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ISSN : 1226-7155(Print)
ISSN : 2287-6618(Online)

International Journal of Oral Biology Vol.43 No.4 pp.193-200
DOI : https://doi.org/10.11620/IJOB.2018.43.4.193

Effect of Natural Extracts on Oral Care Probiotics Weissella cibaria CMU and Periodontal Pathogens

Ji-Eun Yeu¹, Hyun-Jin Kim², Mi-Sun Kang¹*

¹Research Institute, Oradentics Inc., Seoul 04781, Republic of Korea
²Institute of Biomaterial Implant, Department of Oral Anatomy, School of Dentistry, Wonkwang University, Iksan 54538, Republic of Korea

Correspondence to: Mi-Sun Kang, Research Institute, Oradentics Inc., 1805-ho, 25 Seongsuil-ro-4-gil, Seongdong-gu, Seoul 04781, Republic of Korea Tel: +82-2-2138-2572, Fax: +82-2-2138-2579 E-mail: jieenkang@oradentics.com

Received November 1, 2018 Review November 11, 2018 Accepted December 10, 2018

Abstract

The purpose of this study is to determine if natural extracts could be used as an additive in oral health food made with Weissella cibaria CMU (oraCMU). Natural extracts of green tea, mulberry leaf, licorice, and propolis, which are reported to have antimicrobial activities, were selected and used in this study. The minimum inhibitory concentrations (MIC) of extracts on periodontal pathogens such as Fusobacterium nucleatum and Porphyromonas gingivalis and their synergy effects with oraCMU by the fractional inhibitory concentrations methods were measured. From the results obtained, all the extracts showed no effect on the growth of oraCMU. Green tea extract showed the best antibacterial activity with MIC of 1.8 mg/ml against both F. nucleatum and P. gingivalis. In addition, green tea extract had a synergistic effect with oraCMU against F. nucleatum. Therefore, these results suggested that green tea extract is available as an additive in oral health food made with oraCMU.

Key Words : natural extracts , probiotics , Weissella cibaria , antibacterial , periodontal

초록

키워드 :

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Cited-By

Funding:

National Research Foundation of Korea
2017R1D1 A1B03030952 Ministry of SMEs and Startups

This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

서 론

치주질환은 유병률이 높은 구강질환 중 하나로서 전세 계적으로도 많은 사람들에게 부담을 주는 질환이다 [1]. 치주질환 발병과 관련하여 중요한 역할을 하는 원인균으 로는 Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Prevotella intermedia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans 등이 알 려져 있다 [2]. 최근 치주질환이 제2형 당뇨병, 죽상동맥 경화성 혈관 질환, 신진대사 증후군, 조산 및 저체중 출 산, 폐렴 등 전신질환에 영향을 끼친다는 연구들이 발표 되고 있으며 [3-5], 특히 치주질환을 일으키는 세균이 전 신질환에 영향을 준다고 알려져 있으므로 구강내 세균 관 리의 중요성이 부각되고 있다.

치주질환 치료의 약물요법은 항생제, 항균제 및 항염제로 나눠지고 있다. 항생제는 장시간 사용 시 내성균 발현, 과민 반응 및 위장장애 등의 부작용을 가지고 있다고 알려져 있 다 [6]. 항균제 중 chlorhexidine은 치태 관리에 가장 효과적 이며 경구용으로 전신 독성이 없다고 알려져 가장 널리 사 용되고 있으나 지속적인 사용을 권장하지 않는 이유는 치아 염색 등 외관상의 문제와 미각 이상 및 구강점막의 작열감 등 부작용을 유발한다는 보고가 있기 때문이다 [7]. 또한, 항균제 중의 하나인 불소는 체내에 흡수되므로 치아불소증 을 유발할 수 있다고 보고되고 있다 [8]. 이렇듯 현재까지 주요 치주질환 보조제들은 효과만큼이나 다양한 부작용을 가지고 있으므로, 이를 극복하기 위한 방법으로 최근에는 천연물과 프로바이오틱스 (probiotics)에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다.

녹차 성분인 epigallocatechin gallate (EGCG)는 급진성 치주 염과 관련 있는 것으로 알려져 있는 A. actinomycetemcomitans 에 대해 항균력이 있다고 보고되고 있으며 [9], Min 등 [10] 은 녹차 추출물이 P. intermedia에 의한 잇몸 염증 반응을 효과적으로 억제하였다고 보고하고 있다. 또한, 충치유발세 균인 Streptococcus mutans 바이오필름에 대하여 뽕잎 추출 물이 강력한 억제력을 가지고 있고 미약하지만 Staphylococcus epidermidis와 Staphylococcus aureus에 대해서도 항균활성이 나타난다고 보고되고 있으며 [11,12], 프로폴리스는 Candida albicans, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis 등을 포함한 15종의 구강병원성세균에 대해 모두 항균력을 나타 냈다고 보고되었다 [13]. 감초 뿌리 추출물은 S. mutans에 대한 강한 항균력을 가지며, 바이오필름 형성을 억제한다고 보고되고 있다 [14].

Weissella cibaria CMU, CMS1, CMS2, CMS3는 구강유 산균으로서 본 연구진에 의해서 전체 유전자 서열이 분석 되어 GenBank에 등록되었으며 [15], 국내 최초로 구강건 강을 위한 식품원료로 식약처에 등록되었다. 또한, S. mutans의 바이오필름 형성을 억제하고 치주질환 원인균 A. actinomycetemcomitans, F. nucleatum, P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola의 성장을 억제하며 [16,17], 구취유 발세균에 의한 구취를 억제하는 등 [18] 구강 질환 예방 효과를 가지고 있어 W. cibaria CMU (oraCMU) 및 W. cibaria CMS1 (oraCMS1)은 최근 식품산업에서 구강건강 유산균 (oral care probiotics)으로 상용화되어 사용되고 있다.

구강유산균 W. cibaria를 활용한 여러 가지 구강건강 식품을 개발하기 위해서는 구강유산균의 생장에 영향을 미치지 않으면서 구강 건강에 도움을 주는 부원료에 대 한 연구가 필요하지만 이에 대한 연구는 매우 미비한 상태이다. 따라서, 현재까지 천연추출물의 항균력에 대 한 연구가 많이 되고 있으므로 천연추출물이 구강용 프 로바이오틱스의 좋은 부원료로써 역할을 할 수 있을 것 으로 사료된다. 본 연구에서는 항균력이 있다고 알려져 있는 녹차, 뽕잎, 감초, 프로폴리스 추출물 분말 4종을 선정하여 구강유산균 W. cibaria CMU의 생장에 영향을 주는지를 보고자 하였으며, 또한 치주병원균에 대한 항 균 시너지 효과를 확인하여 구강건강식품의 부원료로서 의 가능성을 검토하고자 하였다.

재료 및 방법

균주 및 배양

본 연구에 사용된 F. nucleatum KCTC 2488, P. gingivalis KCTC 5352는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC, Daejeon, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 그리고 W. cibaria CMU (oraCMU) 는 ㈜오라덴틱스 (Seoul, Korea)에서 보관하고 있는 균주 를 사용하였다. F. nucleatum은 yeast extract (10000 μg/ml) (Difco, Detroit, MI, USA), cysteine (500 μg/ml) (Sigma, St. Louis, MO, USA), hemin (5 μg/ml) (Kisan Bio Co., Ltd., Seoul, Korea), menadione (0.5 μg/ml) (Kisan Bio)을 첨가한 brain heart infusion broth (BHI broth, Difco)에, P. gingivalis 는 hemin (5 μg/ml), menadione (0.5 μg/ml)이 첨가된 TSB Hemin Menadione broth (Kisan Bio)에 각각 접종하여 37℃ 혐기조건 (AnaeroPack-Anaero, Mitsubishi Gas Chemical Co., Tokyo, Japan)에서 48시간 배양하였으며, oraCMU는 De Man, Rogosa, Sharpe broth (MRS broth, Difco)에 접종 하여 37℃ 호기조건에서 16시간 배양하였다. 각각의 균은 실험에 이용하기 전에 본 배지에서 2회 계대배양한 후 실 험에 이용하였다.

천연추출물이 oraCMU의 생장에 미치는 영향

본 연구에 사용된 녹차 추출물 (green tea extract), 뽕잎 추출물 (mulberry extract), 감초 추출물 (licorice extract), 프 로폴리스 추출물 (propolis extract)은 디에스푸드웰 (DS Food Well Co., Ltd., Gunpo, Gyeonggi-do, Korea)에서 제공 받아 냉장보관하면서 실험에 사용하였다. 천연추출물이 구강유산균 oraCMU의 생장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Jeong 등 [19]의 방법에 따라 다음과 같이 실험하 였다. MRS broth 42.5 ml에 oraCMU 배양액 (멸균식염수 로 균 현탁액을 만든 후, 600 nm에서의 흡광도 값을 0.4 로 만든 균액)을 5%로 접종한 후 녹차, 뽕잎, 감초, 프로 폴리스 추출물 분말을 각각 MRS broth에 녹여서 3.13, 6.25, 12.5 mg/ml 농도로 첨가하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 균의 증식 정도를 측정하기 위하여 0, 8, 24시 간 간격으로 배양액을 취한 후 microplate reader (VersaMax, Molecular devices, San Jose, CA, USA)를 이용하여 600 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 추출물 대신 추 출물을 녹일 때 사용한 MRS broth만을 처리하여 동일하 게 측정하였다.

천연추출물의 치주병원균에 대한 항균 효과

천연추출물의 치주병원균에 대한 항균 효과를 확인하기 위하여 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)에 서 제시한 미세희석법 (micro-dilution)을 변형하여 최소억 제농도 (minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하 였다 [20]. 즉, 천연추출물 분말을 각 균의 생장배지에 녹 인 후 0.028, 0.056, 0.11, 0.23, 0.45, 0.9, 1.8, 3.6 mg/ml 농 도가 되도록 각 희석액을 100 μl씩 96-well plate에 분주하 고, F. nucleatum 및 P. gingivalis 배양액을 OD₆₀₀=0.05가 되도록 희석하여 100 μl씩 접종한 후 37℃에서 48시간 동 안 혐기 배양하였다. 대조군으로는 추출물 대신 추출물을 녹인 각 균의 배지를 처리하여 사용하였으며, microplate reader를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.

oraCMU의 치주병원균에 대한 항균 효과

oraCMU 배양액을 원심분리 (5,000 g, 10 min, 4℃)한 후 주사 필터 (0.45 ㎛, Sartorius, Goettingen, Germany)를 이용 하여 무균상청액 (cell-free supernatant; CFS)을 얻은 후 96-well plate에 각 치주병원균의 배지를 이용하여 2배씩 연속적으로 희석하여 62.5 mg/ml (v/v) 까지 분주하였다. F. nucleatum, P. gingivalis는 상기의 방법대로 균 배양액 의 농도를 OD₆₀₀=0.05가 되도록 배지에 희석하여 100 μl 씩 접종한 후 37℃에서 48시간 동안 혐기 배양하였다. 대 조군으로는 CFS 대신 각 치주병원균의 배지를 처리하여 사용하였으며, microplate reader를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.

녹차 추출물과 oraCMU의 항균 시너지 효과

녹차 추출물과 oraCMU의 시너지효과를 확인하기 위하 여 Bonapace 등 [21]의 방법에 따라 FIC (fractional inhibitory concentrations) 지수를 측정하였다. 녹차 추출물을 각 치 주병원균의 배지로 용해시킨 후 3.6 mg/ml부터 2배씩 연 속적으로 희석하여 0.23 mg/ml까지 농도가 되도록 희석하 였다. oraCMU는 상기의 방법대로 얻은 CFS를 250 mg/ml 부터 각 치주병원균의 배지를 이용하여 2배씩 연속적으 로 희석하여 15.63 mg/ml까지 희석하였다. 그 후 96 well plate에 녹차 추출물은 수평축 well에, oraCMU CFS는 수 직축 well에 연속적인 희석액을 50 μl씩 각각 분주하였다. F. nucleatum, P. gingivalis은 상기의 방법대로 균 배양액 의 농도를 OD₆₀₀=0.05가 되도록 배지에 희석하여 각 well 에 100 μl씩 접종한 후 37℃에서 48시간 동안 혐기 배양 하였으며, OD₆₀₀의 변화가 0.05 이하인 농도를 확인하였 다. 대조군으로는 천연추출물과 oraCMU CFS를 처리하지 않은 배지를 이용하였다. FIC 지수는 ΣFIC = (A) / MIC(A) + (B) / MIC(B)의 공식을 이용하여 구하였다. 여 기에서 (A)와 (B)는 병합하여 처리하였을 때 나타나는 A 와 B 각각의 MIC이며, MIC(A)와 MIC(B)는 단독으로 처 리하였을 때 나타나는 각 A와 B의 MIC를 나타낸다. FIC 지수가 ≤ 0.5이면 synergy, > 0.5~1이면 partial synergy, > 1~4이면 indifference, > 4이면 antagonism으로 정의하였다. 또한, 녹차 추출물(0.1 mg/ml)을 처리한 실험군, oraCMU CFS (15.6 mg/ml)을 처리한 실험군, 녹차 추출물(0.1 mg/ml)과 oraCMU CFS (15.6 mg/ml)를 병합 처리한 실험 군 및 무처리군을 대조군으로 하여 위상차현미경을 통해 녹차 추출물과 oraCMU CFS의 치주병원균에 대한 항균 시너지 효과를 확인하였다.

통계처리

천연추출물이 oraCMU의 생장에 미치는 영향 및 oraCMU 의 치주병원균에 대한 항균효과에 대한 통계적 처리는 Mann-Whitney U test를 적용하였다. 또한, 천연 추출물 간 의 항균 효과에 대한 비교 연구는 일원배치 분산분석 (oneway analysis of variance, one-way ANOVA) 후 Ducan’s test 로 사후검정 하였다. 본 연구에 사용된 모든 통계분석은 유의수준 0.05에서 SPSS Version 21.0 (Statistical Packages for Social Science version 21.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하였다.

결 과

4가지 천연추출물이 구강유산균인 oraCMU의 생장에 영향을 주는지 알아보기 위하여 각 추출물을 농도별로 혼 합하여 oraCMU를 24시간 동안 배양한 결과, 추출물의 농 도와 상관없이 대조군과 비슷한 OD₆₀₀값을 나타내었다 (Fig. 1). 치주병원균에 대한 천연추출물의 항균력을 측정 한 결과, F. nucleatum에 대한 녹차 추출물의 MIC는 1.8 mg/ml로 가장 낮았으며, 감초, 뽕잎, 프로폴리스 추출물은 모두 3.6 mg/ml에서 약 50~60%의 항균력을 보였다 (Fig. 2a). 또한, P. gingivalis에 대한 녹차, 감초, 뽕잎 추출물의 MIC는 1.8 mg/ml이었으며, 프로폴리스 추출물의 MIC만 이 3.6 mg/ml이었다 (Fig. 2b). oraCMU의 치주병원균에 대 한 항균력을 측정한 결과, F. nucleatum에 대한 oraCMU CFS의 MIC는 250 mg/ml이었으며, P. gingivalis에 대한 MIC는 125 mg/ml이었다 (Fig. 3). 그리고, 치주병원균에 대한 천연추출물과 oraCMU의 항균 시너지 효과를 확인 하기 위하여 본 연구에서 항균력이 가장 우수한 녹차 추 출물을 이용하여 oraCMU CFS와 함께 각각 농도별로 희 석한 후 병합에 따른 항균 시너지 효과를 확인한 결과 (Table 1), P. gingivalis에 대한 녹차 추출물 및 oraCMU CFS의 병합 MIC는 1.8 mg/ml, 62.5 mg/ml 로 각각 나타났 으며, FIC 지수는 1.5로 산출되어 항균 시너지 효과를 보 이지 않았다. 그에 반해 F. nucleatum에 대한 녹차 추출물 과 oraCMU CFS의 병합 MIC는 각각 0.1 mg/ml, 15.6 mg/ml로서, 단독 처리군에 비하여 모두 18배씩 감소하였 으며, FIC 지수가 0.1로 산출되어 두 시료간의 항균 시너 지를 보였다. 또한, 녹차 추출물과 oraCMU CFS의 F. nucleatum에 대한 항균 시너지 효과를 위상차현미경을 통 하여 관찰한 결과, F. nucleatum을 단독 배양했을 때보다 녹차 추출물과 oraCMU CFS를 병합하여 배양했을 때 F. nucleatum의 수가 확연히 감소하였다 (Fig. 4).

고 찰

치주질환은 치과질환에서 치아우식증과 함께 구강의 2 대 질환 중 하나로 알려지고 있으며, 주로 구강내 유해 세균에 의해 발생하고 있다. 따라서 구강 속에 있는 유해 균을 없애기 위하여 다양한 항생제 및 chlorhexidine, zinc chloride과 같은 구강세정제의 항균작용에 대한 연구가 보 고되고 있으나, 항생제는 내성균의 출현과 같은 부작용이 있으며, 구강세정제의 경우 일시적인 효과는 있지만 구강 내 유익균과 유해균을 가리지 않고 죽여버리므로 장기간 사용시 오히려 부작용을 일으킬 수 있다 [1,6-8,22,23]. 따 라서, 최근에는 화학제재의 대체제로서 천연추출물이나 유산균과 같은 프로바이오틱스의 활용이 연구되고 있다 [24,25].

W. cibaria CMU는 그람양성, 비포자 형성, 비운동성, hetero 유산발효, 카탈라아제 음성 막대모양 유산균으로서, 충치유발균인 S. mutans의 비수용 글루캔을 수용성 덱스트 란으로 전환시켜 충치 발생을 억제한다고 알려져 왔다 [16]. 또한, 과산화수소를 많이 분비하여 여러 치주세균의 생장을 억제하고 구취를 억제하여 국내 (10-0605992) 및 미국 특허등록 (US 7250162B2) 되었으며, 구강상피세포 에 대하여 치주병원균과 경쟁적으로 부착하여 구강에 이 로운 역할을 한다고 보고되고 있다 [26,27]. 특히, 강산을 생성하지 않아 유산균 중에서 충치 유발 위험이 적고 구 강이 건강한 어린이 타액에서 유래되어 구강 정착력이 좋 아 oral care probiotics로서의 조건을 갖추고 있으며 [16,17], 2016년 식약처에 식품 원료로 등록되고 oraCMU 로 상용화되어 국내 최초로 구강유산균 식품에 이용되고 있다.

본 연구에서는 치주병원균에 대한 항균능력을 가진 천 연추출물이 oraCMU가 첨가되는 제품의 부원료로서 사용 가능성이 있는지를 검토하기 위하여 녹차, 뽕잎, 감초, 프 로폴리스 추출물의 영향을 확인하였으며, 실험 결과, 4가 지 추출물 모두 oraCMU 생장에 영향을 미치지 않음을 확 인하였다. 또한, 4가지 추출물의 치주병원균에 대한 항균 력을 측정한 결과, 녹차 추출물이 F. nucleatum에 대해서 농도 의존적으로 항균능력이 있으면서 항균력이 가장 우 수하였으며, P. gingivalis에 대해서는 녹차, 뽕잎, 감초 추 출물이 유사한 항균력을 가졌다. Fournier-Larente 등 [28] 은 strain이 각각 다른 P. gingivalis ATCC 33277, P. gingivalis HW24D1, P. gingivalis W83에 대해서 녹차 추출 물의 MIC가 각각 0.25, 0.5, 1 mg/ml이라고 보고하였으나, 본 연구에서는 F. nucleatum, P. gingivalis 모두 MIC가 1.8 mg/ml로 다소 높게 나타났다. 또한, Park 등 [29]은 여러 조건에서 얻은 뽕잎 추출물의 치주세균에 대한 항균력을 측정하였는데, F. nucleatum에 대하여 128 g/ml이상, P. gingivalis에 대하여 4~128 g/ml 이상의 농도에서 MIC를 나타냈다고 보고하였다. 본 연구에서는 F. nucleatum과 P. gingivalis에 대한 뽕잎 추출물의 MIC가 각각 3.6 mg/ml, 1.8 mg/ml로서 기존 연구와는 차이를 보였다. 또한, Kim 등 [30]은 P. gingivalis KCTC 5352에 대한 프로폴리스의 MIC는 280 mg/ml로 보고하였으며, 이는 본 연구의 결과 보다 높은 농도를 보였다. 이처럼 기존 연구의 결과와의 차이가 나는 이유는 아마도 연구에서 사용된 추출물의 원 산지와 추출 조건 및 추출 용매가 서로 다르며, 실험에 이용된 균주 strain이 서로 다르기 때문이라고 사료된다.

본 연구에서는 여러 치주병원균에 대한 항균력이 있다 고 알려진 oraCMU를 이용하여 oraCMU CFS를 농도별로 희석하여 P. gingivalis 및 F. nucleatum에 대한 항균력을 측정한 결과, 두 균주에 대해서 모두 농도의존적으로 항 균력을 나타냄을 확인할 수 있었으며, F. nucleatum 보다 P. gingivalis의 MIC가 낮은 것으로 미루어 볼 때 oraCMU 는 P. gingivalis에 대해서 더 높은 항균력을 가짐을 알 수 있었다.

현재까지 추출물 간 혹은 추출물과 항생제를 병합하여 항균 시너지 효과를 보는 연구는 많았으나 [31,32], 유산 균과 추출물의 항균 시너지 효과를 확인한 연구는 거의 없었다. 본 연구에서는 F. nucleatum과 P. gingivalis에 대 한 항균력이 가장 우수한 녹차 추출물과 oraCMU CFS를 병합하여 항균 시너지 효과를 측정한 결과, P. gingivalis 에 대해서 FIC 지수가 1.5로서 > 0.5~4 범위에 들기 때문 에 항균 시너지 효과가 나타나지 않은 것으로 판단되었으 나, F. nucleatum에 대해서는 FIC 지수가 0.1로서 ≤ 0.5 범 위에 들기 때문에 두 시료 간의 매우 높은 시너지 효과를 보이는 것으로 판단되었다. 또한, F. nucleatum에 대한 녹 차 추출물과 oraCMU CFS의 항균 시너지 효과를 위상차 현미경으로 관찰한 결과, F. nucleatum 단독 배양했을 때 보다 녹차 추출물과 oraCMU CFS를 병합 배양하였을 때 F. nucleatum의 수가 확연히 줄어든 것을 눈으로 확인할 수 있었다.

향후 연구에서는 P. gingivalis에 대한 항균 시너지 효과 를 나타내지 않으면서 F. nucleatum에 대해서만 항균 시 너지 효과를 나타내는 이유에 대해서 밝히는 연구가 더 필요하며, 구강 질환과 연관된 다른 병원균들에 대해서도 항균 시너지 효과를 보이는지를 밝히는 연구가 필요하리 라 생각된다. 이러한 결과들을 종합해 보면, 녹차 추출물 은 oraCMU의 성장에 큰 영향을 주지 않고 오히려 oraCMU와의 항균 시너지 효과를 나타내므로, 녹차 추출 물과 oraCMU를 병합하여 식품 등 다양한 구강 건강 제품 에 응용가능하며, 각각의 단독 물질보다 병합하여 사용하 였을 때 더욱 강력하게 구강 건강 예방 및 치료 효과를 발휘할 수 있으리라 기대된다.

감사의 글

이 논문은 2018년도 정부 (교육부)의 재원으로 한국연 구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업 (2017R1D1 A1B03030952) 및 2018년도 중소벤처기업부의 기술개발 사업 지원에 의한 연구임 (C0564353).

Figure

Fig. 1.

Effects of various concentrations of natural extracts including green tea (a), mulberry leaf (b), licorice (c), and propolis (d) on the growth of oraCMU. The growth of oraCMU was measured by optical density (600 nm). 0 mg/ml (□); 3.13 mg/ml (■); 6.25 mg/ml (■); 12.5 mg/ml (■). There was no statistically significant difference in the growth of oraCMU according to the concentration of natural extracts at each time. Values are means ± standard deviations of three independent experiments.

Fig. 2.

Growth inhibitory effects of various concentrations of natural extracts including green tea, mulberry leaf, licorice, and propolis against F. nucleatum (a) and P. gingivalis (b). Green tea extract (□); mulberry leaf extract (▩); licorice extract (▧); propolis extract (■). Means with different letters (a-c) above bars are significantly different (p < 0.05). Values are means ± standard deviations of three independent experiments.

Fig. 3.

Growth inhibitory effects of cell-free supernatants of oraCMU against periodontopathic bacteria. The growth of P. gingivalis (□) and F. nucleatum (■) were measured by optical density at 600 nm (OD₆₀₀). *p < 0.05, CFS of oraCMU-treated culture vs. untreated P. gingivalis control; #p < 0.05, CFS of oraCMU-treated culture vs. untreated F. nucleatum control. Values are means ± standard deviations of three independent experiments.

Fig. 4.

Phase-contrast microscopic analysis of antimicrobial synergy of green tea extract and oraCMU. (a) Untreated F. nucleatum control; (b) F. nucleatum with green tea extract (0.1 mg/ml); (c) F. nucleatum with cell-free supernatant (CFS) of oraCMU (15.6 mg/ml); (d) F. nucleatum with green tea extract (0.1 mg/ml) and CFS of oraCMU (15.6 mg/ml). Magnification, ×4000.

Table

Table 1.

Antimicrobial synergistic effect of green tea extract with cell-free supernatant (CFS) of oraCMU against F. nucleatum and P. gingivalis.

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