Introduction

최근 한국인의 구강에서 그람 양성 혐기성 세균 종인 Peptoniphilus mikwangii가 새로운 종(species)으로 확립되어 소개되었다[1]. 하지 만 아직까지 P. mikwangii와 치아우식증이나 치주질환 등과 같은 구 강 세균 감염성질환과의 상관관계에 대한 연구는 없는 실정이다. 이러 한 점을 고려하여, 최근 16S ribosomal RNA 유전자(16S rDNA) 핵산 염기서열을 바탕으로 P. mikwangii 종-특이 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 프라이머가 개발되어 소개되었다[2].

구강 세균 감염성질환과 특정 세균 종간의 역학관계를 연구하기 위해 서는 세균 종을 특이적 검출할 수 있는 방법이 확립되어야 한다. 또한, 임상에서 적용 가능해야 한다. 즉, 짧은 시간에 많은 수의 샘플에서 특 정 세균 종을 검출해야 하기 때문에 종-특이성 뿐만 아니라 신속성, 정 확성 및 경제성이 확보되어야 한다. 현재까지 개발된 여러 세균 검출법 중에서 위에서 언급한 임상에서 적용이 가능한 것이 PCR 법이라고 생 각된다. 일반적인 PCR 법으로는 특정 세균 종을 정성적으로 검출할 수 있지만, 정량적으로의 분석은 어렵다. 이러한 문제점을 해결할 수 있는 방법이 바로 정량 실시간 중합효소연쇄반응 (quantitative real-time PCR, qPCR) 법이다.

PCR 또는 qPCR을 수행하기 위해서는 특정 표적 유전자를 선정하여 검출하고자 하는 세균 종에 특이적인 프라이머 개발이 선행되어야 한 다. 이러한 목적으로 가장 많이 사용되는 표적 유전자는 16S rDNA이 다. 그 이유는 16S rDNA는 모든 세균 종에 존재하고, 세균 종 간에 핵 산염기서열 부분에 상동성이 매우 높은 부분과 상이한 부분이 반복적으 로 존재하여, 모든 세균 종을 검출할 수 있는 프라이머와 종-특이 프라 이머 설계하기가 용이하다는 장점이 있기 때문이다[3,4]. 그러므로, 본 연구는 16S rDNA 핵산염기서열을 바탕으로 P. mikwangii를 종-특이 적 및 정량적으로 검출할 수 있는 qPCR 프라이머를 개발하기 위해 시 행하였다.

Materials and Methods

1. 세균 및 세균 배양

본 연구에서 사용된 P. mikwangii 및 대조군으로 이용된 세균 균주 들은 Table 1과 같다. 이 균주들은 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology [KCOM], Gwangju, Korea), 한국 생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures [KCTC], Biological Resource Center, Jeongeup, Korea), ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) 또는 CCUG (Culture Collection, University of Göteborg, Göteborg, Sweden)에서 구입하여 사용하였다.

Streptococcus spp. 및 Neisseria mucosa 균주들은 brain heart infusion (BHI; Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) 배지를 이용하여 배양하였다. Aggregatibacter actinomycetemcomitans 균주는 tryptic soy broth (TSB; Difco Laboratories Inc.)에 0.6% yeast extract, 5% horse serum, 75 μg/mL bacitracin 및 5 μg/ mL vancomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 첨가 된 배지[5]를 이용하여 배양하였다. Treponema denticola 균주는 1494 modified NOS medium (https://www.atcc.org/~/media/ C14CA5B6B5D246A6B8073D6894BFE5EB.ashx; ATCC), 그 외 균주들은 TSB에 0.5% yeast extract, 0.05% cysteine HCl-H2O, 0.5 mg/mL hemin 및 2 μg/mL vitamin K1이 첨가된 배지[5] 등을 이용하여 배양하였다. 이들 모든 균주들은 산소 유입이 차단되고, 혼 합가스(85% N2, 10% CO₂, 5% H2)가 공급되는 혐기성 세균배양기 (Bactron I; Sheldon Manufacturing Inc., Cornelius, OR, USA)를 이용하여 37℃ 조건에서 배양하여 다음의 실험에 사용하였다.

2. quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) 프라이머 설계 및 종-특이성 검증

P. mikwangii를 검출하기 위한 종-특이 qPCR 프라이머 쌍은 16S rDNA (GenBank accession no. KJ728812)를 표적으로 설계하 였으며, 이때 PrimerSelect 프로그램(DNASTAR Inc., Madison, WI, USA)을 이용하였다. 설계된 qPCR 프라이머 쌍은 다음과 같다; RTB134-F4, 5′-AAG TCG AGC GAT GAA AAG G-3′; RTB134- R4, 5′-CTT CCC ATA GGA CAG AGC C-3′. 이들 프라이머 쌍 에 의해 생성이 예상되는 PCR 산물 크기는 408 bp이며, Bioneer 사 (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 제작하였다.

본 연구에서 PCR 및 qPCR의 주형으로 사용될 P. mikwangii를 비 롯한 모든 균주들의 지놈 DNA들은 cetyltrimethylammonium bromide 방법에 따라 추출하였다[6].

P. mikwangii에 대한 종-특이 qPCR 프라이머의 개발을 위해 설계 된 RTB134-F4/RTB134-R4 프라이머 쌍들의 종-특이성은 P. mikwangii 표준균주와 2개의 임상균주, 6종의 Peptoniphilus spp. 표 준균주들 및 20종의 구강 내 세균 종들의 지놈 DNA를 주형으로 일반 PCR 법으로 조사하였다. 이때 Bioneer 사의 AccuPower® PCR Pre- Mix 및 MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응 용액에는 최종 1 pmole/μL씩의 RTB134-F4/ RTB134-R4 프라이머들 및 4 ng의 세균 지놈 DNA를 넣어서 반응시 켰다. 종-특이 검증을 위한 PCR 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 10 분간 전변성 처리하였고, 95℃에서 10초간 변성, 56℃에서 20초간 결 합, 72℃에서 20초간 중합 과정을 30회 시행하였으며, 72℃에서 10분 간 최종 중합과정을 시행하였다. PCR 산물은 1.5% 아가로스 젤을 매 질로 하여 전기영동 하였고, GoodView^TM Nucleic Acid Stain (SBS Genetech Co., Ltd., Beijing, China)을 이용하여 증폭물을 염색한 후, 이를 UV transilluminator를 이용하여 관찰하였다.

3. quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)을 이용한 민감도 조사

P. mikwangii -특이 qPCR 프라이머 쌍(RTB134-F4/RTB134- R4)의 민감도(최소 검출한계)는 qPCR 법으로 측정하였다. 이때 TOPreal TM qPCR 2X PreMix (Enzynomics, Daejeon, Korea) 및 Exicycler TM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block (Bioneer)을 이 용하여 실시하였다[7]. qPCR 반응을 위해, 60 pmoles의 RTB134- F4와 RTB134-R4 프라이머, 40 ng에서 4 fg까지 10배씩 희석된 P. mikwangii KCOM 1628^T 지놈 DNA를 각각의 qPCR 2X PreMix 가 들어 있는 PCR tube에 넣고, 최종 반응물이 50 μL가 되도록 멸균 된 이차 증류수를 첨가하였다. 이를 교반기를 이용하여 잘 혼합한 다음, 2,500 rpm에서 10초간 원심분리하였다. qPCR 조건은 다음과 같았 다: 95℃에서 10분간 전변성 처리한 후, 95℃에서 10초간 변성, 56℃ 에서 20초간 결합, 72℃에서 20초간 중합 과정을 40회 반복하였다. 그 후 melting curve를 얻기 위해 60–94℃에서 1℃씩 1초간 형광도를 측정하였다.

Results

본 연구에서 P. mikwangii를 검출하기 위해 설계된 qPCR 프라이 머 쌍(RTB134-F4/RTB134-R4)의 종-특이성을 일반 PCR법으로 조 사한 결과, P. mikwangii 균주(KCOM 1628^T, KCOM 1637, KCOM 1641)에서만 예상하였던 408 bp의 PCR 증폭물이 확인되었다(Fig. 1). 또한, 본 연구에서 대조군으로 사용된 6종 Peptoniphilus spp. 표 준균주들 및 20종 구강 세균 균주들의 지놈 DNA에서는 PCR 산물이 증폭되지 않았다(Fig. 1).

P. mikwangii -특이 qPCR 프라이머 쌍(RTB134-F4/RTB134- R4)의 민감도를 측정하기 위해 P. mikwangii KCOM 1628^T의 지 놈 DNA를 이용하여 qPCR을 수행하였다. 그 결과 RTB134-F4/ RTB134-R4 프라이머 쌍은 P. mikwangii KCOM 1628^T 지놈 DNA 40 ng부터 40 fg까지 검출할 수 있었다(Table 2 and Fig. 2).

RTB134-F4/RTB134-R4 프라이머 쌍에 의한 P. mikwangii KCOM 1628^T 지놈 DNA 상의 표적 유전자인 16S rDNA 이외의 영역 을 주형으로 하는 비특이적 PCR 산물이 증폭 되었는지를 알아보기 위 하여 melting curve 분석을 실시하였다. 그 결과, melting curve가 단 일한 패턴을 보였으며, 온도 변화에 따른 형광 감도의 또 다른 peak가 보이지 않았다(Fig. 2C). 이러한 결과로 RTB134-F4/RTB134-R4 프 라이머 쌍에 대한 표적 유전자인 16S rDNA를 주형으로 한 PCR 산물 만이 증폭되었음을 확인할 수 있었다.

Discussion

본 연구에서 설계된 RTB134-F4/RTB134-R4 프라이머 쌍은 P. mikwangii에 대한 종-특이성이 있음이 검증되었으며(Fig. 1), qPCR 법에 의해 P. mikwangii KCOM 1628^T 지놈 DNA를 40 fg까지 검 출할 수 있음을 알 수 있었다(Table 2 and Fig. 2). P. mikwangii KCOM 1628^T 지놈 DNA 크기가 약 1.5 Mb이고, 하나의 genome 에 16S rDNA가 4 copy 존재(GenBank accession no. NZ_ AUQY01000000)한다는 것[8]을 고려할 때, RTB134-F4/RTB134- R4 프라이머 쌍은 24 마리의 P. mikwangii KCOM 1628^T 및 96 copy의 16S rDNA까지 검출할 수 있음을 알 수 있었다(Table 2).

PCR 또는 qPCR 프라이머 설계 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로 그램 알고리즘에 의해 최적결합온도가 제시되지만, 실제와는 다른 경 우가 많아 gradient PCR을 수행하여 실질적인 최적결합온도를 정하는 방법이 추천되었다[7,9]. 본 연구에서 설계된 RTB134-F4/RTB134- R4 프라이머 쌍의 PrimerSelect 프로그램에서 추천된 최적결합온도는 55.1℃였다. P. mikwangii 16S rDNA 핵산염기서열과 가장 상동성 이 높은 Peptoniphilus indolicus와 Peptoniphilus asaccharolyticus 표준균주들의 지놈 DNA, 그리고 P. mikwangii KCOM 1628^T 지놈 DNA를 이용하여, 54–66℃ 사이에서 1℃ 간격으로 gradient PCR을 실시한 결과, 모든 온도에서 P. mikwangii KCOM 1628^T 지놈 DNA 를 주형으로 한 경우에서만 PCR 산물이 증폭되었다. 또한, 54–62℃ 사이의 밴드 사이즈와 밝기가 동일하였으며, 그 보다 높은 온도에서 는 밴드 사이즈와 밝기가 작아지고 흐려졌다(data not shown). P. mikwangii KCOM 1637와 P. mikwangii KCOM 1641 지놈 DNA 를 주형으로 56–62℃ 사이에서 2℃ 간격으로 gradient PCR을 실시한 결과, 60℃ 이상에서는 PCR 산물이 증폭되지 않았고, 56℃에서 밴드 사이즈와 밝기가 최대였다(data not shown). 그러므로, 본 연구에서 56℃를 결합온도로 최종 결정하여 사용하였다.

이상의 결과를 종합하면, 본 연구에서 개발된 RTB134-F4/ RTB134-R4 프라이머 쌍은 P. mikwangii에 대한 종-특이성 및 민감 도가 뛰어난 것으로 확인되었다. 그러므로, RTB134-F4/RTB134-R4 프라이머 쌍은 향후 P. mikwangii와 여러 구강 세균 감염성질환과의 역학 연구에 사용할 수 있을 것으로 생각된다.