서 론

상아질지각과민증은 열, 증발, 촉감, 삼투압, 화학적 자 극에 반응하여 노출된 상아질에서 일어나는 단기간의 급 성 통증으로 알려져 있으며, 감염이 아닌 노출된 상아질 표면에서 상아세관이 드러난 형태이다[1]. 상아질 지각과 민증의 기전을 설명하는 몇 가지 가설이 있으나, 가장 흔 히 받아들여지고 있는 것은 유체역학설이다[2]. 유체역학 설에 의하면, 노출된 상아질의 열린 상아세관은 상아세관 내의 상아세관액을 이동하게 하여 간접적으로 치수 신경 을 자극한다는 것이다. 이 이론에 의해 상아질 지각과민 증의 처치는 노출된 상아세관을 폐쇄하거나 상아질 투과 도를 감소시키고자 한다.

한편, 수산화인회석(hydroxyapatite; HA)은 인체의 경조 직을 구성하는 기본성분이다. 사람 치아 법랑질의 외곽 1 ∼2 mm에 위치하고 있으며, 뼈 조직의 이식 또는 뼈 재 생의 재료로도 활용되고 있다. 나노 크기의 수산화인회석 (nano-hydroxyapatite; n-HA)은 생체친화성 및 생체활성이 우수한 물질로 의학과 치의학에서 사용되고 있다[3]. n-HA는 형태학적 구조가 치아의 법랑질의 결정과 유사하 고 재광화력을 가지고 있어서 법랑질의 재건을 위한 물질 로도 연구되고 있다[4]. 또한 많은 연구에서 상아세관 폐 쇄에 있어 수산화인회석이 효과가 높으며, 수산화인회석 입자가 치아 위에 흡착되어 상아질 표면에 칼슘-인층을 형성하여 상아세관 폐쇄력이 상당히 높다고 하였다[4, 5].

불소는 치아우식증 예방과 초기 우식의 재광화를 위해 치의학 분야에서 가장 널리 사용되고 있는 물질로 법랑질 표면에서 치아의 주성분인 수산화인회석과 결합하여 불 화인회석으로 변함으로써 탈회를 억제하고 재광화를 촉 진시킨다[6]. 치과에서 주로 사용하는 불소 제제에는 불 화나트륨(sodium fluoride; NaF) 용액, acidulated phosphate fluoride(APF) 젤, 불화석(SnF2) 등이 있으며 최근에는 5% NaF에 천연레진을 혼합한 불소 바니쉬가 많이 이용되고 있다. 불화나트륨은 수소이온농도가 중성이기 때문에 치 아와 치은에 자극이 없고 안전하며 이온분리가 잘 되는 특징이 있다[7]. APF는 일반적으로 1.23%의 불소농도를 사용하며 pH 3.5 정도이다. 많은 연구에서, APF 젤이 중 성의 NaF보다 법랑질에 대한 불소 흡착력이 더 높다고 보고된 바 있으나[8, 9], APF 젤의 산성은 수복재의 거칠 기를 증가시키며[10], 수복물을 침식시킬 수 있으므로 수 복물을 가진 환자에게 적용할 경우에는 주의가 필요하다 [11]. 불화석은 8% 용액을 주로 사용하며 강한 효과를 나 타내지만 불안정하고 치은의 변색이나 자극을 유발하는 단점이 빈번히 지적된다.

물리학 또는 전기학에서 말하는 플라즈마는 기체에 강 한 에너지를 공급해서 만들어진 새로운 형태의 상태를 말 한다. 실험실에서 만들어진 플라즈마는 M. Faraday에 의 하여 1835년경 처음으로 만들어졌으며 영국의 물리학자 Sir. William Crookers는 1879년에 전리된 기체는 이상 기 체의 법칙을 따르지 않는다는 이유로 ‘제 4의 물질상태’ 로 정의하기도 했다. 플라즈마라는 용어를 처음 사용한 사람은 미국의 물리학자 랭뮤어(Langmuir)로 전기적 방전 으로 인해 생기는 전하를 띈 양이온과 전자들의 집단을 플라즈마라고 정의하였다[12]. 플라즈마는 입자들의 열적 평형상태를 근거로 고온 플라즈마와 저온 플라즈마로 구 별할 수 있으며, 산업 분야에서 고온으로 널리 사용되었 는데, 저온의 대기압 플라즈마가 개발된 후 생명과학 분 야에서 다양하게 연구되고 있다[13-15].

플라즈마의 가장 대표적인 특징은 다양하게 발생되는 활성종(active species)을 들 수 있다. 이 활성종은 수산화 기(hydroxyl radical: OH․), 이온, 전자, 광자, 이온화된 가스 와 소량의 자외선 등이 방출된다[12]. 플라즈마에는 다양 한 방전 입자, 활성종, 전기장 등을 가지고 있어서 사용되 는 가스와 플라즈마 발생 모듈 종류에 따라 다양하게 적 용가능하다. 또한 독성이 없고 저온이라 조직에 손상을 입히지 않고 쉽게 사용가능하다[16]. 최근에 이러한 저온 대기압 플라즈마가 생체에 미치는 영향이 체계적으로 연 구되고 있으며 세포의 사멸과 재생을 이용한 암 치료, 살 균 및 피부치료, 상처치유, 지혈, 치아미백 등의 다양한 효과를 보이고 있다[12]. 그러나 상아질 지각과민증 치료 를 위하여 플라즈마를 활용한 연구는 아직 거의 없는 실 정이다.

따라서 이 연구는 저온 대기압 플라즈마를 이용하여 n-HA와 F-CMC(fluoride-carboxymethyl cellulose)젤과 상아 세관 폐쇄 효과를 연구함으로써 지각과민완화 처치에서 저온 대기압 플라즈마의 적용 타당성을 검토해 볼 목적으 로 시도되었다.

재료 및 방법

1 플라즈마 장비

본 연구에 사용된 플라즈마 장비는 두 전극 사이에 유전 체가 있는 전형적인 유전격벽방전(dielectric barrier discharge; DBD) 방식의 플라즈마 장비이며, 유전체로 유리관이 사 용되었다(Fig. 1). 고전압 사인파 전원 공급 장치를 사용해 약 10 kHz의 주파수로 5 kV 전압을 인가하여 플라즈마를 발생시켰으며, 유량조절계(MFC)를 사용하여 2∼3 slm (standard liter per minutes)의 고순도 헬륨 기체를 유리관 안으로 주입시켰다. 플라즈마 젯의 길이는 5∼10 mm 정 도이며 이 길이는 인가된 전압과 헬륨 기체의 유량에 따 라 변화한다.

2 상아세관 폐쇄를 위한 처치

2-1 시편준비

발치된 사람 대구치를 수집하여 그 중 치아우식증과 금이 가지 않은 건전한 대구치 170개를 선정하였다(IRB: PNUDH-2014-025). 치아들은 실험에 사용되기 전까지 미 생물의 성장을 억제시키기 위해 0.4% sodium azide 용액 에 보관되었다. water-cooled diamond saw를 이용하여 치 수강에서 치아 장축에 수직방향으로 잘라 약 3 mm 두께 의 원형 상아질 시편 170개를 만들었다. 모든 상아질 시 편은 상아세관 노출을 위해 18% EDTA(pH 7.4)(Sigma aldrich, USA)에 30초 동안 vortexing 후 증류수로 3번 세 척하였다.

2-2 n-HA 처리

이 연구에 사용된 n-HA의 입자는 20 nm이다(MKnano, Canada). n-HA powder를 상아질 시편에 도포하기 위하여 slurry를 만들었다. n-HA slurry는 CMC와 수산화인회석을 증류수와 섞어 만들었다. 사용된 불소젤은 5% 불화나트 륨 F-CMC 젤로 증류수에 불화나트륨(Samcheon, Korea)과 CMC(Sigma aldrich, USA)를 섞어 만들었다.

10개의 시편은 대조군으로 두었고, 160개의 상아질 시 편은 총 4개의 실험군(HA, HAP, HAF, HAFP)으로 나뉘었 다. HA군은 상아질 시편 위에 n-HA slurry를 1 mm 두께 로 도포해 주었다. HAP군은 상아질 시편에 플라즈마를 3 분 동안 적용한 후 n-HA slurry를 도포하였다. HAF군은 상아질 시편에 불소를 3분 적용한 후 거즈를 이용하여 잔 여 불소를 제거하고 n-HA slurry를 도포하였다. HAFP군 은 상아질 시편에 플라즈마와 불소를 함께 3분 동안 적용 한 후 거즈를 이용하여 잔여 불소를 제거하고 n-HA slurry 를 3분간 도포하였다. n-HA 도포 후에 증류수와 칫솔을 이용하여 10회 칫솔질을 해주어 상아질 시편 위의 잔여물 을 제거하였다. 대조군은 아무 처리를 하지 않고 인공타 액에 담궈두었다. 각 실험군의 시편은 횟수별 효과를 보 기 위해 하루 간격으로 총 4회까지 n-HA slurry에 적용하 였고, 도포 횟수별 유지 효과를 보기 위해 각 회당 4 주간 인공타액에 담궈두었다(Fig. 2).

2-3 주사전자현미경 관찰

상아세관의 폐쇄 정도를 보기 위해 주사전자현미경 (scanning electron microscopy, SEM; S3500N, HITACHI, Japan) 촬영을 하였다. 주사전자현미경 촬영을 위해 시편 들을 2.5% glutaraldehyde(Sigma aldrich, USA)로 30분간 처 리했다. 그 후 1% osmium tetroxide(Sigma aldrich, USA)를 30분간 처리하고 에탄올(Sigma aldrich, USA)로 저농도에 서 고농도로 탈수시켰다(70%, 80%, 90%, 100%). 이후 hexamethyldisilazane(HMDS; Sigma aldrich, USA)을 사용하 여 건조시켰다. 모든 시편은 알루미늄 판 위에 고정시켜 gold-sputter를 이용해 진공 상태에서 코팅시켰다. 주사전 자현미경은 가속전압 15 kV에서 작동되었다. 모든 이미 지는 2,000배와 5,000배의 배율로 무작위로 선택되어 촬 영하였다.

2-4 Energy dispersive X-ray spectroscopy(EDS) 분석

상아질 시편 위에 새롭게 형성된 결정을 정량화하기 위하여 EDS(Supra40 vp, Carl zeiss, Germany) 분석을 시행 했다. EDS를 통한 line scan 성분 분석은 15 kV에서 40배 율로 시행되었다. 상아질 시편은 상하좌우로 나누어 똑같 은 크기의 line을 지정해 지정한 line을 따라 칼슘(Ca)과 인(P)의 함량이 측정되었다. 측정된 칼슘과 인의 값을 통 해 칼슘/인 비율(Ca/P ratio)을 구했다.

2-5 통계분석

얻어진 결과값들은 SPSS 프로그램을 사용하여 통계처 리 하였다. 실험군과 대조군의 결과값의 비교는 student t-test를 이용하였고, 실험군간의 비교는 one-way ANOVA 와 Bonferroni/Dunn post-hoc test를 이용하여 분석하였다. 유의수준은 0.05로 하였다.

결 과

대조군의 상아질 시편은 상아세관이 깨끗하게 노출되 어 있었으며, HA군의 시편에서는 HA 결정이 상아질 시 편 위로 보였다. HAF, HAP, HAFP군의 시편에서는 많은 양의 HA 결정이 시편을 덮고 있었으며, 상아세관 속에 박혀 상아세관 일부를 막고 있었다 (Fig. 3). 처리 횟수나 유지된 기간에 따른 상아세관 폐쇄 차이는 크게 나타나지 않았다.

EDTA로 탈회 후 인공타액에만 둔 대조군의 Ca/P ratio 는 탈회 즉시에는 0.87, 인공타액에 1주, 2주, 3주, 4주간 둔 후에는 각각 0.89, 1.02, 1.04, 1.05였다.

실험군에서는 1회 도포 직후 Ca/P ratio를 분석한 결과, HA군은 1.07, HAF군은 1.06, HAP군은 1.06, HAFP군은 1.10이었다. 대조군과 비교하였을 때 HA, HAF, HAP, HAFP군의 결과값은 유의하게 높았다(p<0.05). 또한 HAFP 군의 결과값은 HA, HAF, HAP군의 결과값과 비교하여 유 의하게 높았다(p<0.05) (Fig. 4A). 2회 도포 직후에 HA군 은 1.05, HAF군은 1.09, HAP군은 1.08, HAFP군은 1.08이 었다. 대조군과 비교하였을 때 HA, HAF, HAP, HAFP군의 결과값은 유의하게 높았다(p<0.05) (Fig. 5A). 3회 도포 직 후에 HA군은 1.02, HAF군은 1.07, HAP군은 1.07, HAFP군 은 1.10이었다. 대조군과 비교하여 HA, HAF, HAP, HAFP 군의 결과값은 유의하게 높았으며(p<0.05) HAF, HAP, HAFP군 결과값은 HA군의 결과값과 비교하여 유의하게 높았다(p<0.05) (Fig. 6A). 4회 도포 직후에 HA군은 1.03, HAF군은 1.1, HAP군은 1.1, HAFP군은 1.09였다. 대조군 과 비교하였을 때 HA, HAF, HAP, HAFP군의 결과값은 유의하게 높았으며(p<0.05) HAF, HAP, HAFP군의 결과값 은 HA군의 결과값과 비교하여 유의하게 높았다(p<0.05) (Fig. 7A).

1회 도포 후 4주간의 Ca/P ratio를 분석한 결과, 1주차에 HA군은 0.97, HAF군은 0.99, HAP군은 0.98, HAFP군은 0.97이었다(Fig. 4B). 2주차에서 HA군은 1.02, HAF군은 1.00, HAP군은 1.04, HAFP군은 1.01이었다(Fig. 4C). 3주 차에서 HA군은 1.04, HAF군은 1.00, HAP군은 1.04, HAFP 군은 1.01이었다(Fig. 4D). 4주차에서 HA군은 1.04, HAF 군은 1.04, HAP군은 1.02, HAFP군은 1.04이었다(Fig. 4E). 4주간의 비교에서 각 군별 유의한 차이는 없었다.

2회 도포 후 4주간의 Ca/P ratio를 분석한 결과, 1주차에 HA군은 1.08, HAF군은 1.05, HAP군은 1.11, HAFP군은 1.06이었다. HA, HAF, HAP, HAFP군의 결과값은 대조군 의 결과값과 비교해서 유의하게 높았다(p<0.05) (Fig. 5B). 2주차에서 HA군은 1.08, HAF군은 1.08, HAP군은 1.09, HAFP군은 1.10이었다. HAF, HAP, HAFP군의 결과값은 대조군과 비교해서 유의하게 높았다(p<0.05) (Fig. 5C). 3 주차에서 HA군은 1.03, HAF군 1.03, HAP군은 1.13, HAFP 군은 1.10이었다. HAP, HAFP군의 결과값은 대조군과 HA, HAF군과 비교하여 유의했다(p<0.05) (Fig. 5D). 4주차 에서 HA군은 1.05, HAF군은 1.07, HAP군은 1.06, HAFP군 은 1.06이었으며 각 군별 유의한 차이는 없었다(Fig. 5E).

3회 도포 후 4주간의 Ca/P ratio를 분석한 결과, 1주차에 HA군은 0.99, HAF군은 1.10, HAP군은 1.08, HAFP군은 1.06이었다. HA, HAF, HAP, HAFP군의 결과값은 대조군 과 비교하여 유의하게 높았으며(p<0.05) HAF, HAP, HAFP군의 결과값은 HA군과 비교하여 유의하게 높았다 (p<0.05) (Fig. 6B). 2주차에서 HA군은 1.08, HAF군은 1.07, HAP군은 1.10, HAFP군은 1.07이었다. HA, HAF, HAP, HAFP군의 결과값은 대조군과 비교하여 유의하게 높았다(p<0.05) (Fig. 6C). 3주차에서 HA군은 1.07, HAF군 은 1.03, HAP군은 1.04, HAFP군은 1.09이었다. HAFP군의 결과값은 대조군과 HAF, HAP군의 결과값과 비교하여 유 의하게 높았다 (p<0.05) (Fig. 6D). 4주차에서 HA군은 1.03, HAF군은 1.07, HAP군은 1.04, HAFP군은 1.12이었 다. HAFP군의 결과값은 대조군과 HA, HAP군의 결과값 과 비교하여 유의하게 높았다(p<0.05) (Fig. 6E).

4회 도포 후 4주간의 Ca/P ratio를 분석한 결과, 1주차에 HA군은 1.01, HAF군은 1.05, HAP군은 1.06, HAFP군은 1.04이었다. 실험군 전체의 결과값은 대조군의 결과값과 비교하여 유의하게 높았다(p<0.05) (Fig. 7B). 2주차에서 HA군은 1.03, HAF군은 1.05, HAP군은 1.05, HAFP군은 1.09이었다. HAFP군의 결과값은 대조군과 HA, HAF, HAP군의 결과값과 비교하여 유의하게 높았다(p<0.05) (Fig. 7C). 3주차에서 HA군은 1.08, HAF군은 1.07, HAP군 은 1.10, HAFP군은 1.09이었다. 모든 실험군의 결과값은 대조군과 비교하여 유의하게 높았다 (p<0.05) (Fig. 7D). 4 주차에서 HA군은 1.13, HAF군은 1.12, HAP군은 1.13, HAFP군은 1.12이었다. 모든 실험군의 결과값은 대조군의 결과값과 비교하여 유의하게 높았다(p<0.05) (Fig. 7E).

고 찰

불화나트륨은 국소적인 불소도포를 위한 불소용액과 불소 바니쉬, 불소세치제, 불소양치용액 등에 널리 사용 되고 있는 물질이다. 국소도포를 위해 고운 분말 형태의 불화소다를 물에 희석하여 일반적으로 2% 농도로 사용하 며 자극이 적으므로 어린이에게 사용하기 좋고 일정한 주 기로 반복 도포하는 것이 좋다. 또한, 불화나트륨은 용액 자체로만 사용하는 경우 그 결합효과가 낮으므로 치아 내 결합효과를 높이기 위하여 불소이온도입법을 사용해야 더욱 효과적이라고 알려져 있다[17]. 하지만 불소이온도 포법은 신체에 약한 전류를 흘려보내기 위한 장비가 추가 로 필요하고 트레이를 일정시간동안 구강 내에 위치시키 는 수고가 필요하므로 협조도가 좋지 않은 어린이에게 적 용하기에는 한계가 있으며 불소의 반복도포 또한 어렵다.

이러한 한계를 극복하고 불화나트륨을 치아에 효과적 으로 적용하기 위해 개발된 것이 불소 바니쉬이다. 불소 바니쉬는 5% 불화나트륨에 천연레진을 혼합한 불소 제재 로 천연레진의 점성으로 장시간 치면에 부착되어 불소를 유리하게 된다. 이번 연구에서는 불소제재로 불화나트륨 을 사용하였으며 불소 바니쉬와 비슷한 치면 적용 효과를 위해 carboxymethyl cellulose(CMC)를 사용하였다.

Carboxymethyl cellulose(CMC)는 글루코피라노오스 단 량체의 수산기와 결합한 카복시메틸기의 셀룰로오스 유 도체이다[18]. CMC는 점성이 높고, 무독성이며, 알레르기 를 일으키지 않는 물질이다[19]. 본 연구에서는 인체에 안 정적이며 높은 점성을 통해 불소를 계속하여 방출할 수 있는 중성의 불소 제제를 만들기 위해 CMC와 불화나트 륨 용액을 섞어 5% F-CMC 젤을 만들어 사용하였다.

플라즈마를 이용한 불소 도포나 상아질 지각과민증 치 료에 관한 연구는 거의 없으나, 플라즈마는 다양한 의생 명 분야에서 연구되고 있다. 플라즈마는 세포 부착과 연 관된 단백질을 불활성화시킴으로써 세포자멸사를 유도한 다[20]. 또한 플라즈마는 살균, 멸균 부분에 가장 많은 연 구가 이루어졌다. 이뿐 아니라 상처치유, 혈액 응고, 피부 미용 등 다양한 분야에서 연구가 되고 있다. 치의학 분야 에서는 플라즈마가 과산화수소를 이용하여 OH기를 다량 으로 만듦으로써 치아 미백을 효과적으로 수행한다고 보 고되고 있다[21].

상아질 지각과민증을 해결하기 위한 방법에는 자극을 가하여 삼차상아질 형성을 유도하거나 도말층 형성이나 약제사용으로 상아세관을 폐쇄하는 방법 등이 있다. 상아 세관 폐쇄를 위해 많은 제재가 사용되고 있는데 불소는 법랑질의 격자 구조에 불화인회석을 형성하는 재광화 물 질로 침전에 의해 상아세관을 막는다[22, 23]. Bioactive glass는 오래전부터 골형성에 사용된 생체친화적 물질이 지만, 최근 치과에서는 뼈와 상아질 사이의 유사성 때문 에 이용되고 있다[24]. 수산화인회석은 치아를 구성하는 대표적인 성분으로 법랑질의 96-97%, 상아질의 70% 정도 를 이루고 있으며 많은 연구에서 상아세관 폐쇄에 있어 bioactive glass보다 효과가 높다고 하였다[4, 5].

특히 상아질 지각과민증을 보이는 경우 상아세관의 직 경은 0.9 ㎛로 알려져 있으므로[25], 이론적으로 효과적인 상아세관의 폐쇄를 위해서는 이 직경보다 작은 크기의 수 산화인회석을 사용하는 것이 필요하다. 최근 나노 기술의 발달로 기존의 마이크로 크기의 수산화인회석보다 나노 크기의 수산화인회석은 미세한 입자 크기를 가지게 되므 로 표면적이 증가되어 상아세관을 폐쇄하는데 더 효과적 이다. 또한 넓은 표면적을 통해 더 많은 양의 칼슘과 인 이 발생하고 다양한 부착 성질로 인해 이온 교환을 기대 할 수 있다고 알려져 있다[26]. 이러한 이유로 이번 연구 에서 20nm의 수산화인회석을 사용하였으며 안정적인 도 포를 위해 CMC를 이용한 slurry를 만들었다.

본 연구에서는 EDS를 장착한 FE-SEM을 이용하여 line 을 지정하여 칼슘-인 비율을 구했다. 탈회 후 인공타액에 만 둔 대조군의 칼슘-인 비율이 시간이 지날수록 증가하는 것은 타액의 영향이 있는 것으로 보인다. 타액에는 칼슘과 인이 풍부하므로 수산화인회석의 크기가 커지는 것에 관 여하기 때문이다[27]. Line scan 결과를 전체적으로 판단하 면, 수산화인회석의 적용횟수에 관계없이 모든 실험군에 서 적용 직후 대조군보다 높은 칼슘-인 비율을 보였다. 1 회만 적용한 경우는 1주후부터 그 유지력에서 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았지만 적용횟수가 늘어날수록 모든 실험군이 대조군과 유의한 차이를 보이는 기간이 늘 어나는 경향을 보였다. 이를 통해 불소도포와 마찬가지로 상아세관 폐쇄효과의 지속을 위해서는 반복적인 적용이 필요함을 알 수 있다. 또한 수산화인회석의 단독 적용보다 는 불소나 플라즈마를 병용한 HAF, HAP, HAFP군의 칼슘- 인 비율이 유의하게 높게 유지되는 경우가 있었으며 불소 와 플라즈마를 모두 병용한 HAFP군의 경우 다른 군들에 비해 유의한 값을 나타내는 경우가 많았다.

위 결과에서 보듯이 상아세관을 노출시킨 상아질 시편 에 수산화인회석을 적용하였을 때 칼슘-인 비율을 증가시 켰으며 이는 수산화인회석의 상아세관 폐쇄효과를 보여 주는 것이다. 또한 반복해서 적용할수록 그 유지기간은 길어진다는 것을 알 수 있으며 전체적으로 수산화인회석 을 단독으로 적용한 경우보다 불소나 플라즈마를 병용한 HAF, HAP, HAFP군의 유지가 더 우수함을 보여주었다. 특히, 플라즈마와 불소를 함께 사용한 HAFP군은 더 높은 칼슘-인 비율을 나타내었다. 이는 플라즈마의 OH 활성종 이 상아질에 작용하여 치아의 소수성을 친수성으로 바꿔 주는 역할을 했기 때문인 것으로 유추할 수 있으며 앞으 로 정확한 메커니즘에 대한 연구가 더 필요할 것으로 생 각된다.

본 연구에서는 저온의 상압 플라즈마와 F-CMC 젤과 나노 사이즈의 수산화인회석 입자를 이용하여 상아세관 폐쇄력과 칼슘-인 비율을 분석하여 그 효과에 대해 증명 하였다. 이러한 결과를 통해, 이 연구는 저온 상압 플라즈 마를 이용한 F-CMC 젤과 나노 사이즈의 수산화인회석의 적용이 지각과민증 치료에 있어 새로운 대안이 될 수 있 을 것이라고 제안한다.