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ISSN : 1226-7155(Print)
ISSN : 2287-6618(Online)

International Journal of Oral Biology Vol.45 No.1 pp.15-24
DOI : https://doi.org/10.11620/IJOB.2020.45.1.15

Inhibitory effect of Chaenomelis Fructus ethanol extract on receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand-mediated osteoclastogenesis

Geun Ha Park¹, Dong Ryun Gu¹, Seoung Hoon Lee^1,2*

¹Department of Oral Microbiology and Immunology, Wonkwang University College of Dentistry, Iksan 54538, Republic of Korea
²Institute of Biomaterial and Implant, Wonkwang University College of Dentistry, Iksan 54538, Republic of Korea

^*Correspondence to: Seoung Hoon Lee, E-mail: leesh2@wku.ac.kr

Received February 13, 2020 Review March 2, 2020 Accepted March 3, 2020

Abstract

The fruit of Chaenomeles sinensis (Thouin) Koehne (Chaenomelis Fructus) known as “Mo-Gua” in Korea has been commonly used in traditional medicine to treat inflammatory diseases, such as sore throat. However, its effect on bone metabolism has not been elucidated yet. Here, we examined the effect of Chaenomelis Fructus ethanol extract (CFE) on receptor activator of nuclear factor (NF)-κB ligand (RANKL)-mediated osteoclast differentiation and formation. CF-E considerably inhibited osteoclast differentiation and tartrate-resistant acid phosphatase-positive multinuclear cell formation from bone marrow-derived macrophages and osteoclast precursor cells in a dose-dependent manner. In addition, the formation of actin rings and resorption pits were significantly suppressed in CF-E-treated osteoclasts as compared with the findings in non-treated control cells. Consistent with these phenotypic inhibitory results, the expressions of osteoclast differentiation marker genes (Acp5, Atp6v0d2 , Oscar, CtsK, and Tm7sf4) and Nfatc1 , a pivotal transcription factor for osteoclastogenesis, were markedly decreased by CF-E treatment. The inhibitory effect of CF-E on RANKL-induced osteoclastogenesis was associated with the suppression of Nfatc1 expression, not by regulation of mitogen-activated protein kinases and NF-κB activation but by the inactivation of phospholipase C gamma 1 and 2. These results indicate that CF-E has an inhibitory effect on osteoclast differentiation and formation, and they suggest the possibility of CF-E as a traditional therapeutic agent against bone-resorptive diseases, such as osteoporosis, rheumatoid arthritis, and periodontitis.

Key Words : Chaenomeles , Osteoclast , Cell differentiation , NFATC transcription factors , Phospholipase C gamma

초록

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This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/bync/4.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Introduction

뼈 기질(bone matrix)을 분해 흡수하는 파골세포(osteoclasts)는 뼈 기질의 단백질 성분을 생산하는 조골세포(osteoblasts)와 함께 뼈 재 형성(remodeling)과 뼈 항상성(bone homeostasis)을 담당하고 있 다[1]. 파골세포는 단핵세포/대식세포(monocyte/macrophage) 계 통에서 유래하며 파골세포 분화 사이토카인(differentiation cytokine) 인 receptor activator of nuclear factor (NF)-κB ligand (RANKL) 의 자극에 의해 분화된다[1,2]. RANKL과 그 수용체인 receptor activator of NF-κB (RANK)의 결합에 의해 유도되는 복잡하고 정교한 세포 내 신호전달 경로가 보고되었다[1,3]. RANKL과 RANK의 결합 은 TNF receptor-associated factor 6를 경유하는 신호전달을 통해 NF-κB와 extracellular signal-regulated kinases (ERKs), c-Jun N-terminal kinases (JNKs), p38 등의 mitogen-activated protein kinases (MAPKs)를 활성화 시키고 이러한 신호전달을 통해 c-Fos 의 발현을 증가시킨다[4-6]. 공동 자극 신호전달 경로(co-stimulatory signaling pathway)로 알려진 또 다른 경로에서, RANKL/RANK 결합 은 Fc receptor common γ subunit 또는 DNAX-activating protein 12 같은 immunoreceptor tyrosine-based activation motif-harboring adaptor의 활성화를 유발하고, 후속적으로 Bruton’s tyrosine kinase 및 phospholipase C gamma (PLCγ)를 차례대로 활성화 시 킨다[7-10]. PLCγ 활성화는 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate로부터 inositol triphosphate receptors에 결합하는 inositol triphosphate를 생성하고, 이어서 소포체(endoplasmic reticulum) 로부터 Ca²⁺ 이온 방출을 유도하여 파골세포 분화에 중요한 역할을 하 는 Ca²⁺-oscillation을 생성한다[11-13]. 결과적으로, RANKL/RANK 결합에 의해 발생하는 세포 내 두 신호 전달 경로는 in vitro 및 in vivo 에서 파골세포 분화(differentiation), 생성(formation) 및 활성화(activation) 에 가장 중요한 전사 인자(transcription factor)인 NFATc1의 발현 및 활성화를 유도한다[14].

한국에서 모과(Chaenomelis Fructus)라고 하는 것은 장미과에 속 하고 한국, 중국 및 일본에 널리 퍼져있는 낙엽교목인 모과나무(Chaenomeles sinensis Koehne)의 성숙과실을 건조한 것을 일컬으며 중 국에서는 이것을 광피목과(光皮木果)라 지칭하고 있다[15]. 모과는 전 통적인 한의학 및 중의학에서 인후염을 비롯한 염증, 류마티스 관절염, 기침, 감기 및 설사 등을 완화시키는 목적으로 오랫동안 사용되어 왔다 [16,17]. 최근의 연구에서 triterpenes (oleanolic acid and ursolic acid), flavonoids (quercetin, luteolin, catechin) 및 phenolics (chlorogenic acid) 등의 많은 물질이 모과의 활성성분으로 분리되었 고, 항산화(antioxidant), 항종양(antitumor), 항고지혈증(antihyperlipidemic), 항균활성(antimicrobial activity), 항독감바이러스(antiinfluenza virus) 및 항파킨슨(anti-Parkinson) 등의 효과가 보고되 었다[16-22]. 모과 에탄올 추출물(Chaenomelis Fructus ethanol extract, CF-E)의 활성성분들이 활성산소종(reactive oxygen species) 제거 및 산화질소(nitric oxide) 발생을 감소시키고, RAW264.7 macrophage 세포에서 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 인 interleukin-6의 생성을 억제시켜 항산화 및 항염증 효과를 보 이고[23], 또한 lipopolysaccharide (LPS)에 의해 유도되는 inducible nitric oxide synthase mRNA 발현을 억제함으로써 산화질소의 생성 을 억제하고, LPS에 의해 유도되는 tumor necrosis factor-α, interferon- γ, Granulocyte-colony stimulating factor의 발현을 억제시 킴으로써 항산화 및 항염증 효과를 보인다는 결과가 보고되었다[24]. 그러나 이와 같은 모과의 많은 효능에도 불구하고 현재까지 파골세포를 비롯한 뼈관련 세포(bone-related cells), 뼈대사(bone metabolism) 및 뼈질환(bone diseases) 등에서 모과의 효과가 보고된 적이 없다. 본 연구에서는 모과 에탄올 추출물(CF-E)을 이용하여 파골세포 분화, 생성 및 활성에서의 효과를 측정하고 그 효과 기전을 규명하였다.

Materials and Methods

1. 실험 배지 및 시약

본 연구에 사용한 배지(α-minimal essential medium, α-MEM), 소혈청(fetal bovine serum, FBS)을 비롯한 세포 배양관련 시약 은 Hyclone (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다. Recombinant RANKL와 macrophage colony stimulating factor (M-CSF)는 한 국한의학연구원에 근무하는 김태수 박사로부터 얻었다. Anti-NFATc1, anti-c-Fos 항체(antibody)는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)로부터 구입하였고, anti-actin 항체는 Sigma-Aldrich (Seoul, Korea)로부터 구입하였다. 본 연구에 사용한 또 다른 항체들 (p-ERK (Thr202/Tyr204), ERK, p-JNK (Thr183/Tyr185), JNK, p-p38 (Thr180/Tyr182), p-38, p-IκBα (Ser32), IκBα, PLCγ1, and PLCγ2)은 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)로 부터 구입, 사용하였다.

2. 모과 에탄올 추출물 준비

본 연구에서 사용한 모과(Chaenomelis Fructus)는 2012년 5월 대한민국 익산시에 소재한 대학한약국에서 구입하였고 형태학적 특 징을 통하여 동정하였다. 모과 50 g을 70% 에탄올 수용액 50 mL 로 70℃에서 2시간 동안 가열추출하고 여과한 후 여액을 감압 농축하 여 모과 추출물 13.41 g (NNMBS-013)을 얻었다. 이 추출물을 물 에 녹이고 하루 동안 실온에 방치한 후에 2,500 rpm에서 30분간 원 심분리를 진행하였다. 이렇게 하여 생긴 침전물을 70% 에탄올에 용 해하여 여과한 후 여액을 감압 농축하여 최종적으로 모과 에탄올 추출 물 1.19 g (표준화 시료 1, NNMBS-014)을 얻었다. 모과 에탄올 추 출물(NNMBS-013, 014)은 원광대학교 천연물신약 표준화연구 소재 은행에 보관하였다. 본 연구에서는 모과 에탄올 추출물 표준화 시료 1 (NNMBS-014, CF-E)을 각 실험에 사용하였다.

3. 세포독성 평가

모과 에탄올 추출물(CF-E)의 세포독성을 측정하기 위하여 Itsbio (Seoul, Korea)에서 제조한 EZ-Cytox Enhanced Cell Viability Assay Kit를 사용하였다[25]. (주)오리엔트 바이오(Seongnam, Korea) 로부터 구입한 6–8주령의 C57BL/6N 수컷 생쥐의 대퇴골(femur)과 경골(tibiae)로부터 골수세포(bone marrow cells)를 분리하여 10% FBS, 1% Penicillin (100 U/mL)/Streptomycin (100 μg/mL) 및 30 ng/mL M-CSF가 첨가된 α-MEM으로 3일 동안, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 배양접시에 부착된 세포를 trypsin으로 분리하 고 원심분리하여 모은 세포를 파골세포 전구세포(bone marrow-derived macrophages, BMMs)로 사용하였다. M-CSF (30 ng/mL)가 들어있는 α-MEM에 현탁한 BMMs을 96 well culture plate (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)에 분주(1 × 10⁴ cells/well) 한 후, 다양한 농도(0, 2, 5, 10, 20 and 40 μg/mL)의 CF-E를 처리하 여 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 3일 동안 배양하였다. 또는, M-CSF가 든 배지에 현탁한 BMMs을 20 μg/mL의 CF-E를 처리한 조건에서 4 일 동안 배양하였다. 10 μL의 EZ-Cytox reagent를 각 well에 첨가해 준 후 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 후 Sunrise^TM enzyme-linked immunosorbent assay reader (Tecan, Männedorf, Switzerland) 를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성 값은 CF-E를 처리하지 않은 대조군(0 μg/mL)에 대한 상대적인 % 값으로 표시하였다.

4. 파골세포 분화, actin ring 및 absorption pit 형성 측정

파골세포 분화에서 CF-E의 효과를 측정하기 위하여 BMMs (1 × 10⁴ cells/well)을 M-CSF (30 ng/mL)와 RANKL (100 ng/mL) 이 첨가된 α-MEM 배지(10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin) 에 희석하여 96 well culture plate에 분주한 후, 다양한 농도(0, 1, 2, 5, 10 and 20 μg/mL)의 CF-E를 처리하였다. 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 4일 동안 배양하면서 파골세포로의 분화를 유도하였다. 10% formalin 용액으로 배양 세포를 고정시킨 후 메탄올/아세톤(1:1) 용액 을 1분 동안 첨가한 후 상온에서 건조시켰다. F-actin ring 형성을 측 정하기 위하여 고정시킨 세포를 rhodamine-phalloidin (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)으로 염색하여 형광 도립현미경(Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)으로 관찰한 후, 순차적 으로 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) solution assay 와 TRAP 염색(staining)을 시행하였다[25]. p -nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich, Seoul, Korea)를 기질로 사용하여 405 nm 에서 흡광도를 측정함으로써 plate well 내 전체 TRAP 활성을 측정하 는 TRAP solution assay를 시행하였다. 또한 TRAP 염색 후 현미경 으로 관찰하여 3개 이상 핵을 가지고 직경이 100 μm 이상인 TRAP(+) multinuclear cells (MNCs)을 성체 파골세포로 간주하였다. 뼈흡수 (bone resorption) 활성을 측정하기 위하여, M-CSF와 RANKL이 함 유된 α-MEM 배지(10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin)에 현탁 된 BMMs (3 × 10⁴ cells/well)을 CF-E (20 μg/mL) 처리한 그룹과 처리하지 않은 대조군 그룹으로 분류하여 Cosmo Bio 48-well bone resorption assay plate (Cosmo Bio, Tokyo, Japan)에서 7일 동안 배양(3일마다 새 배지로 교환)한 후 bleach를 사용하여 well을 세척하 였다. 각 resorption assay plate의 well을 촬영한 후 ImageJ software (NIH 1.62)를 사용하여 resorption pit area를 분석하였다[25].

5. RNA 분리 및 실시간 정량 real-time polymerase chain reaction (PCR) 분석

파골세포 분화 정도를 측정하기 위하여 BMMs를 M-CSF (30 ng/ mL)와 RNAKL (100 ng/mL)를 함유한 α-MEM 배지에 현탁 시킨 후 CF-E (20 μg/mL)를 첨가하여 4일 동안 배양시켰다. Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 처리하여 매일 배양된 세포로부 터 total RNA을 추출하였다. Maxima reverse transcriptase (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)와 random primer를 이용하여 1 μg의 total RNA를 제조사의 지시에 따라 역전사 반응시 켜 cDNA를 얻었다. 합성한 cDNA와 10 pmole의 primers (forward, reverse)를 veriQuest SYBR Green qPCR Master mix (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)에 첨가하고 StepOnePlusTM Real- Time PCR Systems (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) 을 이용하여 실시간 정량 PCR 분석을 실시하였다. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (Gapdh)로 정량화시킨 파골세포 분 화 인자들(Acp5, Atp6v0d2, Oscar, CtsK, Tm7sf4 and Nfatc1)의 발현 수준을 대조군(0 μg/mL CF-E)과 비교하였다. 본 연구에 사용된 primers는 Table 1에 표시하였다.

6. Western blot analysis

BMMs (3 × 10⁵ cells/well)을 M-CSF (30 ng/mL)가 첨가된 α-MEM 배지에 희석하고 6 well culture plate에 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 24시간 동안 배양시켰다. CF-E (20 μg/mL)를 2 시간 동안 전 처리한 후 RANKL (100 ng/mL)을 처리하여 분화 신호를 유도하였다. 또는 M-CSF (30 ng/mL)와 RANKL (100 ng/mL)이 첨 가된 α-MEM 배지에 BMMs을 희석하고 CF-E (20 μg/mL)을 처리 한 그룹과 처리하지 않은 대조군 그룹으로 나눠 일정 시간(6시간–4일) 동안 배양하였다. 반응시킨 세포를 phosphate-buffed saline로 세척 한 후 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, protease-inhibitor cocktail (Roche, Mannheim, Germany)와 phosphatase inhibitor tablets (Thermo Scientific, Seoul, Korea)이 첨가된 lysis buffer radioimmunoprecipitation assay buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, and 0.1% sodium dodecyl sulfate [SDS])를 이용하여 세포를 lysis 시키 고 10분 동안 14,000 × g, 4℃에서 원심 분리하여 모은 상층액을 전 체 세포 단백질(total cell lysate)로 사용하였다. 30 μg의 전체 세포 단 백질을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 전기영동 시행하였고, SDS-PAGE 상 의 단백질을 Hybond^TM-polyvinylidene fluoride membranes (GEHealthcare Life Science, Marlborough, MA, USA)으로 이동시켰 다. 각각의 membrane은 한 시간 동안 5% skin milk를 사용하여 블로 킹 한 후, 0.1% Tween-20이 첨가된 Tris-buffered saline (50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, and 0.1% Tween-20)에 희석 (1:1,000 dilution)한 일차항체와 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이 차항체는 horseradish peroxidase-conjugated immunoglobulin G (1:5,000 dilution)를 사용하였다. 단백질 발현량은 image analyzer (FluorChem E, ProteinSimple, San Jose, CA, USA)를 사용하여 확 인하였다. 단백질 밴드의 농도는 ImageJ software (NIH 1.52)를 사 용하여 정량하였다.

7. 통계분석

본 연구의 결과는 Student’s t-test를 사용하여 분석되었고, mean ± standard deviation으로 표시되었다. p ＜ 0.05의 경우만 통계학적으 로 유의한 것으로 정하였다. 모든 실험은 최소한 두 번 이상 수행하였 고, 대표적인 결과를 표시하였다.

Results

1. 파골세포 전구세포(BMMs)에 대한 모과 에탄올 추출물 (CF-E)의 세포독성(cytotoxicity)

본 연구에서 사용된 CF-E의 효과를 검증하기에 앞서 파골세포 전구 세포(BMMs)에 대한 세포독성을 측정하였다. M-CSF 존재 하에 배양 한 BMMs 세포에 다양한 농도(2, 5, 10, 20, 40 μg/mL)의 CF-E를 처리하고 3일 동안 배양한 후 세포독성을 측정하였다. CF-E를 처리하 지 않은 대조군과 비교할 때 2–20 μg/mL CF-E 농도를 처리한 실험 군에서는 통계적으로 유의적인 차이를 보이지 않았지만, 40 μg/mL의 CF-E를 처리한 실험군에서는 대조군에 비해 약 24% 정도의 세포독성 을 보였다(Fig. 1A). M-CSF가 포함된 배지에 현탁한 BMMs 세포에 세포독성을 보이지 않은 가장 높은 측정 농도인 20 μg/mL의 CF-E를 4일 동안 처리한 후 매일 세포독성을 측정하였다(Fig. 1B). 전 배양 기 간 동안 CF-E를 처리하지 않은 대조군과 처리한 실험군 사이에 통계적 으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과를 바탕으로 본 연구의 실험에 20 μg/mL CF-E 농도를 선별 사용하였다.

2. 모과 에탄올 추출물(CF-E)의 파골세포 분화 (differentiation), 생성(formation) 및 뼈흡수 활성 (bone resorption activity)에서의 효과

파골세포의 분화와 생성에서 CF-E의 효과를 측정하기 위하여 M-CSF와 RANKL을 처리하여 파골세포로의 분화를 유도시킨 BMMs 세포에 다양한 농도(1, 2, 5, 10, 20 μg/mL)의 CF-E를 처리하였다. TRAP 염색 및 TRAP solution assay를 이용하여 파골세포의 분화와 생성을 측정하였다. 처리한 CF-E의 농도가 증가할수록 3개 이상의 핵 을 가지고 직경이 100 μm 이상인 성체 파골세포인 TRAP(+) MNCs 의 수가 현저하게 감소되었다(Fig. 2A and 2B). 1–2 μg/mL의 CF-E 를 처리한 실험군에서는 CF-E를 처리하지 않은 대조군과 생성된 성 체 파골세포의 수를 비교할 때 통계적으로 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 그러나 5 μg/mL의 CF-E를 처리한 실험군부터 성체 파골세 포의 생성이 현저하게 감소되었고, 20 μg/mL CF-E를 처리한 실험 군에서는 성체 파골세포가 거의 생성되지 않았다. 또한, TRAP을 발현 하는 mono-, di- 그리고 MNC의 total TRAP 활성을 측정할 수 있는 TRAP solution assay 결과, TRAP 염색 결과와 마찬가지로 5 μg/mL 이상의 CF-E를 처리한 실험군에서 농도가 증가할수록 TRAP 활성이 현저히 감소되었다(Fig. 2C). 파골세포의 뼈흡수(bone resorption) 활 성에서의 CF-E 효과를 검증하기 위하여, CF-E 처리 하에서 RANKL 에 의한 파골세포 분화를 유도한 후 F-actin ring과 pit 형성을 측정하 였다. CF-E를 처리하지 않은 대조군에 비해 20 μg/mL CF-E를 처리 한 실험군에서 골 기질(bone matrix) 흡수에 필수적인 구조인 F-actin ring을 가지는 성체 파골세포의 생성이 현저하게 감소되었다(Fig. 2D). 실제적으로 수산화아파타이트(hydroxyapatite)가 coating된 plate에 배양한 파골세포 중 CF-E를 처리한 실험군의 pit formation rate이 대 조군에 비해 약 75% 정도 현저하게 감소되었다(Fig. 2E). CF-E 처리 에 의한 F-actin ring과 pit formation의 억제는 CF-E 처리한 실험군 에서 보여준 TRAP(+) MNCs 분화 및 생성 감소에 기인한다. 이상의 결과들은 RANKL에 의해 유도되는 전구 파골세포(BMMs)로부터 성체 파골세포로의 분화 및 생성뿐 아니라 뼈흡수 활성에서도 CF-E가 억제 효과를 가진다는 것을 보여준다.

3. 모과 에탄올 추출물(CF-E)의 파골세포 분화인자 (differentiation factors) 발현에서의 효과

파골세포 분화 및 생성에서의 CF-E 억제효과를 분자 수준(molecular level)에서 검증하기 위하여 파골세포 분화 및 생성과정에서 발현량이 증가한다고 알려진 파골세포 분화인자 유전자(osteoclast differentiation marker genes) Acp5 (Trap ), Atp6v0d2 , Oscar , CtsK, Tm7sf4 (Dc-stamp) 및 파골세포 분화와 생성의 모든 단계에 서 가장 중요한 역할을 하는 전사인자(transcription factor)인 Nfatc1 의 발현을 real-time PCR 분석으로 측정하였다. RANKL에 의한 파골 세포 분화과정에서(day 0–4) 선별한 파골세포 분화인자들 및 Nfatc1 의 발현이 배양기간이 지날수록 급격히 증가하였다. 그러나 CF-E (20 μg/mL)를 처리한 실험군에서는 측정한 모든 파골세포 분화인자들 및 Nfatc1의 발현량이 전 배양기간에 걸쳐 대조군에 비해 현저하게 감소 되었다(Fig. 3). 이러한 결과들은 CF-E가 파골세포의 분화인자 및 전사 인자의 발현을 감소시킴으로써 Fig. 2에서 보여준 RANKL에 의한 파골 세포의 분화, 생성 및 활성을 억제한다는 것을 보여준다.

4. 모과 에탄올 추출물(CF-E)의 RANKL-유도 파골세포 분화 및 생성 억제 신호전달 기전

CF-E에 의한 파골세포의 분화 및 생성 억제 기전을 규명하기 위하여 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 내 신호전달(intracellular signal transduction)을 측정하였다. BMMs을 M-CSF 처리하여 24시간 동 안 배양한 후, CF-E를 2시간 동안 전처리(pre-treatment)한 실험군 과 처리하지 않은 대조군 세포에 RANKL을 5, 15, 30, 60분 처리하 여 MAPKs 및 IκBα 활성을 유도하고 웨스턴 블랏(western blot)을 통 해 그 활성도를 분석하였다. RANKL을 처리한 후 측정한 ERK, JNK, p38 및 IκBα의 인산화(phosphorylation)가 CF-E를 처리한 실험군 에서도 대조군과 확률적 유의성을 보이지 않는 거의 동일한 정도로 증 가되는 양상을 보였다(Fig. 4A). RANKL/MAPKs/NF-κB 신호전달 에 의해 발현이 조절되는 파골세포 전사인자인 c-Fos와 NFATc1 발 현양상을 분석하였다(Fig. 4B). CF-E를 처리한 실험군과 처리하지 않 은 대조군 모두에서 RANKL에 의한 신호전달 유도 후 c-Fos의 발현이 6시간 후 가장 증가된 동일한 발현 양상을 보였고, CF-E를 처리한 실 험군에서 c-Fos의 발현이 대조군에 비해 상대적으로 감소되었다(Fig. 4B, upper panel). 또한, 파골세포 분화 및 생성에 가장 중요한 역할 을 하는 전사인자인 NFATc1의 발현에서의 CF-E 효과를 측정한 결과, RANKL을 처리한 후 그 발현이 증가되어 높은 농도로 유지되는 양상을 보이는 대조군에 비해 CF-E를 처리한 실험군에서는 NFATc1의 발현이 파골세포 분화과정 전 기간 동안 급격하게 감소되었다(Fig. 4B, lower panel). 이러한 결과들은 CF-E에 의한 c-Fos/NFATc1의 억제 효과 는 MAPKs/NF-κB를 통한 신호전달 조절에 의한 기전 때문이 아니라 RANKL에 의한 또 다른 기전의 조절을 통해 이루어질 수 있다는 것을 암시한다. 따라서 RANKL에 의한 PLCγ 조절 양상을 조사하였다(Fig. 4C). RANKL 처리에 의해 파골세포 분화과정 동안 PLCγ1 및 PLCγ2 의 인산화는 파골세포 분화과정 동안 증가하는 경향을 보였다. PLCγ1 는 배양 2, 3일, PLCγ2는 3, 4일에서 가장 높은 인산화를 보였다. 그러 나 CF-E를 처리한 실험군에서는 PLCγ1 및 PLCγ2의 인산화가 상당히 억제되어 파골세포 분화과정 동안 오히려 급격히 감소하는 경향을 보였 다. 이상의 결과들은 RANKL에 의해 유도되는 NFATc1의 발현 증가가 CF-E를 처리한 실험군에서는 PLCγ1 및 PLCγ2의 활성화가 억제됨으 로써 NFATc1의 발현이 감소됨을 보여준다. 이러한 신호전달 기전에 의 해 NFATc1의 조절받는 많은 유전자들의 전사가 억제되어 파골세포의 분화, 생성 및 활성이 억제됨을 보여준다.

Discussion

수십 년 동안, 많은 연구에서 골다공증을 포함한 뼈 손실(bone loss) 을 동반하는 뼈 질환에 대한 전통 의약품으로 사용된 다양한 식물의 추 출물 및 유효성분들의 약효를 입증해 왔다[26]. 이러한 식물 추출물 및 유효성분들의 잠재적인 뼈 손실 억제 효과들이 제시되었지만, 이들 중 일부만이 생리학적, 약리학적 특성 및 작용 기전에 대해 적절하게 연구 되었고, 제시된 일부 약용 식물은 다양한 효과와 작용 기전에 의해 파골 세포, 조골세포 또는 두 세포 모두의 분화, 생성 및 활성 등을 조절하는 것으로 보고되었다[26]. 연구된 많은 약용 식물 추출물의 작용 기전은 MAPKs 및 NF-κB을 통한 세포 내 신호 전달(intracellular signaling) 을 활성화 시키고, 이러한 신호전달에 의해 파골세포 분화 및 생성 조절 전사인자인 c-Fos 및 NFATc1의 발현을 조절한다[27,28].

모과나무(Chaenomeles sinensis Koehne)의 과실인 모과(Chaenomelis Fructus)는 한국, 중국 및 일본을 비롯한 동아시아에서 차 (teas), 시럽(syrups), 껌(gums), 케이크(cakes) 및 와인(wines)의 식 품 재료로 많이 사용되고 있고, 인후염을 비롯한 다양한 질병에 대한 전 통적인 치료제로 사용되어 왔다[16,17]. 이러한 다양한 모과의 효능 이 알려있지만, 파골세포를 비롯한 뼈 세포(bone cells), 뼈 대사(bone metabolism) 및 뼈 질환(bone diseases) 관련 분야에서는 그 효능 이 알려진 것이 거의 없다. 본 연구에서는 파골세포 분화, 생성 및 활성 에 있어서 모과 에탄올 추출물(CF-E)의 억제효과를 규명하였다. 모과 추출물을 구성하는 많은 활성성분 분석에 대한 이전의 연구들은 essential oil, flavonoids, phenolics, proanthocyanidins, tannins 그 리고 triterpenes 등의 주요 화학적 성분들을 분석하였고, 생물학적 활 성에 대해 보고하였다[16-19]. 이러한 성분들 중 ursolic acid는 모과 에 가장 풍부하게 존재하는 triterpene acid이며, 항산화, 항종양, 항 치매(anti-dementia) 효과 등의 다양한 약리적인 활성이 보고되었다 [29]. 최근 논문에 ursolic acid가 MAPKs, NF-κB 및 activator protein- 1을 활성화 시켜 조골세포 특이적 유전자들의 발현을 유도함으 로써 in vitro 조골세포의 분화와 in vivo 뼈 형성을 유도하는 anabolic 활성을 보임이 보고되었다[30]. 다른 한편으로는 ursolic acid 처리 에 의해 RANKL에 의한 유도되는 NF-κB 및 JNK 신호전달이 감소되 며 이로 인해 NFATc1의 발현이 감소되어 파골세포의 분화가 억제된다 는 연구가 보고되었다[31]. 또 다른 triterpene acid인 oleanolic acid 는 RANKL/RANK 결합에 의해 유도되는 공동자극신호 전달 경로인 PLCγ2/Ca²⁺-oscillation의 억제를 통해 NFATc1의 발현을 감소시킴으 로써 파골세포의 분화를 억제하였고, LPS에 의해 유도되는 in vivo 뼈 손실을 감소시켰다[32]. 본 연구에서 세포독성을 보이지 않은 농도(20 μg/mL)의 CF-E를 처리한 후 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분 화과정에서의 세포내 신호전달을 측정한 결과, 파골세포 분화, 생성 및 활성화에서 가장 중요한 역할을 하는 전사인자인 NFATc1의 발현이 급 격히 억제되었고, 이러한 NFATc1 발현 억제 효과는 MAPKs/IκBα/ c-Fos를 통한 신호전달에 의한 것이 아니라 RNAKL 자극에 의한 또 다른 신호전달 경로인 PLCγ (PLCγ1, 2) 활성 감소를 유도하여 발생하 였고, 최종 파골세포 분화 및 생성을 억제하였다(Figs. 2 and 4). 이러 한 억제 기전은 앞에서 설명한 CF-E의 성분인 oleanolic acid의 파골 세포 억제 기전과 유사하다. Triterpene acid 중 oleanolic acid 이외 CF-E의 다른 활성성분들은 PLCγ/NFATc1을 통한 세포내 신호전달 경 로가 아닌 다른 신호전달 경로를 조절하여 파골세포 분화 및 생성을 억 제하였다[33-35]. 따라서 본 연구의 실험 및 방법에 기술된 추출방법으 로 얻어 사용된 CF-E의 억제효과는 oleanolic acid에 의한 것으로 추 정된다. 그러나 정확한 억제 효과를 규명하기 위해서는 먼저 CF-E의 유효성분 분석 연구가 선행되어야 할 것이다. 본 연구에 사용된 CF-F 의 주요 유효 활성성분들을 자세히 분석한다면 CF-F의 파골세포 분화 및 생성 억제 작용기전을 더욱 구체적으로 규명할 수 있을 뿐 아니라 모 과의 약리학적 유용성을 높일 수 있을 것이라 생각한다. 또한, 골다공 증(osteoporosis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 및 치주염 (periodontitis)과 같은 뼈 손실을 동반하는 뼈 질환 동물 모델을 사용하 는 향후 연구는 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화, 생성 및 뼈 대 사에서의 정확한 CF-E 효능을 이해할 수 있는 더 많은 정보를 제공할 것이라 생각한다.

Conflicts of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Figure

Fig. 1.

Effects of Chaenomelis Fructus ethanol extract (CF-E) on cell viability. (A) Bone marrow-derived macrophages (BMMs) in the presence of macrophage colony stimulating factor (M-CSF) (30 ng/mL) were cultured with the indicated concentrations of CF-E for 3 day. (B) BMMs were cultured with/without 20 μg/mL CF-E, in the presence of M-CSF, for 4 days. Cell viability was measured as described in the materials and methods. Data are expressed as the mean ± standard deviation and are representative of three independent experiments.

NS, not significant.

*p < 0.05 versus the non-treated control (0 μg/mL CF-E).

Fig. 2.

Effect of Chaenomelis Fructus ethanol extract (CF-E) on osteoclast differentiation, formation and resorption activity. Bone marrow-derived macrophages under macrophage colony stimulating factor (30 ng/mL) and receptor activator of nuclear factor-κB ligand (100 ng/mL) treatment were cultured with the indicated concentrations of CF-E for 4 days. (A) Osteoclasts were fixed and stained for tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP). (B) TRAP(+)-multinuclear cells (MNCs) with ≥ 3 nuclei and ≥ 100 μm in diameter were counted as mature osteoclasts. (C) Total TRAP activity from TRAP(+)-mono-, di-, and MNCs were measured at an absorbance of 405 nm (A_405nm). (D) F-actin rings were stained with rhodamine-phalloidin in osteoclasts treated with/without CF-E (20 μg/mL). (E) The resorption activity of osteoclasts treated with/without CF-E (20 μg/mL) was measured by pit formation on hydroxyapatite-coated plates after 7-day culture. Data are expressed as the mean ± standard deviation and are representative of at least twice independent experiments. Scale bar = 200 μm.

NS, not significant.

*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001 versus the non-treated control (NC, 0 μg/mL CF-E).

Fig. 3.

Effects of Chaenomelis Fructus ethanol extract (CF-E) on the expression of osteoclast differentiation marker genes and transcription factor. Bone marrow-derived macrophages were cultured with receptor activator of nuclear factor-κB ligand (100 ng/mL) and macrophage colony stimulating factor (30 ng/mL) treatment in the presence or absence of CF-E (20 μg/mL) for 4 days. Osteoclast differentiation marker genes and transcription factor Nfatc1 expression was examined by real-time polymerase chain reaction. mRNA levels were normalized with Gapdh and expressed as fold change of mRNA level. Data are expressed as the mean ± standard deviation and are representative of three independent experiments.

NS, not significant.

*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001 versus the control group (0 μg/mL CF-E).

Fig. 4.

Effects of Chaenomelis Fructus ethanol extract (CF-E) on receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced intracellular signaling. Bone marrow-derived macrophages were pretreated with/without CF-E (20 μg/mL) for 2 hours in the presence of macrophage colony stimulating factor (MCSF) (30 ng/mL), and then RANKL (100 ng/ mL) treated during the indicated times to stimulate intracellular signaling. Total cell lysate (30 μg) was subjected to sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and analyzed by immunoblotting. (A) The activation of mitogen-activated protein kinases (ERK, JNK, and p38) and IκBα was examined using their respective antibodies. (B) The expression of c-Fos and NFATc1 were detected using the anti-c-Fos and NFATc1 antibody, respectively. (C) PLCγ1 and PLCγ2 activation were detected using the anti p-PLCγ1/ PLCγ1 and p-PLCγ2/PLCγ2 antibody, respectively. Fold change normalized by their nonphosphorylated proteins (A and C) or actin (B) was presented from representative of at least twice independent experiments.

Table

Table 1.

The nucleotide sequences of primers used in this study

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