서 론

치통은 인류가 감지하는 극심한 동통 중의 하나로서 고대로부터 이를 극복하기 위한 많은 연구가 이루어져 왔 다. 치수는 기계적 자극[1], 화학적 자극[2], 삼투압에 의 한 자극[3], 그리고 온도자극[4] 등 다양한 자극이 가해지 더라도 동통만이 감지됨으로서, 치수를 지배하는 신경은 대다수가 동통을 감지하는 유해성 들신경섬유로 구성되 어 있는 것으로 생각되어 왔다. 치수에서 치아삭제, 상아 질에 가해지는 손상 등에 의해 야기되는 예리한 동통은 작은 말이집 신경섬유인 Aδ 신경섬유를 통하여 전달되 며, 염증 시 야기되는 부위를 정확히 알 수 없는 지속적 인 둔통은 주로 민말이집 신경섬유인 C 신경섬유를 통하 여 전달된다고 알려져 있다.

치아에 class I 치수노출, class V 와동형성과 같은 유해 자극을 가하면, 치수를 지배하는 감각신경섬유의 sprouting 이 야기되며, 아울러 substance P와 CGRP같은 신경펩티드 에 면역양성반응을 보이는 신경섬유의 수가 증가한다[5]. 또한, 흰쥐 아래이틀신경의 자극 시 치수 내의 substance P 의 양이 증가하며, 이와 동반하여 치수혈관의 확장, 단백 질의 혈관 밖 유출 그리고 염증매개물질이 분비되며[6], 이들이 C 신경섬유를 지속적으로 자극함으로써 지속성 동 통이 야기된다. 따라서 치수 내의 신경펩티드는 신경병성 염증의 유발 그리고 염증 시 야기되는 만성 지속성 동통의 야기에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되어지고 있다. Substance P는 삼차신경절 혹은 척수의 뒤뿌리신경절[7, 8] 에서 작거나 중간크기의 세포에서 발현되며, 삼차신경절 에서 축삭이 유래하는 부위인 proximal sensory root에서 민말이집과 작은 말이집 신경섬유에서 발현됨으로서[9] 이는 동통을 전달하는 신경섬유에서 특이성 있게 발현되 는 것으로 보고되고 있다. 지금까지 치수를 지배하는 신 경에 대한 많은 미세구조적 연구결과[10, 11]가 보고되어 왔지만, 염증 시 야기되는 만성지속성 동통 그리고 신경 병성 염증에 관여하는 substance P를 함유하는 치수 내 신 경섬유의 미세구조적 특징에 대해서는 잘 알려져 있지 않 다. 본 연구에서는 이를 밝히고자 사람 치수절편에서 substance P 면역조직화학반응을 실시한 후 광학 및 전자 현미경으로 분석하였다.

재료 및 방법

사람 치수에서 substance P 면역양성 신경섬유 관찰을 위해서 치아 수복물, 치주염과 치아우식이 없는 작은 어 금니를 대상으로 실험을 수행하였으며, 교정치료를 받기 위하여 발거한 치아를 환자의 동의를 얻어 사용하였다. 발치한 후 1시간 이내에 high speed diamond bur를 이용하 여 치아를 세로로 절개하여 치수를 조심스럽게 적출하였 다. 그 후 치수조직을 2시간동안 4% paraformaldehyde (PFA)가 함유된 고정액(0.1 M phosphate buffer; 0.1 M PB, pH 7.4, 4℃)에서 고정하였으며, 진동절편기(vibratome)를 이용하여 80 um 두께의 연속절편을 만들어 4% PFA와 0.01% glutaraldehyde를 함유하는 고정액에 30분간 후고정 을 시행하였다.

이후 각 절편을 0.1 M PB에 여러 번 세척한 다음, 동결 방지를 위하여 30% sucrose (0.1 M PB, pH 7.4) 용액에 넣 어 4℃에서 하루 동안 침적하였다. 다음날, 항체의 조직 내 침투가 용이하도록 절편을 드라이아이스에서 20분간 동결시킨 후, 0.01 M PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)에 신속히 넣어 해동하였다. 그 후, 1% NaBH4에 30분 간 반응시키고, 내인성 peroxidase의 활성을 억제하기 위 해 3% H2O2에서 10분간 반응시켰다. 그 후 10% NDS (normal donkey serum, in 0.01 M PBS)에서 30분간 반응시 킨 다음, 일차항체(rabbit anti-substance P antibody, 1:1000 dilution, ImmunoStar, Hudson, WI, USA)에 실온에서 하루 동안 반응시켰다. 다음날 이차항체(biotin conjugated donkey anti-rabbit antibody, 1:200 dilution, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA)에 실온에서 2시간 반응시킨 다음, 0.01 M PBS로 3회 세척하였으며, ExtraAvidin peroxidase (1:5000 dilution; Sigma, St. Louis, MO, USA)에서 1시간 동안 반응한 후, 0.1 M PB로 세척하고, nikel-intensified 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)로 발색 반응 을 하였다. 이후 0.1 M PB로 여러 번 세척한 다음, 1% osmium tetroxide (0.1 M PB, pH 7.4)에서 1시간 동안 후고 정을 시행하였다. 탈수는 계열 에탄올로, 침투는 propylene oxide로 하였으며, 절편을 두 장의 Aclar plastic film (EMS, Hatfield, PA, USA) 사이에 넣어 Durcupan ACM (Fluka, Switzerland)으로 포매하여 59℃에서 48시간 동안 경화하 였다.

레진으로 포매한 조직을 광학현미경상에서 100-400배 의 배율로 관찰한 다음, substance P 항체에 면역양성반 응을 나타내는 신경다발이 함유되어 있는 절편부위를 취 하여 공레진 막대에 강력접착제로 붙였다. 그 후 연속 초박절편을 형성하여 formvar 지지막을 형성한 단공 grid 위에 얹었으며, 초박절편을 uranyl acetate와 lead citrate로 이중염색을 한 다음 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, Hitachi H-7500, Japan)으로 관찰하였다. Substance P 면역양성반응을 보이는 신경섬유에 대한 광 학현미경사진은 Zeiss Axioplan 2 microscope (Carl Zeiss Gottingen, Germany)에 부착된 Exi digital camera (Q-Image Inc., Surrey, CA, USA)를 사용하여 촬영한 다음, TIFF파 일로 저장하였다. 전자현미경 사진은 투과전자현미경에 부착된 CCD camera (SC1000; GATAN, Pleasanton, CA, USA)와 Digital Micrograph software (GATAN)을 이용하 여 촬영하였으며, TIFF파일로 저장하여 관찰하였다. Substance P 면역양성 신경종말 내에 함유되어 있는 소포 의 직경을 측정하기 위하여 각각의 신경종말에 대해 50,000배로 이미지를 얻은 후 TIFF 파일로 저장하였으며, digitizing tablet과 Image J software (v.1.45; NIH, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 소포의 직경을 측정하였다. 면역 양성 반응의 특이성을 확인하기 위하여 일차항체 혹은 이차항체 대신 정상혈청을 사용하여 동일한 반응을 시행 하였으며, 이때 면역양성반응이 관찰되지 않음을 확인하 였다.

결 과

광학현미경적 관찰에서 치아뿌리부위에서 substance P 면역양성 신경섬유는 다수가 혈관과 함께 다발을 이루어 주행하였으며, 다발 내에서는 거의 분지를 하지 않았다. 치수공간부위에서는 substance P 면역양성 신경섬유다발 이 분지를 하였으며, 일부는 신경섬유 다발에서 벗어나 독립적으로 주행하였다. 치수의 주변부에서도 다수의 substance P 면역양성 신경섬유가 관찰되었으며 일부는 상아질을 향해 주행하였다. Substance P 면역양성 신경섬 유는 치수 속에서 염주알 모양의 팽창부와 이 사이를 잇 는 축삭가닥 형태로 존재하였으며, substance P 면역양성 신경섬유는 치수의 치아뿌리부위, 치수공간부위, 주변부 치수 등 치수의 모든 부위에서 팽창부를 보였다(Figs. 1A-D).

전자현미경적 관찰에서 치수신경섬유는 말이집 및 민 말이집 신경섬유로 구성된 다발형태로 주행하였다. Substance P의 면역반응산물은 전자밀도가 치밀한 형태로 축삭형질에서 관찰되었으며, substance P 면역양성 신경섬 유는 대부분이 민말이집 신경섬유이었으며 말이집 신경 섬유에서 substance P 면역양성반응을 나타내는 경우는 거의 관찰되지 않았다(Figs. 2A-D). Substance P 면역양성 신경섬유는 substance P 면역음성 민말이집 신경섬유와 함께 다발을 이루어 주행하였으며, 이는 Schwann cell sheath에 의해 둘러싸여 있는 경우가 자주 관찰되었다. Substance P 면역양성 신경섬유는 주행 중 염주알 모양의 팽창을 나타내었는데 여기에는 사립체, 다수의 치밀소포 (80-110 nm in diameter)와 많은 구형의 투명소포 (40-50 nm in diameter)가 함유되어 있었다. 팽창부사이를 연결하 는 가는 축삭가닥에서는 연접소포 및 사립체가 거의 관찰 되지 않았다. 또한 축삭의 팽창부위는 혈관에 인접하여 위치하는 경우가 다수 관찰되었으며, 인접한 세포 혹은 혈관 등의 구조물들과 연접을 이루는 경우는 관찰되지 않 았다.

고 찰

본 연구를 통해 밝힌 주된 결과는 다음과 같다. 1) 사람 치수내의 substnace P 면역양성 신경섬유는 팽창부와 이 들을 연결하는 가는 신경으로 구성되어 있으며, 2) substance P 면역양성 신경섬유의 팽창부에는 많은 구형 의 작은 소포와 다수의 큰 치밀소포 그리고 다수의 사립 체가 존재하였다. 이러한 결과는 치수 내의 substance P 면역양성 신경섬유에서 substance P와 glutamate가 함께 분 비될 것이며, 이의 분비는 주로 substance P 면역양성 신 경섬유의 팽창부에서 야기되며, 이는 확산을 통한 비특이 적인 방식에 의해 인접세포, 신경 및 혈관에 영향을 미칠 것임을 시사한다.

신경펩티드인 substance P는 Chang 등[12]에 의해 염기 서열이 분석되었고 Hokfelt 등[13]에 의해 처음으로 면역 조직화학적으로 염색되었다. 이는 일차감각신경세포에서 흥분성 신경전달물질로서 작용하며, 중추신경계[14] 뿐만 아니라 말초신경계[15]에서도 관찰된다. Substance P는 단 핵세포로부터 interleukin-1, interleukin-6 그리고 tumor necrosis factor-alpha와 같은 cytokine을 분비하게 함으로써 [16] 염증 및 면역반응에서 중요한 역할을 수행한다. 본 연구에서 substance P 면역양성 신경섬유는 특징적으로 bouton모양의 팽창부 및 이를 연결하는 민말이집 신경섬 유의 가느다란 축삭가닥으로 구성되어 있었는데, bouton 모양의 팽창부에서는 중추신경계에서의 신경섬유 종말에 서와 같이, 다수의 큰 치밀소포와 소형의 투명한 구형소 포를 함유하고 있었다. Alvarez 등[17]은 원숭이의 척수뒤 뿔 표층부에서 C 신경섬유 종말에 함유된 substance P 및 CGRP가 큰 치밀소포 내에 존재하고 있음을 금입자 면역 전자현미경법을 수행하여 보고한 바 있다. 이를 감안하 면, 본 연구에서 substance P는 치수 내 substance P 면역양 성 신경섬유의 팽창부내에 함유된 큰 치밀소포에 존재할 것으로 생각된다. Substance P 면역양성 신경섬유의 팽창 부에서 큰 치밀소포와 함께 존재하는 구형의 투명한 연접 소포 내에는 어떠한 신경전달물질이 함유되어 있는지 현 재 분명하지 않다. 그러나 중추신경계에서 substance P 면 역양성 신경종말에는 glutamate가 공존한다는 보고[18]와 흥분성 신경전달물질인 glutamate는 구형의 연접소포 내 에 존재한다는 지금까지의 전자현미경적 연구결과[19-22] 를 감안하면, 사람 치수신경의 팽창부에서 큰 치밀소포와 함께 존재하는 구형의 투명한 연접소포에는 신경전달물 질로서 작용하는 glutamate가 함유되어 있을 것으로 생각 된다. 따라서 치수에 열자극 등의 유해성 자극이 가해지면 substance P 면역양성 신경섬유의 팽창부로부터 substance P가 분비되어 혈관확장 및 단백질의 혈관외 유출을 야기 함으로써 신경병성 염증(neurogenic inflammation)을 야기 할 것으로 생각된다. 또한 substance P는 비만세포 등을 자극하여 serotonin등을 분비하게 하거나, 손상된 조직 혹은 혈장에서 bradykinin, prostaglandins, leukotriens, cytokines 등 의 분비를 야기하여 민말이집 C 신경섬유를 자극함으로 서 지속적인 염증성 동통이 중추로 전달되는데 관여할 것 으로 생각된다[23]. 또한 substance P 면역양성 신경섬유가 자극이 되면 substance P의 분비와 아울러 투명한 구형의 연접소포에 함유되어 있던 glutamate가 방출될 것으로 사 료되며, 이는 주변의 여러 세포 및 혈관 내피세포를 자극 하여 염증성 반응을 증가시키거나 혹은 지속적으로 염증 성 반응이 일어나도록 작용할 것으로 생각된다. 이는 민 말이집 신경섬유에 존재하는 것으로 알려진 group I metabotropic glutamate receptors (mGluR1과 mGluR5)와 결 합함으로써[24, 25] 자기 자신이 분비된 신경섬유 및 인접 신경섬유의 팽대부에서 지속적으로 substance P 및 glutamate의 분비를 야기함으로서 염증성 동통이 지속되 거나 증가하는데 기여할 것으로 생각된다. 한편, 염증이 야기된 부위 혹은 손상된 말초신경말단에서 상당히 떨어 진 부위에서도 혈관 확장 등 염증반응이 나타나는데, 이 는 손상된 부위에서의 자극이 축삭반사를 통해 신경분지 부를 지나 인접부위의 신경말단까지 전파되어 그 부위에 서 substance P를 포함한 신경펩티드가 분비되기 때문인 것으로 생각된다.

감각정보의 전달에 관여하는 뒤뿌리신경절 혹은 삼차 신경절 내에 존재하는 일차들신경섬유의 세포체에서 형 성된 여러 물질은 중추신경계뿐만 아니라 말초신경계로 도 운반된다. 특히 substance P 면역양성 신경섬유는 중추 내에서 염주알 모양의 신경섬유종말 및 이를 연결하는 선 모양으로 나타나는데[26, 27] 감각수용기 역할을 하는 치 수에서도 이와 동일한 모습을 나타내었다. 또한 전자현미 경적 관찰에서 치수 내 substance P 면역양성 신경섬유종 말의 형태는 중추신경계에서의 형태와 동일하였다[17]. 그러나 척수 내의 substance P 면역양성 신경섬유종말은 다수의 가지돌기와 연접을 이루어 연접이후 신경세포에 만 신호를 전달하는데 비해[28], 치수에서의 substance P 면역양성 신경섬유의 팽대부는 인접한 세포 및 신경과의 연접구조가 없음으로서 이는 신경전달물질을 인접부위로 방출하여 paracrine 작용에 의해 다수의 주변부 세포, 혈관 혹은 신경섬유에 영향을 미치는 것으로 생각되었다.

매운 고추 성분인 capsaicin을 국소부위에 적용하였을 때 신경병성 염증을 야기하는데[29] 이는 capsaicin이 C 신경섬유에만 선택적으로 작용함으로서 야기된다[30]. 감 각신경을 capsaicin으로 자극 시 중추 및 말초신경 종말에 서 substance P가 방출되며, capsaicin 적용시 나타나는 slow EPSP[31]와 혈관 확장[32] 등은 substance P 길항제의 투여에 의해 억제된다. 또한 고농도의 capsaicin을 투여 시 조직의 substance P 면역양성 반응이 소실되며, 민말이집 신경섬유의 종말이 다수 소실된다고 알려져 있다[33]. 따 라서 다수의 substance P 발현 신경섬유는 민말이집 신경 섬유이며 이에는 capsaicin, 유해열 자극 그리고 염증매개 물질에 의해 반응하는 바닐로이드 수용기 TRPV1이 함께 발현될 것으로 생각되며, 본 연구에서 치수 내에 존재하 는 다수의 substance P 함유 신경종말에서도 TRPV1이 공 존할 것으로 추측된다.