Introduction

세포사멸(apoptosis)이라는 용어는 1972년 Kerr 등 [1]에 의해서 처 음으로 논문에 사용되었으며 현재까지도 이들의 세포사멸에 대한 개념 및 현상이 이용되고 있다[2,3]. 세포사멸(apoptosis)은 유전학적으로 조절되는 세포사의 한 형태를 의미하며, 일반적으로 발달, 노화, 그리고 조직에서 세포 수를 조절하기 위한 항상성 기전 또는 면역반응과 외부 로부터 손상을 입은 세포를 제거하기 위한 방어 기전으로 발생한다[4]. 그러나 불충분한 세포사멸 혹은 과도한 세포사멸은 여러 질병을 야기 하는 원인 중 하나로써, 세포사멸이 불충분할 경우 암 및 자가면역림프 증식질환(autoimmune lymphoproliferative syndrome)과 같은 비 정상적인 세포의 증식에 의한 질병이 발병하며 과도한 세포사멸이 일어 날 경우 알츠하이머와 파킨슨 같은 신경퇴행성질환이 야기된다[3]. 암 (cancer)은 비정상적인 세포 주기 조절 기작을 갖는 세포가 과다 증식 되어 발병하는 것으로, 세포의 암화(carcinogenesis)가 진행되는 동안 암세포는 세포사멸을 억제하는 기전을 활성화시켜 세포사멸에 대한 저 항성을 획득하여 암의 진행 및 전이를 용이하게 하는 것으로 알려져 있 다[3,5,6]. 그러므로 대부분의 항암제는 세포주기를 정지시켜 세포사멸 을 유도하거나 세포사멸 기전을 활성화시켜 암세포의 증식 및 성장을 억제함으로써 암의 치료제 역할을 수행한다[7-9]. 따라서 암세포의 세 포사멸 유도는 암 치료제의 중요한 특징 중 하나이며 지표이다.

구강암(oral cancer)은 입술, 혀, 치주, 하인두 등 얼굴과 목의 거의 모든 부위에 발병하는 암을 통칭하며, 약 90%가 편평세포 암종(squamous cell carcinoma)이다[10]. 편평세포 암종은 예후가 매우 좋지 않은 것으로 알려져 있으며, 구강 내 혀에 암종이 발생하면 임파절 전이 가 용이하고, 원발부위가 순수한 근육조직으로 이루어져 있어 인접조직 으로의 침윤 또한 용이하여 전이 위험도가 매우 높은 질환이다[11]. 치 료방법으로는 수술이나 방사선 치료 및 cisplatin과 같은 항암제 병행요 법 등이 있지만 이들 항암제의 경우 심한 부작용으로 인해 사용에 제한 을 두고 있다. 따라서 항암제의 부작용을 최대한 감소시키면서 항암 효 과를 유지할 수 있는 항암제 개발 연구가 진행되고 있으며, 그 중 민간 요법에서 치료제로 사용해옴으로써 어느 정도 그 안전성이 인정된 약리 작물을 이용한 항암 연구에 그 노력을 기울이고 있다[12,13].

붉은토끼풀(Trifolium pratense leaves, red clover)은 장미목 콩 과에 속하는 여러해살이풀로, 원산지는 유럽이지만 귀화식물로써 현 재 우리나라에도 잡초 제거용으로 재배되고 있다[14]. 붉은토끼풀에 많 이 함유되어 있는 식물성 에스트로겐은 내인성 17β-estrogen과 구 조적으로 매우 유사하여 이들의 수용체인 ERα 수용체와 ERβ 수용체 에 결합이 가능하여 폐경기 여성에서 발생하는 폐경 증상을 완화시켜 주기 위한 건강기능식품이나 약초의약의 하나의 재료로써 사용되고 있 다[14,15]. 또, 붉은토끼풀 추출물은 유방암 세포주(Michigan cancer foundation-7 [MCF-7], isolated at M D Anderson from a pleural effusion of a patient with invasive ductal carcinoma [MDAMB- 231])의 성장을 억제시키고 세포사멸을 유도한다고 보고되어 있 으나[16] 구강암에서의 항암 효능은 아직까지 밝혀지지 않았다.

본 연구에서는 붉은토끼풀 잎 메탄올추출물(methanol extract of T. pratense leaves, MeTP)에 의한 사람 유래 인두 편평암세포 FaDu에 서의 세포 성장억제 효과 및 그 억제 기전을 밝히고자 하며, 아울러 천 연물을 이용한 항암제 개발 후보물질로써의 기초를 제공하고자 한다.

Materials and Methods

1. 실험재료

국내산 붉은토끼풀 잎을 광주 채취하여 메탄올 추출한 후 동결건 조 시켜 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 사용하였다. Live/ Dead^TM Viability/Cytotoxicity Kit는 Thermo Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)와 4’6-diamidino- 2-phenylindole (DAPI)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 1차 항체인 cleaved caspase-9, -3, -7, poly (adenosine diphosphate ribose [ADP]-ribose) polymerase (PARP), Bcl-2, 및 Bax는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, α-tubulin은 Invitrogen (Camarillo, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

2. MeTP 추출

붉은토끼풀 잎 10 g을 메탄올 400 mL에 24시간 동안 추출하고 거 름종이를 이용하여 추출액을 거른 뒤 감압 농축하였다. 동결건조 후 분 말 추출물을 DMSO에 200 mg/mL로 녹여 filtering한 후 –20℃에 보 관하였으며 세포배양액에 희석하여 사용하였다.

3. 세포 배양

사람 인두 편평암세포 FaDu (CCL-17^TM; ATCC, Manassas, VA, USA)는 10% fetal bovine serum (FBS; iNtRON biotechnology, Sungnam, Korea) 및 항생제(100 U/mL penicillin, 100 U/ mL streptomycin)가 함유된 minimum essential medium (MEM; Welgene, Gyeongsan, Korea)을 이용하여 5% CO₂, 37℃ incubator 조건하에서 배양하면서 실험에 이용하였다.

4. 세포 성장률 분석

12 well 세포 배양 접시에 well 당 2 × 10⁵개의 FaDu 세포를 접종 하여 18시간 배양한 후, 붉은토끼풀 잎 메탄올 추출물(MeTP)을 다양 한 농도(0.125, 0.25, 0.5, and 1 mg/mL)로 세포 배양액에 희석하여 처리한 다음 24시간 동안 추가 배양하였다. MeTP에 대한 FaDu 세포 의 생존율은 MTT assay 기법을 이용하여 측정하였다. 추출물 반응 후 배양액을 제거하고 PBS로 두 번 세정한 다음, 900 μL MEM 배양액과 100 μL MTT (5 mg/mL) 용액을 첨가하여 37℃의 5% CO₂ 배양기에 서 4시간 반응하였다. 반응 후, 배양액을 제거하고 DMSO로 formazan 염을 녹여내어 ELISA reader (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 570 nm 흡광도에서 세포 생존율을 측정하였다. 결과 분석은 시료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도를 생존율 100%로 하고 시료를 처리한 실험군의 흡광도를 대조군과 비교하여 백분율(%) 로 표시하였다.

5. Colony formation 측정

6 well 세포 배양 접시에 well 당 2 × 10³개의 FaDu 세포를 접종하 여 18시간 배양한 후, FaDu 세포에 대한 MeTP의 non-cytotoxicity 농도(0.125 mg/mL)와 cytotoxicity를 유도하는 가장 낮은 농도(0.25 mg/mL)를 24시간 동안 처리하였다. 그리고 난 후, 3일마다 배양액을 교체하면서 10일 동안 배양하였다. 배양 후, 배양액을 제거하고 PBS로 가볍게 세정한 다음 95% 에탄올을 이용하여 10분간 고정하였다. 고정 후 말린 다음 0.1% crystal violet 용액을 첨가하여 10분간 염색하였 다. PBS로 염색되지 않은 부분을 제거한 후 Canon PowerShot G16 (Canon, Tokyo, Japan)으로 형성된 colony를 관찰하였다.

6. Live & dead assay

4-well chamber slide (SPL, Pocheon, Korea)에 well 당 1 × 10⁵ 개의 FaDu 세포를 접종하여 18시간 배양한 후, 0.25, 0.5와 1 mg/ mL의 MeTP를 처리하여 24시간 동안 반응하였다. 반응 후 배양액 을 제거하고 PBS로 세정한 다음, PBS에 Calcein-acetoxymethyl과 Ethidium homodimer-1을 1:1 혼합한 혼합액을 각 well에 500 μL 첨가하여 37℃ incubator에서 20분간 반응하였다. 염색약을 제거하고 mounting하여 형광현미경(Eclipse TE2000; Nikon Instruments, Tokyo, Japan)을 이용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 관찰하였다.

7. DAPI 염색

4-well chamber slide (SPL, Pocheon, Korea)에 well 당 1 × 10⁵ 개의 FaDu 세포를 접종하여 18시간 배양한 후, 0.25, 0.5와 1 mg/ mL의 MeTP를 처리하여 24시간 동안 반응하였다. 반응 후, PBS로 가 볍게 세정한 다음 4% paraformaldehyde를 이용하여 10분간 고정하 고 DAPI (300 nM)를 첨가하여 5분간 염색하였다. 염색한 FaDu 세포 를 형광현미경(Eclipse TE2000; Nikon Instruments, Tokyo, Japan) 을 이용하여 핵의 형태와 염색질의 분절화를 관찰하였으며, 핵이 응축되어 크기가 작고 염색질이 조각나 있거나 막 투과성이 비정상적으 로 증가되어 핵 염색이 진하게 되었을 때 세포사멸이 일어난 세포로 판 단하였다.

8. 유세포 분석

6 well 세포 배양 접시에 well 당 4 × 10⁵개의 FaDu 세포를 접종하 여 18시간 배양한 후, 0.25, 0.5와 1 mg/mL의 MeTP를 처리하여 24시간 동안 반응시킨 뒤, 부유세포 및 plate에 붙어있는 세포를 모두 수확하였다. PBS로 세포를 두 번 세척한 후 1X binding buffer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 100 μL를 첨가하여 세포를 suspension한 다음, 400 μL의 1X binding buffer에 Annexin V-FITC 와 propidium iodide (PI)가 1:1로 혼합된 혼합액을 추가 첨가하여 10 분간 세포를 염색하였다. FC500 flow cytometry analyzer (Beckman Coulter Inc., Indianapolis, IN, USA)를 이용하여 10,000개의 세포에 대해 유세포분석을 수행하였으며 분석은 cell quest를 사용하여 apoptosis 각 단계에 있는 세포 수를 계측하였다.

9. Western blot 분석

6 well 세포 배양 접시에 well 당 4 × 10⁵개의 FaDu 세포를 접종하 여 18시간 배양한 후, 0.25, 0.5와 1 mg/mL의 MeTP를 처리하여 24 시간 동안 반응시킨 뒤, 부유세포 및 plate에 붙어있는 세포를 모두 수 확하였다. 세포를 PBS로 두 번 세정한 다음, total protein을 분리하기 위해 protein lysis buffer (iNtRON biotechnology)를 이용하여 매 5 분마다 vortexing하면서 30분간 반응 후, 13,000 × g에서 15분간 원 심분리하였다. 상등액을 취하여 얻은 total protein은 Pierce^TM BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific)을 이용하여 정량하였다. 20 μg 단백질을 5X sample buffer와 혼합하여 100℃에서 5분간 변성시 킨 뒤, 10% 혹은 15% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis에서 전기영동한 후, polyvinylidene fluoride membrane으로 이동시켰다. Membrane은 5% blocking solution (5% bovine serum albumin in tris-buffered saline [TBS] containing 0.1% Tween-20)에서 30분 동안 blocking하고, 일차항체인 cleaved caspase-9, cleaved caspase-3 cleaved caspase-7, cleaved PARP, Bax, Bcl-2는 1:1,000으로 희석하고, α-tubulin은 1:2,500 으로 희석하여 4℃에서 overnight 반응하였다. 이후, TBS-with Tween 20 (TBS-T)로 15분씩 세 번 세척한 다음, horseredish peroxidase가 접합된 이차항체로(1:5,000) 1시간 반응 한 다음 TBS-T로 15분씩 세 번 세척하였다. 결과 분석은 ECL kit (Millpore, Burlington, MA, USA)을 이용하여 MicroChemi 4.2 (DNR Bio-Imaging Systems Ltd., Neve Yamin, Israel)를 통해 protein band를 가시화하였 다. 각 밴드는 Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 그래프화 하였다.

10. 실험자료의 통계학적 검정

모든 실험성적은 mean ± standard deviation으로 나타내었고, 각 실험 군 간의 유의성 검정은 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 이용하여 Tukey t-test를 하였으며, p-value가 0.05 미만(p ＜ 0.05)의 경우에서 통계적 유의성이 있는 것 을 간주하였다.

Results

1. MeTP에 의한 FaDu 암세포의 증식 억제

MeTP가 구강암세포 FaDu 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT assay를 수행하였다. MeTP를 0.125, 0.25, 0.5 및 1 mg/mL 로 24시간 동안 처리하였을 때, 농도 의존적으로 FaDu 암세포의 증식 이 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 1A). 이러한 증식 억제 효과가 FaDu 암세포의 무제한 재생(증식) 능력 또한 억제할 수 있는지를 colony formation 분석을 통해 평가하였다. 세포 독성을 나타내지 않는 0.125 mg/mL과 세포 독성을 나타내는 가장 낮은 농도 0.25 mg/mL을 FaDu 암세포에 24시간 동안 처리한 후, 3일마다 10% FBS가 함유된 정규 배양액으로 교체해주면서 10일 동안 배양하였다. 이후, crystal violet 염색을 이용하여 형성된 콜로니를 분석한 결과, 대조군과 비교 하여 0.25 mg/mL를 처리한 실험군에서 거의 완전하게 FaDu 암세포 의 콜로니 형성을 저해하였으며, 세포독성이 없는 0.125 mg/mL에서 도 콜로니 형성이 저해되는 것을 확인하였다(Fig. 1B). 이러한 결과는 MeTP가 FaDu 암세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있음을 시사한 다. 통계적으로 유효한 증식 억제 효과를 나타내는 최소 투여량은 0.25 mg/mL이었으므로, 이후 모든 실험은 0.25, 0.5 및 1 mg/mL로 24 시간 동안 처리하여 수행하였다.

2. Live & dead 염색을 이용한 MeTP에 의한 FaDu 암세포 의 세포사멸

MeTP에 의한 암세포 증식 억제 효과가 세포사멸과 관련이 있는지 확 인하기 위해 live & dead assay를 수행하였다. FaDu 암세포에 MeTP 를 0.25, 0.5 및 1 mg/mL로 24시간 동안 처리한 후 live-dye와 dead-dye를 동시에 염색하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 관찰하였 다. 실험 결과, 대조군보다 0.25, 0.5 및 1 mg/mL의 추출물을 처리한 실험군에서 농도-의존적으로 살아있는 세포를 나타내는 녹색형광은 점 차 감소하였으나 죽은 세포를 나타내는 붉은 형광은 점차 많아지는 것 을 확인하였다(Fig. 2). 이는 MeTP에 의한 FaDu 암세포의 증식 억제 가 세포사멸과 관련이 있음을 시사한다.

3. DAPI 염색을 이용한 MeTP에 의한 FaDu의 세포핵 형태 변화

Live & dead assay 결과를 통해, MeTP가 FaDu 암세포의 세포사 멸에 관여한다는 결과를 확인하였으므로, 세포사멸의 특징 중 하나인 핵의 형태학적 변화를 관찰하기 위해 DAPI stain을 수행하였다. DAPI 분자는 세포 내 핵에 특이적으로 결합하는 형광물질로, 세포사멸이 유 발되었을 때 세포질의 위축과 염색질의 응축 등 핵의 형태학적 변화를 확인할 수 있다. FaDu 암세포에 MeTP를 0.25, 0.5 및 1 mg/mL로 24시간 동안 처리한 후 DAPI 염색을 한 결과, 0.25 mg/mL를 처리한 실험군에서는 대조군과 큰 차이가 없었으나, 0.5와 1 mg/mL을 처리 한 실험군에서 세포질의 위축과 염색질의 응축을 확인하였다(Fig. 3).

4. 유세포분석을 이용한 MeTP에 의한 FaDu의 세포사멸

MeTP에 의한 FaDu 암세포의 세포사멸을 정량하기 위해 annexin- V와 PI를 이용하여 유세포분석을 수행하였다. 세포 안쪽 막에 위치하 고 있는 phosphatidylserine (PS)은 세포사멸 진행 시 flips 현상을 보 이므로 PS와 강한 친화력을 가지고 있는 annexin-V를 처리함으로써 세포사멸이 진행되는 세포를 관찰할 수 있다. FaDu 암세포에 MeTP 0.25, 0.5 및 1 mg/mL를 24시간 동안 처리한 결과, 전체 세포사멸 비 율(early apoptosis + late apoptosis)이 대조군은 0.6%이였던 반면, 0.25 mg/mL에서 그 비율이 13.1%, 0.5 mg/mL에서 23.7%, 그리 고 1 mg/mL에서 77.1%로, 추출물의 농도가 증가할수록 세포외막으 로 돌출된 PS와 결합한 annexin-V-FITC가 증가하는 것을 확인하였다 (Fig. 4). 이러한 결과는 MeTP에 의한 FaDu 암세포의 세포사멸을 유 도하였음을 시사한다.

5. MeTP에 의한 세포사멸관련 단백질 발현 유도

Caspase는 세포사멸을 수행하는 단백질 효소로, 이들 단백질의 활 성 여부는 세포사멸을 평가하는데 중요한 지표가 된다. 따라서 MeTP 에 의한 FaDu의 세포사멸이 caspase의 활성과 관련되어있는지 확인 하기 위해 cleaved caspase의 발현을 분석하였다. FaDu 암세포에 MeTP 0.25, 0.5 및 1 mg/mL를 24시간 동안 처리한 결과, cleaved caspase-9, cleaved caspase-3 및 cleaved caspase-7의 발현을 확인하였으며, PARP의 가수분해가 일어남으로써 cleaved PARP의 발 현이 유도됨을 확인하였다(Fig. 5). 또한, 미토콘드리아 막에서 세포사 멸을 조절하는 Bcl-2 family 단백 발현을 확인한 결과, MeTP를 처리 한 실험군에서 anti-apoptotic 인자인 Bcl-2의 단백 발현이 감소하였 으며 pro-apoptotic 인자인 Bax의 단백 발현이 증가됨을 확인하였다 (Fig. 5).

Discussion

붉은토끼풀(T. pratense)은 콩과에 속하는 여러해살이풀로 여러 나 라의 민속의약(folk medicine)에서 천식, 기침 치료제 및 진통제로써 오랫동안 사용되어 왔으며, 현재는 이 식물에 많이 함유되어 있는 식물 성 에스트로겐으로 인해 폐경기 여성의 폐경기 증상 완화를 위한 재료 로써 사용되고 있다[14,17-19]. 오랫동안 민속의약 소재로써 사용되어 왔음에도 불구하고 최근 항암(유방암세포 및 다형교모세포종) 및 항염 증에 대한 연구 이외에 이 식물의 생리활성에 대한 이용가능한 과학적 인 자료가 매우 부족하다[14]. 따라서 본 연구에서는 T. pratense의 구 강암에서 생리활성 연구를 위해 에탄올 추출보다 생리 활성물질인 비극 성 물질이 더 넓은 범위에서 추출될 수 있는 메탄올 추출을 이용하였으 며 추출 후에는 회전증발장치와 동결건조기를 이용하여 추출용매를 모 두 증발시킨 후, 사람 인두 편평암세포 FaDu의 성장 억제효과 및 그 분 자적 기전을 연구하였다.

MeTP를 FaDu 암세포에 다양한 농도로(0.125, 0.25, 0.5, and 1 mg/mL) 24시간 동안 처리한 후 MTT assay 기법을 이용하여 세포 성 장 억제효과를 확인한 결과, 0.25 mg/mL부터 농도-의존적으로 유의 미한 세포 성장 억제효과를 보였다. 또, MeTP를 FaDu 암세포에 24시 간 동안 처리 후 10일 동안 추가 배양하여 콜로니 형성능력(암세포의 재생능력)을 분석한 결과 0.125 mg/mL는 24시간 동안에 세포독성이 없는 농도임에도 불구하고 대조군에 비해 콜로니 형성이 억제되었으며, 0.25 mg/mL를 처리한 실험군에서는 콜로니 형성이 완전히 억제되었 다. 이러한 결과는 유방암 세포주에 MeTP를 처리하였을 때의 성장 억 제효과와 비슷한 결과로, Khazaei의 연구팀은[20] 에스토로겐 수용 체 음성 세포주인 MCF-7과 에스트로겐 수용체 양성 세포주인 MDAMB- 231에 붉은토끼풀 잎 에탄올추출물을 처리한 결과, 시간과 농도- 의존적으로 세포 성장을 억제시켰으며, 에스트로겐 수용체 양성 세포주 (MDA-MA-231, half maximal inhibitory concentration [IC₅₀]; 6.8 mg/mL)보다 음성 세포주(MCF-7, IC₅₀; 0.7 mg/mL)에서 추출물에 더 민감하게 반응함을 확인하였다. FaDu 암세포에 대한 MeTP의 IC₅₀ 값은 0.87 mg/mL이었으며, 이는 붉은토끼풀 잎 에탄올추출물의 에스 트로겐 수용체 음성 암세포에 대한 IC₅₀값과 유사하다. 에스트로겐 수 용체 유무에 따라 상이하게 다른 TP의 항암 활성은 더 많은 세포주에서 의 비교 연구가 필요하다고 사료되며, 이는 차후 에스트로겐 음성 암세 포주에 대한 선택적 항암제 개발의 후보로써의 가능성이 있음을 시사한 다. 또, 이 연구팀은 정상세포인 fibroblast에서의 세포 생존율을 MTT assay를 통해 분석하였으며, 그 결과 추출물을 24시간 동안 처리했을 때 IC₅₀ 값은 2.392 × 10⁵ mg/mL로 암세포에 선택적인 성장억제 효 과를 나타낼 수 있음을 시사한다[16].

MeTP에 의한 FaDu 암세포 성장억제 효과가 세포사멸에 의한 것인 지 알아보기 위해 live & dead assay와 DAPI stain을 수행한 결과, 추 출물의 농도가 높아질수록 죽은 세포를 의미하는 붉은 형광이 많아지는 것을 확인하였으며, DAPI 염색에서도 세포사멸의 특징인 핵의 응축과 염색질의 위축 등이 관찰되었다. 이러한 MeTP에 의해 유도된 세포사멸 의 정도를 정량화하기 위해 annexin-V와 PI 염색을 이용하여 유세포분 석을 수행하였다. 그 결과, 세포사멸이 유도된 비율이 대조군(0.64%) 과 비교할 때, 0.25 mg/mL를 처리한 실험군은 13.1%, 0.5 mg/mL 에서는 23.7% 그리고 1 mg/mL에서 77.1%로, 농도-의존적으로 증 가함을 확인하였다. 이는 다른 암세포에서 MeTP에 의한 성장억제 기 전 연구결과와 일치하는 것으로, 다형교모세포종(glioblastma multiform) 암세포 및 유방암 세포주(MCF-7, MDA-MB231)에 붉은토끼 풀 잎 에탄올추출물을 처리하자 autophagy를 유도하면서 농도-의존적 으로 세포사멸이 유도되는 것을 acridine orange/ethidium bromide double staining와 TUNEL staining을 통해 확인하였다[16,20]. 이 러한 암세포의 세포사멸 유도는 항암제 개발에 유용한 전략으로, 많은 연구팀들은 다양한 물질들에 의한 암세포들의 세포사멸 유도 및 그 기 전을 연구하고 있다[16,20-22]. Deng의 연구팀[21] 역시 석류나무 껍질 에탄올 추출물을 이용하여 전립선 암 세포주인 DU145, PC3 및 TRAMP-C1의 MTT assay와 colony formation을 통해 성장 억제효 과를 분석하였으며 Hoechst 33258 염색을 통해 세포 핵 형태 변화를 분석하여 세포사멸 유도를 관찰함으로써 석류나무 껍질 에탄올추출물 의 항암제 개발을 위한 후보물질로써 그 가능성을 제시하였다.

세포사멸은 내인성 및 외인성 신호전달체계를 통해 매개되는 것으로 잘 알려져 있다[23,24]. 외인성 경로는 death-receptor에 리간드가 결합하여 유발되는 것으로 caspase-8의 cleavage가 유도되고 이어 서 caspase-9, -3 및 -7이 cleavage된다. 궁극적으로, DNA repair 기능을 하는 PARP의 절단이 유도되어 세포사멸이 일어나며 이러한 caspase의 활성은 미토콘드리아에 의해 매개되는 내인성 세포사멸 신 호체계 또한 활성화시킨다[3,23,24]. 내인성 경로는 DNA 손상 및 세포 생존 요인의 결핍 등과 같은 신호에 의해서 활성화되어 세포사멸을 유 도하는 것으로 알려져 있다[24,25]. 따라서 본 연구에서, MeTP에 의한 FaDu의 세포사멸의 분자적 기전을 확인하기 위해 caspase의 활성 여 부를 Western blotting을 통해 분석한 결과, 추출물을 처리한 실험군 에서 caspase들의 proteolytic cleavage 현상을 확인하였으며, PAPR 의 cleavage 현상을 확인하였다. 또, 내인성 세포사멸 인자인 Bcl-2 와 Bax의 단백발현을 확인한 결과, anti-apoptotic 분자인 Bcl-2의 단 백발현이 농도-의존적으로 감소하였으며, pro-apoptotic 분자인 Bax 의 단백발현이 증가함을 확인하였다. MeTP에 의한 세포사멸 기전은 유방암 세포주와 다형교모세포종의 세포사멸 기전과 일치하는 것으로, Khazaei 연구팀은[16,20] MCF-7, MDA-MB-231 및 glioblastoma multiforme 세포에서 붉은토끼풀 잎 에탄올추출물에 의해 autophagy 를 조절하는 인자인 BECN1, ATG-7 및 LC3의 발현이 증가되는 것을 확인하였으며, 세포사멸을 조절하는 인자인 caspase-3의 활성을 확인 하였다. 위의 실험결과들은 MeTP에 의해 유도된 FaDu 암세포의 성장 억제가 caspase의 활성을 통한 세포사멸에 의해 매개되어 있음을 시사 한다. 그러나 MeTP가 유도하는 구강암세포 성장억제에 대한 다양한 세 포 및 기전 연구가 더 필요하다고 사료되며, 항암효과에 대한 다양한 현 상 및 기전 역시 추구되어야 한다고 사료된다.

결론적으로, 본 연구에서 MeTP가 FaDu 암세포에서 caspase 신호 전달체계를 통해 세포사멸을 유도하여 구강암 세포성장을 억제시킬 수 있음을 확인하였으며, 이는 천연 항암 후보물질로써 구강암 항암제로서 개발을 위한 하나의 방향을 제시할 수 있을 것으로 판단된다.