serum Albumin in TBS containing 0.1% Tween-20)에 서 30분 동안 blocking하고, 일차항체인 cleaved caspase-9, cleaved caspase-3, cleaved caspase-7, cleaved PARP, Bcl-2, Bax, Tubulin을 TBS-T에 1:1000으로 희석하여 4 ℃ 조건하에 서 overnight 반응 하였다. 그 후, TBS-T로 세척 후 이차항체 인 anti-rabbit IgG과 anti-mouse IgG를 1:5000으로 희석하여 실온에서 1시간 반응 한 다음 TBS-T로 15분씩 세 번 세척하 였다. 결과 분석은 ECL kit(Millpore, Bedford, MA)을 이용하 여 MicroChemi 4.2(DNR Bio-Imaging Systems Ltd, Jerusalem, Israel)를 통해 protein band를 가시화하였다. 각 밴드는 Image J를 이용하여 그래프화 하였다.

8 실험자료의 통계학적 검정

모든 실험성적은 Mean±SD으로 나타내었고, 각 실험 군 간의 유의성 검정은 Graphpad prism 5.0을 이용하여 tukey t-test를 하였으며, p value가 0.05 미만(p<0.05)의 경우에서 통계적 유의성이 있는 것을 간주하였다.

결 과

1 청각(Codium fragile) 메탄올추출물에 의한 사람 유래 구강암 편평암세포 YD-38과 FaDu의 성장 억제 효과

청각 메탄올추출물이 구강암세포주인 YD-38과 FaDu 의 세포성장에 미치는 영향을 알아보기 위해 청각 메탄 올추출물을 0.125, 0.25, 0.5, 1mg/mL의 다양한 농도로 24시간 동안 처리하여 MTT assay를 수행하였다. 대조군 (DMSO)은 아무것도 처리하지 않은 control과 비교하였 을 때 세포 성장에 영향을 주지 않았으므로 실험군은 대조군과 비교하여 분석하였다. 그 결과, 0.25mg/mL에서 YD-38세포는 세포 성장에 영향은 없었으나, FaDu세포는 세포성장이 20% 감소하였으며, 0.5mg/mL에서 YD-38세 포는 30%, FaDu세포는 55% 세포성장이 감소하였다. 이 실험결과에서 YD-38과 FaDu 구강암세포 성장이 청각 메탄올추출물에 의해 농도-의존적으로 억제됨을 확인하 였으며, 성장 억제 기전을 확인하기 위한 이후 모든 실 험은 FaDu 세포에서 0.125, 0.25, 0.5mg/mL을 24시간 동 안 처리하여 수행하였다.

2 Live & Dead 염색을 이용한 청각(Codium fragile) 메탄올추출물에 의한 사람 하인두 편평암세포 FaDu의 세포사멸

청각 메탄올추출물에 의한 암세포 증식 억제 효과가 세포사멸과 연관성이 있는지 확인하기 위해 Live & Dead assay를 실시하였다. FaDu 암세포에 청각 메탄올추출물을 0.125, 0.25, 0.5mg/mL로 24시간 처리한 후 Live-dye인 Calcein-AM과 Dead-dye인 Ethd-I를 동시에 염색하여 살아 있는 세포와 죽은 세포를 관찰하였다. 실험 결과, 대조군 보다 0.25와 0.5mg/mL의 추출물을 처리한 실험군에서 녹 색으로 염색된 세포가 감소하면서 붉게 염색된 세포가 많 아지는 것을 형광현미경으로 확인하였으며, 이는 청각 메 탄올추출물의 농도-의존적으로 세포사멸이 일어났음을 확인하였다(Fig. 2).

3 DAPI 염색을 이용한 청각(Codium fragile) 메탄올 추출물에 의한 FaDu의 세포사멸 형태 관찰

Live & Dead assay를 통해 청각 메탄올추출물이 FaDu 암세포의 세포사멸에 관여한다는 결과를 확인하였으므로, 세포핵의 형태학적 변화를 관찰하기 위해 DAPI staining 을 수행하였다. DAPI의 핵 염색을 통해 세포사멸이 유발 되었을 때 나타나는 핵의 응축과 염색질의 분절화를 형광 현미경을 통해 확인할 수 있으며, 이를 통하여 세포사멸 이 일어났음을 판단할 수 있다. FaDu 암세포에 청각 메탄 올추출물을 0.125, 0.25, 0.5mg/mL로 24시간 처리한 후 DAPI 염색을 한 결과, 0.25와 0.5mg/mL을 처리한 실험군 에서 농도-의존적으로 염색질 분절화와 핵의 응축이 유도 됨을 확인하였다(Fig. 3). 세포 사진을 counting하여 얻은 그래프로 대조군에서 세포 사멸이 일어난 세포의 비율이 0.6%임과 비교할 때, 0.125mg/mL을 처리한 실험군은 그 비율이 10%로 대략 10배, 0.25mg/mL을 처리한 실험군은 25%로 대략 42배 또, 0.5mg/mL을 처리한 실험군은 98% 로 세포사멸이 확연히 증가하였으며, 이는 청각 메탄올추 출물의 농도가 증가함에 따라 apoptotic 세포의 비율이 증 가함을 알 수 있다(Fig. 3).

4 청각(Codium fragile) 메탄올추출물에 의한 FaDu 의 세포 주기 정지 분석

청각 메탄올추출물에 대한 FaDu 암세포의 세포사멸 이 세포주기 정지에 의함인지확인하기 위해 각 cell cycle marker의 단백 발현을 웨스턴 분석을 통해 확인 하였다. FaDu 암세포에 청각 메탄올추출물을 0.125, 0.25, 0.5mg/mL로 24시간 처리한 결과, 농도-의존적으 로 p21의 발현이 증가하였으며, G1/S 세포 주기 마커 인 CDK4, CyclcinD1, p-Rb의 발현이 감소함을 확인하 였다(Fig. 4).

5 청각(Codium fragile) 메탄올추출물에 의한 세포사 멸 단백질 발현 확인

청각 메탄올추출물에 의한 FaDu 암세포의 세포사멸 기 전을 확인하기 위해 caspase 활성을 western blotting을 통 하여 확인하였다. Caspase는 세포사멸의 지표로서 세포의 손상 또는 스트레스 신호가 올 경우 단백질 가수분해 (proteolytic cleavage)가 일어나면서 DNA 분절화를 유도하 여 세포사멸을 발생시킨다. FaDu 암세포에 청각 메탄올 추출물 0.125, 0.25, 0.5mg/mL로 24시간 처리한 결과, cleaved caspase-9, cleaved caspase-3과 cleaved caspase-7의 활성이 농도-의존적으로 증가하였으며, PARP의 분절이 일어남을 확인하였다(Fig. 5A). 또한, 미토콘드리아 막에 서 세포사멸 조절에 관여하는 Bcl-2 family 단백질들의 발 현을 Western blot을 수행하여 확인한 결과, 청각 메탄올 추출물을 처리한 군에서 anti-apoptotic 인자인 Bcl-2의 단 백 발현이 감소하였으며 pro-apoptotic 인자인 Bax의 단백 발현이 증가됨을 확인하였다(Fig. 5C).

고 찰

청각(Codium fragile (Suringar) Hariot)은 청각과(Codiaceae family)에 속하는 녹조류로 전통의학에서는 부종와 배변장 애와 같은 증상을 치료하기 위해 사용되어져 왔으며 동아시 아에서는 음식의 재료로 사용되고 있다. 몇몇 연구에 따르 면, 청각 메탄올추출물이 항염증[14], 항부종[14], 항알레르 기[10], 항암(유방암세포)[11] 등 다양한 약리활성을 가진다 고 보고되어 있으나, 구강암에서 구강암세포 성장 억제효과 에 대해서는 알려진 바 없다. 따라서 본 연구에서는 청각 메탄올추출물에 의한 사람 유래 구강 편평암세포인 YD-38 과 FaDu의 성장 억제효과 및 FaDu에서 그 분자적 기전을 연구하였다.

청각 메탄올추출물을 YD-38과 FaDu 암세포에 다양한 농도(0.125, 0.25, 0.5mg/mL)로 24시간 동안 처리한 후 MTT assay 기법을 이용하여 세포 성장억제 효과를 확인한 결과, 0.125mg/mL까지는 세포 성장억제 효과는 보이지 않 았으나 0.25mg/mL부터 농도-의존적으로 세포 성장이 억제 됨을 확인하였으며 0.5mg/mL에서 세포 성장이 YD-38은 30%, FaDu는 55%가 억제되었다. 더구나 Dilshara 연구팀 의 연구에 따르면, 청각 메탄올추출물 0.1mg/mL을 유방암 세포주인 MDA-MB-231에 처리하자 세포 성장억제 효과는 없었으나, TNF-α에 의해 유도된 암세포의 특이적인 성질 인 침입(invasion)을 억제하는 것으로 나타났다[11]. 따라서 청각 메탄올추출물은 낮은 농도(0.1mg/mL)에서는 암세포 의 성질(invasion)을 억제하며 높은 농도(0.25mg/mL)에서 는 암세포 성장을 억제하는 것으로 보이며, 더 다양한 암 세포에서 청각 메탄올추출물의 항암 효능 분석이 필요하 다고 사료된다. 청각 메탄올추출물에 의한 FaDu 암세포의 성장억제 효과가 세포사멸에 의한 것인지 알아보기 위해 FaDu 암세포에 0.125, 0.25, 0.5mg/mL의 청각 메탄올추출 물을 24시간 처리한 후 Live & Dead assay와 DAPI stain을 수행한 결과, 농도-의존적으로 붉은 형광이 많아지는 것을 확인하였으며, DAPI를 통한 세포핵 염색 결과에서도 세포 사멸의 특징인 핵의 응축과 염색질 분절이 청각 메탄올추 출물의 농도-의존적으로 증가됨을 확인하였다. 이는 항암 효과를 지닌 다른 여러 추출물의 암세포 성장억제 연구 결 과와 일치하는 것으로, 황기 추출물을 유방암세포주인 MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-231 세포에 처리하자 농도(25, 50, 100ug/mL) 의존적으로 암세포의 성장을 억제시켰으며, 대장암세포주인 HCT-116과 RKO 세포에 오이풀 열수추출 물을 처리하자 농도(0~400ug/ml)와 시간(24h, 48h) 의존적 으로 암세포의 성장이 억제됨을 확인하였다[15,16]. 또, 오 이풀 열수추출물에 의한 세포성장 억제가 세포사멸에 의 함인지 확인하기 위해 DAPI stain으로 분석한 결과, 오이 풀 열수추출물에 의해 핵의 응축과 염색질 분절이 유도되 는 것을 확인하였다[16]. 더구나, 이들 연구팀은 이러한 세 포사멸이 세포주기 정지에 의해 유도되는지 확인하기 위 해 PI stain을 통해 DNA를 염색하여 세포주기 정지 분석을 수행하였으며, 그 결과 오이풀 열수추출물을 처리한 군에 서 세포주기가 sub-G1 단계에 정지되어 있음을 확인하였 다[16]. 따라서 이들은 오이풀 열수추출물에 의한 세포사 멸이 세포주기를 sub-G1 단계에 정지시킴으로써 유도된다 고 하였다.[16]. 그러므로 청각 메탄올추출물에 의한 FaDu 암세포의 세포사멸 유도가 세포주기 정지에 의함인지 확 인하기 위해 G1에서 S기로 넘어가는 관문점 마커인 p21, CDK4, CylcinD1, p-Rb의 단백질 발현을 Western blotting으 로 확인하였다. 그 결과 청각 메탄올추출물에 의해 세포주 기가 G1 단계에 정지되어 있는 것을 확인하였다. 암세포 의 세포사멸 유도는 항암 효능 및 기전을 분석하는데 가장 유력한 전략이며, 암세포에만 특이적으로 세포사멸을 유 도한다면 항암제의 부작용을 최소화 하면서 효과적인 항 암효과를 기대할 수 있다. 따라서 우리는 청각 메탄올추출 물에 의한 세포사멸의 분자적 기전을 확인하기 위해 세포 사멸이 일어날 때 활성이 개시되는 caspase의 활성을 western blotting을 통해 확인하였다. 그 결과, 청각 메탄올 추출물을 처리한 실험군에서 cleaved caspase-3, -7, -9의 발 현이 농도-의존적으로 증가함을 확인하였으며, PARP의 cleavage 현상을 확인하였다. 이와 같은 세포사멸이 내인 성 미토콘드리아 의존성 pathway에 의한 것인지 확인하기 위해 Bcl-2와 Bax의 단백발현을 확인한 결과, anti-apoptotic 분자인 Bcl-2의 단백발현이 농도-의존적으로 감소하였으 며, pro-apoptotic 분자인 Bax의 단백발현이 증가함을 확인 하였다. 이와같은 결과는 다른 여러 추출물에 의해 다양한 암세포의 세포사멸이 미토콘드리아-의존적인 경로를 통해 일어난다는 다른 연구들과 일치함을 알 수 있다[17-19].

결론적으로, 본 연구에서는 기존의 천연 및 합성 항 암제의 부작용을 최소화하기 위해 청각 메탄올추출물을 이용하여 사람 유래 구강 편평암세포 YD-38과 FaDu에 서 세포 성장억제와 FaDu에서 그 분자적 기전을 연구하 였다. 그 결과, FaDu 암세포에서 청각 메탄올추출물의 처리는 미토콘드리아-의존성 세포사멸을 통해 암세포의 성장을 억제하였음을 확인하였으며, 이는 효과적인 천연 항암 후보물질로써 검색이 가능할 뿐만 아니라 구강암 에 특이적인 항암제로서 개발에 도움이 될 수 있을 것 으로 사료된다.