서 론

치아우식증은 치주질환과 더불어 구강 내에서 가장 빈번하게 발생하는 질환으로, 치면세균막 내 세균들의 당질 대사의 분산물인 젖산을 포함하는 유기산들에 의 해 치아 표면 무기질 탈회를 시작으로 치질이 파괴되는 질환이다[1]. 사람에게서 치아우식증의 주요한 원인균종 으로는 뮤탄스 연쇄구균에 속하는 Streptococcus mutans 및 Streptococcus sorbinus 알려졌다[2].

많은 기간 동안 치아우식증의 치료로 결손된 치질을 수 복하는 방법을 사용하여 왔으나 최근 들어서는 치아우식 을 예방하기 위한 방법들이 많이 사용되고 있다. 즉, 불소 가 함유된 치약 및 양치용액을 이용한 치아 법랑질 표면의 내산성을 높이는 방법과, 항균 물질이 첨가된 치약 및 양 치용액을 이용하여 구강 내 치아우식증 원인균종들의 성 장을 억제하거나 사멸시키는 방법 등이 있다[3-5]. 이러한 구강위생용품에 사용되는 효과적인 항균 물질로는 클로르 헥시딘(chlorhexidine)이 있다. 하지만, 클로르헥시딘은 쓴 맛이 나며 혀와 치아의 변색을 초래하는 단점이 있으며, 장기간 지속적으로 사용할 수 없다는 단점이 있다[6,7]. 또 한 항생제들은 우수한 항균력이 있지만, 장기간 사용할 해 당 항생제에 대한 내성 균주가 발생할 수 있는 심각한 단 점이 있다. 그러므로 구강위생용품 개발에 사용할 항균물 질을 천연물에서 찾으려는 노력들이 많은 연구자들에 의 해 진행되어 왔다[8-11]. 최근 녹차에서 수용성 추출물을 얻고, 이를 다시 ethyl acetate로 추출하여 4가지 카테킨들 [21% (-)-epigallocatechin (EGC), 7.3% (-)-Epicatechin (EC), 29.2% (-)-Epigallocatechin gallate (EGCg), 7.9% (-)-Epicatechin gallate (ECg)]이 주성분을 이루는 polyphenon 60 [12]이 우 수한 항균증이 있다는 보고들이 있었다[13,14]. 하지만 polyphenon 60의 치아우식증 주요 원인균인 S. mutans 및 S. sorbinus들에 대한 항균력에 대한 연구는 진행되어 있지 않았다. 그러므로 본 연구에서는 한국인에서 분리 동정된 S. mutans 및 S. sorbinus 균주들에 대한 polyphenon 60의 항 균능 및 생체막(biofilm) 형성 억제능을 조사하여 향 후 치 아우식증 예방을 위한 구강위생용품 개발에 항균물질로 사용 가능성을 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

세균 및 배양

본 실험에 사용된 S. mutans (KCOM 1054, KCOM 1113, KCOM 1128, KCOM 1197) 및 S. sobrinus (KCOM 1157, KCOM 1152) 균주들은 한국인의 치면세균막에서 분리된 것으로 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology, Gwangu, Korea)에서 분양받아 사용하였다.

S. mutans와 S. sobrinus 균주들은 brain heart infusion (BHI, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) 액체배지 및 한천배지를 사용하여 세균배양기(Model SW- 900C, Sugong, Seoul, Korea)에서 37℃에서 24시간동안 배 양하여 다음 실험에 사용하였다.

최소살균농도(minimum bactericidal concentration, MBC) 측정

최고성장억제농도와 최소살균농도는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) [15]에서 제시한 미세 희석(micro-dilution) 법을 사용하여 측정하였다. 각각의 세 균들을 BHI 액체배지를 이용하여 세균배양기에서 24시간 동안 37℃로 배양한 후 1×106 CFU/ml 농도로 희석하여 각 100 μl씩 96-well plate에 분주하였다. Polyphenol 60 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)은 증류수에 용해(10 mg/ml)시키고 0.2 μm의 filter로 여과하여 다음 실험 단계 를 위해 준비하였다. Polyphenol 60 농도가 각 5, 2.5, 1.25 및 0.625 mg/ml가 되도록 BHI 액체배지에 희석하였고, 이 를 앞에 준비한 세균배양액이 들어있는 96-well plate에 첨 가하였다. 양성 대조군은 ampicillin 농도가 100 μg/ml인 BHI 액체배지에 세균을 배양한 것으로 사용하였으며, 음 성대조군은 세균을 첨가하지 않은 BHI 액체배지를 사용 하였다. 이들 세균배양액은 37℃에서 24시간 동안 배양하 였다. 최소살균농도 값을 구하기 위해 24시간 배양한 세 균배양액에서 10 μl를 취하여 BHI 한천배지에 도말하고 24시간 동안 37℃ 세균배양기에서 배양하여 형성된 세균 군락을 관찰하였다. 최소살균농도 값은 BHI 한천 배지에 양성 대조군에 비해 세균 군락이 99.9% 이상 감소된 최소 농도로 결정하였다. 각 실험은 3번 반복하여 실시하였다.

생체막 억제 능력 측정

본 연구에서 사용한 생체막 형성 억제능 실험은 crystal violet 염색법들[16-18]을 변형하여 사용하였다. 이를 설명 하면, 각각의 세균들을 BHI 액체 배지에 37℃, 20시간 정 치배양한 후, 약 1 X 108 CFU/ml 농도로 희석하였다. 인공 타액은 Adherence Buffer 용액(10 mM KH2PO4, 50 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, pH 7.0)에 1% Mucin (Mucin form porcine stomach, Type III, SIGMA M1778)을 첨가하여 제작하였다. 생체막형성을 관찰하기 위한 배지 는 3% sucrose를 첨가한 BHI (BHIS) 액체 배지를 사용하였 다. 96 well plate에 인공 타액 200 μl씩 분주한 후, 실온에 서 4시간 동안 천천히 교반하며 반응시키고 반응 후, 인공 타액을 pipette을 이용해 제거하고 15분간 건조시켰다.

Polyphenol 60 수용액(10, 5, 2.5 또는 1.25 mg/ml)은 0.2 μm의 filter로 여과하여 다음 실험에 사용하였다. 1 X 108 CFU/ml 농도를 가진 각각의 세균들은 40 μl씩 2배 농도의 BHIS 460 μl와 혼합하고, 앞에서 준비한 polyphenon 60 수 용액(10, 5, 2.5 또는 1.25 mg/ml) 500 μl를 혼합한 후 96-well plate에 100 μl씩 분주하였다. 대조군은 세균 40 μl 에 2배의 BHIS 460 μl와 증류수 500 μl를 혼합하여 사용 하였고, 대조군의 흡광도 보정을 위해서 2배의 BHIS 500 μl와 증류수 500 μl를 혼합하여 96-well plate에 100 μl씩 분주하였고, 시료의 흡광도 보정을 위하여 2배의 BHIS 500 μl와 각 두 배 농도의 시료 500 μl를 혼합하여 96-well plate에 100 μl씩 분주하였다. 분주된 96-well plate는 분주 하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 각 과정은 6회 반복 실시하였다.

배양 후 각각의 배지를 suction을 사용하여 제거한 후 crystal violet 용액 (0.2% crystal violet in 2% ethanol) 200 μl 첨가하여 실온에서 10분간 염색하였다. 염색 후, 용액을 제거하고 증류수로 조심스럽게 3회 세척한 후 실온에서 10분간 잘 건조시키고 탈색용액(0.5% SDS in 50% ethanol) 250 μl를 첨가하여 1시간 동안 shaking하면서 탈색하였다. 탈색된 용액 200 μl를 새로운 96 well plate로 옮겨, 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후 생체막 형성 억제율 은 다음과 같이 구하였다.

억제율(%) = 100 - [(대조군 OD 값 - 대조군 보정 OD 값) - (시료 OD 값 - 시료 보정 OD 값) / 대조군 OD값 - 대조군 보정 OD값] X 100

결 과

Polyphenon 60의 치아우식증 원인균에 대한 항균능을 확 인하기 위해 S. mutans 및 S. sorbrinus에 대한 MBC 값을 측정한 결과는 다음과 같았다(Table 1). S. mutans (KCOM 1054, 1113, 1197)와 S. sobrinus (KCOM 1157, 1152) 균주에 서 polyphenon 60의 MBC 값은 모두 2.5 mg/m로 나타났고, S. mutans KCOM 1128 균주에서의 MBC 값만 1.25 mg/ml로 나타났다. BHI 한천배지에 배양된 세균의 사진은 다음과 같았다(Fig. 1).

Polyphenon 60의 생체막 형성 억제 능력은 다음과 같이 나타났다(Table 2). S. mutans (KCOM 1054, 1113, 1197)와 S. sobrinus (KCOM 1157, 1152) 균주들의 polyphenon 60에 대한 MBC 값인 2.5 mg/ml의 농도에서 생체막 형성 억제 율이 90.7-93.8%로 나타났다. S. mutans KCOM 1128 균주 의 경우 polyphenon 60에 대한 MBC 값인 1.25 mg/ml에서 생체막 형성 억제율은 42.1%이었고, polyphenon 60의 2.5 mg/ml의 농도에서 91.3%의 생체막 형성 억제율을 보였다. 본 연구에서 사용된 모든 뮤탄스 그룹 연쇄구균들은 polyphenon 60의 5.0 mg/ml 농도에서 생체막 형성 억제율 이 100%로 나타났다.

고 찰

연구 결과 polyphenon 60은 본 연구에서 치아우식증 주 요 원인균종인 S. mutans 및 S. sobrinus 균주들에 대한 MBC 값은 S. mutans (KCOM 1128) 균주에서만 1.25 mg/ml 로 나타나고 나머지 5균주들은 2.5 mg/ml로 나타났다 (Table 1). 녹차에서 추출한 카테킨들의 S. mutans 또는 S. sobrinus에 대한 항균능을 평가한 여러 연구 결과에 의하 면, 0.25-5 mg/ml 범위 또는 5 mg/ml 이상의 최소성장억제 농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 값을 가졌다 [9,14,20]. 녹차추출물 CHMC-2032 (카테킨 성분 조성은 밝히지 않음)의 한국인에서 분리 동정한 10균주의 S. mutans 및 10균주의 S. sorbrinus에 대한 MIC 값은 2.5, 5, 또는 >5 mg/ml로 보고되었다[9]. Polyphenon 60의 주요 카 테킨 성분별로 2균주의 S. mutans 및 1균주의 S. sobrinus 에 대한 MIC를 구한 연구 결과를 보면 EC와 ECg의 경우 1.0 mg/ml 이상으로 나타나고 EGCg의 경우 0.5 또는 1.0 mg/ml, GC와 EGC의 경우 0.25 또는 0.5 mg/ml로 나타났 다[20]. 본 연구에서 사용된 polyphenon 60 수용액의 색깔 이 갈색을 띄었기 때문에 MIC 값을 구하지 못하였지만, 일반적으로 MIC 값이 MBC 값보다 낮다는 점을 고려한 다면 일반적인 녹차 유래 카테킨들과 polyphenon 60의 S. mutans 또는 S. sobrinus에 대한 항균능은 비슷한 것으로 판단된다. 하지만, 녹차로부터 polyphenon 60의 추출은 단 일 카테킨들의 추출보다 용이하기 때문에, 단일 카테킨을 이용하는 것보다 polyphenon 60을 치아우식증 예방을 위 한 가글린 및 치약 등의 구강위생용품 개발에 이용하는 것이 경제적 측면에서 이롭다고 생각된다.

본 연구에서 치아우식증 원인균의 생체막 형성 억제능 력 측정 결과, polyphenon 60의 농도가 5 mg/ml인 경우 100%, 2.5 mg/ml인 경우 약 90% 보였다. 치아우식증의 시 작은 치아 표면에 세균의 부착으로부터 시작되며 부착된 세균이 자라면서 시간이 지남에 따라 다른 종과 복잡한 미생물 군집을 형성하면서 세포외 기질을 포함한 생체막 을 형성하게 된다[21]. 생체막이 한번 형성되면 항균물질에 더 큰 내성을 지니게 되므로[21], 생체막 형성을 억제하는 능력도 항균제로서 중요하다. 본 연구에서 Polyphenon 60 의 생체막 형성 억제능 실험에 crystal violet 염색법을 사 용하였다. crystal violet 염색법은 초기 부착 세균의 총량 을 직접적으로 측정하지는 못하지만 간단하고 쉬우며 생 체막을 정량화하는데 드는 비용이 저렴한 장점이 있다. 본 실험에서는 인공타액을 코팅한 96-well plate를 사용하 였는데, 인공타액을 코팅한 경우 S. mutans가 폴리스티렌 벽에 먼저 부착하는 것을 유의하게 억제한다는 장점이 있다 고 보고되었다[23]. 이상의 연구 결과에 의하면, polyphenon 60은 S. mutans와 S. sobrinus의 생체막 형성을 억제하여 치 아우식증 발생을 억제하는 효능이 있는 것으로 판단된다.

본 연구 결과를 종합하면, Polyphenon 60은 2.5-5 mg/ml 농도에서 치아우식증의 주요한 원인균인 S. mutans 및 S. sobrinus에 대한 항균능 및 이들에 의한 생체막 형성 억제 능을 보임을 확인할 수 있었다. 그러므로 Polyphenon 60 은 향후 치아우식증 예방을 위한 치약 및 양치용액 등의 구강위생용품 개발에 항균 물질로 사용할 수 있을 것으로 생각된다.