구강 내에서 가장 많이 발생하는 양대 구강병인 치아우식증과 치주질 환은 구강 내 세균이 주요한 원인 인자 중 하나인 대표적인 만성 질환 이다. 치아우식증은 치면세균막 내에 존재하는 세균들의 당질 대사 부 산물인 유기산(젖산이 대표적)에 의해 치아 법랑질이 탈회되면서 발생 되고, 주요한 원인균 중 하나가 Streptococcus mutans이다[1]. 치주 질환은 진행 정도에 따라 치은의 염증뿐만 아니라 치조골 소실 등의 증 상이 나타나며, 심할 경우 치아 상실까지 초래한다[2]. 치주질환은 면 역력 및 영양 결핍, 당뇨 등의 전신적 요인과 치은연하 치면세균막에 존재하는 세균들에 의한 국소적 요인에 의해 발생하며, 성인성 치주염 의 경우 세균이 가장 중요한 인자로 알려져 있다[3,4]. 주요한 치주질환 원인균으로는 Porphyromonas gingivalis , Prevotella intermedia , Fusobacterium nucleatum 및 Aggregatibacter actinomycetemcomitans 등을 포함한 그람 음성 혐기성 세균으로 알려져 있다[5].
이러한 치아우식증과 치주질환의 예방 또는 치료를 위해서는 원인 세 균을 화학적으로 제거하는 항생제를 가장 먼저 생각할 수 있지만, 항생 제의 오남용에 의한 내성 균주가 발생하는 단점이 있다[6]. 항생제의 단 점을 극복하기 위해 전통적으로 오랫동안 동양의학이나 민간요법에서 항균작용을 위해 사용된 천연물을 이용하려는 연구들이 활발히 진행되 고 있다[7,8]. 이러한 천연물 중 프로폴리스는 항균 및 항염 효능이 우 수한 것으로 알려져 있고, 많은 나라에서 민간요법으로 널리 이용되고 있다. 프로폴리스에 함유된 플라보노이드 성분은 항균 및 항산화 효능 이 뛰어나서 치주질환 환자의 점막 염증을 완화시키고[9,10], 치아우식 활성을 감소시키는 효과가 있음이 보고되었다[11]. 이러한 프로폴리스 의 플라보노이드는 수용성이 떨어지기 때문에 인체에 사용하기 위해서 는 에탄올에 녹여서 사용해야 하는 단점이 있다. 그러므로 본 연구는 에 탄올로 추출한 프로폴리스 분말(70%)과 덱스트린(dextrin, 30%)을 혼 합하여 플라보노이드의 수용성을 향상시킨 호주산 프로폴리스의 치아 우식증 및 치주질환 원인균에 대한 항균능을 알아보기 위해 시행하였 다.
본 연구에서 사용한 균주는 P. intermedia KCOM 1107, F. polymorphum (= F. nucleatum subsp. polymorphum) KCOM 1232, A. actinomycetemcomitans KCOM 1306, P. gingivalis KCOM 2804 및 S. mutans KCOM 1054 등이었다. 이들 균주들은 한국구강 미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology [KCOM], Gwangju, Korea)에서 분양받아 사용하였다.
본 연구에 사용된 S. mutans 균주는 brain heart infusion broth에 접종하여 5% CO2 조건에서 배양하였고, 나머지 균주들은 tryptic soy broth에 0.5% yeast extract, 0.05% cysteine HCl-H2O, 0.5 mg/ mL hemin 및 2 mg/mL vitamin K1이 포함된 배지에 접종하여, 37℃ anaerobic chamber (Bactron I, Sheldon Manufacturing Inc., Cornelius, OR, USA)와 혐기성 조건(10% H2, 5% CO2, and 85% N2)에서 배양하였다.
Minimal bactericidal concentration (MBC) 측정은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) [12]에서 제시한 미세희석 (micro-dilution)법을 변형하여 사용하였다. 즉, 세균들을 각각의 배지 에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양한 후 1 × 106 CFU/mL가 되 도록 세균 배양액을 이용하여 희석한 다음, 96-well plate에 100 µL 씩 분주하였다. 호주산 프로폴리스 분말(Threespears Nutritional Pty Ltd., Deniliquin, Australia)을 물을 이용하여 16% (w/v)부터 2배씩 10단계 희석하고 이들을 세균 배양액에 100 µL씩 첨가하여 최종농도 가 8%부터 0.015%까지 되도록 하였다. 이때 침전물을 제거하기 위해 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상층액을 채취하여 시료로 사 용하였다(non-freezing propolis). 또한, 프로폴리스 추출물에 남아 있 는 비수용성 물질을 좀 더 제거하기 위해 물에 완전히 용해되는 최고 농 도인 32% 희석용액을 –20℃ 냉동고에서 24시간 동안 냉동 후 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하고 상층액을 채취하여 시료로 사용하였다 (freezing propolis). 그리고 음성대조군은 세균배양액만 사용한 것으 로 하고, 양성대조군은 ampicillin 100 µg/mL을 사용하였다. 그런 후 96 well plate에 200 µL씩 분주한 것을 37℃에서 48시간 동안 배양 한 다음, 세균배양액에서 10 µL를 취하여 한천배지에 도말하고 37℃에 서 48시간 동안 배양한 뒤 형성된 군락을 확인하여 99.9% 살균력을 보 이는 농도를 MBC 값으로 결정하였다. 각 반응은 3회 반복 실시하였다.
본 연구에서 사용한 사람 치은섬유아세포(normal human gingival fibroblast, human gingival fibroblast [HGF]-1)는 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하 여 사용하였다. Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 10% fetal bovine serum (Hyclone, Logan, UT, USA)과 antibiotic-antimycotic solution (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) 이 혼합된 세포배양액을 이용 하여 37℃, 5% CO2, 100% 습도가 유지되는 세포 배양기에서 배양하 였다. HGF-1 세포를 24-well plate에 5 × 104 cells를 seeding하 여 하룻밤 배양한 후 80% confluence 했을 때 2X DMEM 배지와 시 료를 동량 혼합하여 최종농도가 4%부터 0.06%까지 되도록 하여 세포 에 첨가하였다. 이를 24시간 배양한 후 배지를 제거하고 5 mg/mL의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma Aldrich) 용액이 1/10 들어간 배지를 각 well에 넣고 4 시간 배양하였다. 생성된 formazon 결정을 dimethyl sulfoxide로 용 해시켜 EpochTM Microplate Spectrophotometer (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)기로 570 nm에서 흡광도를 측정하 고 결과를 분석하였다. 각 반응은 3회 반복 실시하였다. 모든 실험 결과 는 대조군에 대한 백분율로 계산하였다.
Non-feezing propolis의 경우, 4종 치주질환원인균에 대한 MBC 값은 0.03–2%였다(Table 1). 또한, 치아우식증의 주요한 원인균종 인 S. mutans에 대해서도 MBC 값은 0.5%였다. 한편 non-freezing propolis의 경우 0.13% 농도에서는 사람 치은섬유모세포인 HGF-1 에 대하여 세포독성이 보이지 않았으나, 0.25% 농도에서는 6%의 세 포생존율을 나타내었다(Fig. 1). 즉, 세포독성이 없는 0.13% 농도에 서는 P. intermedia (KCOM 1107)와 P. gingivalis (KCOM 2804) 에 대해서만 항균력을 보였다. 반면에 freezing propolis의 경우 A. actinomycetemcomitans (KCOM 1306)를 제외한 본 시험에서 사용 된 모든 균주(3종 치주질환 원인균 및 1종 치아우식증 원인균)에 대하 여 HGF-1에 대한 세포 독성이 없는 1% 이하의 농도에서 MBC 값을 가졌다. A. actinomycetemcomitans는 사춘기 전 치주염과 같은 특 수한 치주질환에 주요한 병원성 균종이고, F. nucleatum은 치주질환 병소뿐만 아니라 정상부위에도 존재하고 있다. 그리고 대부분의 치주 질환에 속하는 성인성 치주염에서는 P. gingivalis가 주요한 병원성 세 균 종에 속하며[13], P. intermedia는 한국인의 초기 치주질환치료 예 후와 밀접한 관련성이 있다[14]는 점을 고려할 때, 본 연구에서 사용된 호주산 프로폴리스는 냉동 후 원심 분리하여 상청액만 취한 freezing propolis의 1% 농도에서 치주질환 및 치아우식증 예방을 위한 구강위 생용품(구강양치용액, 치약 등) 개발에 사용 가능할 것으로 생각된다.
프로폴리스는 항균효과, 항암효과, 항산화 효과, 항돌연변이 효과 등 다양한 생리활성을 나타내어 사람에게 유익한 천연물 소재로 사용되고 있다[15]. 프로폴리스는 그람양성균 및 그람음성균에 의해 발생되는 치 주질환에 대하여 효과적인 항균활성을 가진다[16]. 또한, 프로폴리스는 S. mutans, P. gingivalis, P. intermedia 등에 의하여 발생되는 치주 질환에 효과적인 활성을 갖는다고 보고되었다[16]. 프로폴리스 내의 각 종 유기물과 미네랄 물질에는 20종이 넘는 다양한 플라보노이드가 다 량으로 함유되어 있고, 이러한 플라보노이드가 강력한 항균효능을 나타 내는 것으로 보고되어 있다[17]. 이에 본 연구에서는, 천연 항생제인 프 로폴리스의 수용성 플라보노이드 함량을 증가시켜 항균력을 알아보았 다.
프로폴리스의 추출방법으로는 미셀화 추출법, 수용성 추출법, 초임계 추출법, 에탄올 추출법 등이 있다. 에탄올 추출법이 가장 보편적으로 사 용되고 있는 방법이지만, 높은 온도에서 추출이 이루어지므로 플라보노 이드의 화학적 변화와 회수율이 낮아질 수 있고 왁스 성분의 추출량이 많아진다는 단점이 있다. 또한, 에탄올을 포함한 유기용매로 인해 알러 지 등의 부작용이 간혹 발생할 수 있고 프로폴리스가 점막에 염증 또는 궤양을 일으켜 천식 등의 과민반응을 일으킬 수 있다고 보고되고 있다 [18]. 수용성 추출법은 맛과 냄새가 자극적이지 않고, 흡수율이 높은 장 점을 가지고 있다. 본 연구에서 비수용성 성분을 가능한 많이 제거하기 위해 냉동 후 원심 분리하여 침전물을 제거한 후 상청액을 이용한 방법 은 세포독성을 줄이고, 항균능을 높혀 치주질환 및 치아우식증 예방을 위한 구강위생용품 및 건강기능 제품 개발에 사용이 증가할 것으로 생 각된다.
