Introduction
치아는 가장 단단한 경조직이며, 음식물의 저작, 섭취, 공격, 방어를 위해 발달된 조직으로, 조류를 제외한 동물계에서 여러 형태로 널리 존 재하며 동물종에 따라 다양한 형태와 조직상을 보인다[1]. 또한 치아 는 생체 내에서 가장 고도로 석회화된 조직이며, 해부학이나 조직학뿐 만 아니라 인류학, 동물분류학, 생물학, 고생물학, 생체 광물학에 있어 서 중요한 연구 재료로 활용되는 조직이다[2]. 특히, 화석에서 동물종 의 확인(identification)은 화학적•형태학적으로 가장 안정된 조직인 치 아로 행해지는 경우가 많으며, 최근 들어서 치아는 유전자 해석, 유전자 공학, 세포생물학, 의용생체공학, 개인 식별을 위한 법의학 등의 분야에 서 주요 연구 대상이 되고 있다. 이러한 치아 형성은 치성상피(dental epithelium)와 외배엽성 간엽세포(ectomesenchymal cell) 사이의 상피-간엽 간의 상호작용을 통해 조절되는 조화로운 발생 과정을 통 해 이루어진다고 알려져 있다[3,4]. 기관 발생단계 초기에 상피의 신호 전달 체계가 치아 형성 위치를 결정하고 나면 치아 형성 능력이 중간엽 으로 전달되어 치아의 모양과 크기를 결정하는 것으로 알려져 있으며 [3,5] 특히, 모자 시기(cap stage) 치아 발생의 중요한 구조물인 법랑질 결절(enamel knot; 분열하지 않는 상피세포의 치밀한 덩어리 조직)이 형성되면서 다양한 신호전달물질을 발현하여 주변 세포의 분화를 촉진 하는 과정을 통해 치아를 형성하는 것으로 알려져 있다[3].
법랑질 결절은 치아 발생단계 동안 모자 시기 초기에 일차 법랑질 결 절(primary enamel knot)과 종시기에 나타나는 이차 법랑질 결절 (secondary enamel knot)의 형태로 조직단면 상으로 쉽게 확인할 수 있다[6]. 일차 법랑질 결절의 경우, 치아 자체의 형성을 조절하는 신호 전달체계의 중심 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이차 법랑질 결절 의 경우, 교두(cusp)의 형성과 관련된 기능을 하는 것으로 알려져 있 으나 아직까지 그 정확한 기능에 대해 더 많은 연구가 필요한 실정이다 [3,7]. 현재까지 이 두 구조물의 연관성에 대해서는 형태학 및 세포생물 학 수준에서 의견이 정립되지 않고 있지만 서로 어느 정도 영향을 주고 받는 것으로 여겨지고 있다[8]. 기존의 연구를 통해 확인해 본 결과, 일 차 법랑질 결절이 제대로 형성되지 않은 실험동물과 법랑질 결절을 미 세 해부하여 제거한 결과 일차 법랑질 결절이 삭제된 경우 치아 자체의 형성이 저해되는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 일차 법랑질 결절이 치 아 형성에 있어 매우 중요한 역할을 하는 것을 시사한다[3]. 그러나 아 직까지도 일차 법랑질 결절의 정확한 발생생물학적 역할이 규명되지 않 고 있으며, 현재까지 Tabby (Eda), Downless (dl), Crinkled (Eddar) 처럼 비정상적인 어금니 교두 형태를 갖는 자연 돌연변이를 통하여 법 랑질 결절 구조 및 기능에 대해 조금씩 이해하고 있는 수준이다[3,5,7].
일차 법랑질 결절 원기세포는 치아 싹의 끝부분에서 관찰할 수 있는 데, 먼저 p21 유전자를 발현하고 바로 이어서 Shh 유전자를 발현하 는 것으로 알려져 있으며, 일차 법랑질 결절은 모자 시기까지 조직학 적으로 관찰이 가능하며, Bmp-2, Bmp-4, Bmp-7, Fgf-4, Fgf-9, Msx1, Slit-1, Wnt-10b와 같은 많은 신호전달 유전자들을 발현한다 고 알려져 있다[6,9-11].
본 연구논문에서는 치아 발생을 입체적으로 이해하기 위하여 분자생 물학과 기능유전체학 분야의 연구기법을 활용하여 법랑질 결절 조직 특 이적인 신호전달물질들의 발현 양상을 확인하고 이를 분석하여 치아 형 성에 관여하는 신호전달체계를 새롭게 규명하고자 한다.
Materials and Methods
1. 실험동물
실험동물법에 따라 성체 ICR 생쥐는 항온(22℃)이 유지되고 상대습 도가 55%인 동물 사육실에서 인공조명(오전 6시부터 오후 7시까지) 하 에서, 음식과 물에 대한 자유로운 접근이 가능하도록 하였다. 배아는 시 기를 맞추어 임신한 ICR 생쥐에서 수집하였다. 교배를 위해 저녁 7시에 암컷 생쥐 3마리를 수컷 생쥐 1마리가 들어있는 cage에 합사하였고, 다음날 아침 7시에 질 마개(vaginal plug)가 확인된 암컷을 E0로 선정 하여 실험에 필요한 발생 시기까지 사육하였으며, 실험에 필요한 E14 임신 생쥐를 경추 탈구법으로 희생하여 자궁을 절개하고 배아를 적출하 였다. 임신 중인 생쥐 배아의 발생단계별 변이를 감안하여 배아의 형태 를 확인하고 10마리를 선별하여 이전 문헌에서 확인된 형태와 비교하 여 실험에 사용하였다[12]. 본 연구는 경북대학교 동물실험 윤리위원회 (KNU-2012-42)의 승인을 받아 수행되었다.
2. 조직형태학
하악 조직을 미세 해부하여 4% paraformaldehyde에서 24시간 고 정하고, phosphate buffered saline로 24시간 세척 후, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% ethanol에서 30분씩 단계적으로 탈수시켰 다. Xylene에 10분씩 세 번 투명 과정 후, paraffin에서 30분씩 세 번 침투 과정을 실시하였다. Embedding (포매과정)을 거쳐 약 7 mm의 두께로 관상면 박절(frontal paraffin-section)하여 슬라이드 위에서 건조시킨 후 hematoxyiln & eosin (H&E) 조직염색과 조직절편 제자 리보합법(section in situ hybridization)을 실시하였다.
3. 조직절편 제자리보합법
Digoxigenin-labeled RNA probe를 직접 제작 사용하여 68–72℃ 에서 제자리보합법을 이전 논문에서 서술한 바와 같이 시행하였다[13]. Probe 합성을 위한 염기서열은 표로 정리하였다(Table 1)[14-16].
4. 관찰 및 촬영
모든 조직 슬라이드는 DM2500 현미경(Leica, Wetzlar, Germany) 과 디지털 CCD카메라(DF310 FX; Leica)를 사용하여 관찰하고 사진 촬영을 진행하였다.
Results
1. 치아 발생 단계 조직형태학적 변화 및 일차 법랑질 결절의 특징
치아는 발생단계 동안 특이한 조직형태학적 구조를 확인할 수 있는 데, 외배엽성 기원 기관에서 공통적으로 나타나는 일련의 형태형성 과 정이기도 한, 치아 형성 상피가 두꺼워지는 원기 형성 시기(epithelial thickening), 중간엽으로 상피가 파고드는 싹 시기(bud stage), 그리 고 모자 모양의 상피 형태를 확인할 수 있는 모자 시기(cap stage)와 같 은 독특한 상피의 조직학적 구조를 발생단계별로 확인할 수 있다(Fig. 1A, 1B and 1D). 그중 배아 시기 14일째인 모자 시기에서는 상피조직 이 매듭지어진 것처럼 관찰되는 상피 구조물인 일차 법랑질 결절을 확 인할 수 있다(Fig. 1B). 또한 이전 보고와 같이 Fgf4의 발현이 일차 법 랑질 결절 특이적으로 관찰되는 것을 cap stage에서 확인할 수 있었다 (Fig. 1C)[17]. 본 연구에서는 일차 법랑질 결절 특이적인 유전자 발현 을 확인하기 위해 배아시기 14일의 치배를 대상으로 유전자 발현을 분 석하였다.
2. 일차 법랑질 결절 특이적 유전자의 발현 분석
배아시기 14일째의 발생 중인 하악 제1대구치를 조직절편 제작 후 제자리보합법을 이용하여 유전자 발현 정도를 확인하였다(Fig. 2). Dusp26 (Dual Specificity Phosphatase 26)의 경우, 외측 법랑질 상 피(outer enamel epithelium, OEE)와 법랑질 결절 조직에서 발현이 가장 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2A1 and 2A3). 그 리고 내측 법랑질 상피에서도 약한 발현을 확인할 수 있었다(Fig. 2A3). Fat4 (Fat-like cadherin protein FAT-J) 발현은 주로 법랑질 결절 과 외측 법랑질 상피(OEE) 그리고 법랑질 결절 아래에 있는 중간엽 조 직에서 강한 양성 발현을 확인할 수 있었다(Fig. 2B1-2B3). Meis2 (Myeloid Ecotropic Viral Integration Site 1 Homolog 2)의 양성 발 현은 치배의 뺨 측 구강상피에서 강하게 발현되었으며(Fig. 2C3), 법랑 질 결절과 법랑질 상피세포에서는 비교적 약한 양성 발현을 확인할 수 있었다(Fig. 2C1-2C3). Sln (Sarcolipin)의 발현은 주로 발생 중인 혀 의 근육세포가 형성되는 조직에서 관찰되었으며(Fig. 2D1), 치배의 경 우, 법랑질 결절과 법랑질 상피세포에 걸쳐 유전자 발현이 전반적으로 나타났다(Fig. 2D2 and 2D3). 특히 치배의 뺨 쪽의 외측 법랑질 상피 의 발현이 비교적 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2D3). Zpld1 (Zona Pellucida Like Domain Containing 1)의 경우, 뺨 쪽의 외측 법랑질 상피와 법랑질 결절 조직에서 주된 양성 발현을 확인할 수 있었다(Fig. 2E3). 특히 법랑질 결절 조직에서 발현이 강하게 나타남을 확인할 수 있었다.
Discussion
발생생물학과 분자생물학 연구기법의 발달로, 최근에는 치아 형태 형 성 과정을 다양한 실험동물을 통해 확인할 수 있으며, 이와 관련된 유 전자들의 기능 분석을 진행하는 연구가 활발히 진행되고 있는 상태이 다[18]. 특히 치아 형성 과정 동안 치아조직 특이적으로 발현이 확인되 는 특정 유전자들을 대상으로 유전자 조작 실험동물을 제작하여 유전자 의 기능을 분석하는 연구도 진행되고 있으며 이러한 연구는 지난 십여 년간 가장 각광받는 연구주제로 많은 연구자들이 연구를 진행하고 있다 [19,20]. 또한 치아 형성 동안 나타나는 조직의 특성을 이용하여 체외 조직배양을 통해 유전자의 과발현과 억제 등의 연구기법으로 각 유전자 의 기능을 분석하는 연구도 진행되고 있다[17,21].
치아 형성 시기에 유전자 발현에 문제가 생겨 결실되거나 저해된 경 우, 치아의 발생에 큰 문제가 발생하는 후보 신호전달물질들(Bmps , Fgfs, Shh, Wnts)의 경우[22], 배아 전체의 형성 또는 팔다리 및 두개 안면 등 전반적인 조직과 기관의 발생과정 자체가 이루어지지 않는 특 징을 갖고 있다[4,23]. 즉, 지금까지도 치아 특이적인 신호전달체계를 정확하게 확인하지 못한 상태에서, 외배엽성 기원 기관에서 공통적으로 이용하는 신호전달체계에 대한 연구만 진행되고 있는 실정이다[24]. 치 아 발생의 특성상, 매우 복잡하고 많은 유전자들의 발현 변화가 짧은 시 간 내에 동시다발적으로 나타나며 이러한 발현들이 조화롭게 조절되어 복잡한 치아 형태를 형성하는 것으로 알려져 있는데, 이러한 복잡하고 정밀한 유전자 발현 및 이를 제어하는 기작을 이해하기 위해서는 단편 적인 유전자 조작 실험동물모델로는 한계가 있으며, 관련 유전자를 대 량으로 탐색할 수 있는 연구가 필요하다.
본 연구에서는 기존에 진행된 치아 발생 동안에 나타나는 법랑질 결 절의 유전자 발현을 대량으로 분석한 결과를 토대로 후보 유전자들을 선별한 후 그 발현 양상을 section in situ hybridization 기법으로 자세 히 확인하였다(unpublished data). 새로운 법랑질 결절 특이적인 유전 자들의 발현 양상을 자세히 분석하고, 이 유전자들이 치아 발생에 미치 는 영향 및 추측 가능한 분화 조절 기능에 대해 확인하고자 기존에 치아 발생에서 연구된 바 없는 후보 유전자인 Dusp26, Fat4, Meis2, Sln, Zpld1를 대상으로 치아 발생 시기 중 법랑질 결절이 형성되는 시기에서 발현 양상을 확인하는 연구를 진행하였다(Fig. 2).
Dusp26 유전자는 tyrosine phosphatase family의 구성원을 코딩 하고 tyrosine뿐만 아니라 serine, threonine 잔기를 탈인산화 하는 촉 매제 역할을 한다고 알려져 있다[25]. Dusp26는 세포 상황에 따라 종 양 억제제 및 종양 유전자 두 가지의 기능을 한다고 알려져 있다[26]. 이 러한 세포증식 관련 인자의 경우 일차 법랑질 결절의 세포증식 없이 신 호전달 중심으로 작용하는 역할을 설명할 수 있는 발생단계의 신호전달 물질로 설명할 수 있을 것으로 예측된다(Fig. 2A1-2A3)[17]. Fat4는 이전 연구에서 연골의 구조를 형성한다고 알려져 있으며[27], 발생 중 인 조직의 3차원 구조를 형성하는데 중요한 역할을 하는 cadherin 관 련 기능을 갖고 있어 법랑질 결절 자체의 구조를 포함하는 치아의 모양 을 결정하는 상피조직의 입체적인 형태형성 과정에 관여할 것으로 예상 된다(Fig. 2B1-2B3). Homeobox gene인 Meis2는 구개열과 심장질 환(cleft palate, cardiac defects)에 관련되어 있는 것으로 알려져 있 으며[28], 치아의 발생과정에도 형태형성과 관련된 신호전달체계를 매 개하는 역할을 할 것으로 예상된다(Fig. 2C1-2C3). 또한 턱밑 침샘의 분화가 일어나는 조직에서 발현 양상이 강하게 관찰되며(Fig. 2C1), 이 것은 침샘의 기관형성에도 영향을 줄 것으로 예상된다. Sln 은 Ca2+- ATPase의 역할을 하는 막 횡단 단백질이며, 근육세포에서 Ca2+의 ATPase 전송을 촉매하는 역할을 한다고 알려져 있다[29]. 대부분의 발 현이 혀의 발생 중인 근육형성세포에서 나타나는 것을 확인할 수 있었 으며(Fig. 2D1), 치아의 법랑질 결절과 법랑질 상아세포의 형성에도 영 향을 줄 것으로 예측되며(Fig. 2D2 and 2D3), 칼슘 의존 Wnt 신호전 달물질들과의 상호작용도 함께 연구할 수 있을 것으로 예측된다. Zpld1 의 경우, 신경세포의 기능과 형성에 영향을 주는 것으로 알려져 있는데 [30], Zpld1은 단백질 coding 유전자이며, 이전 연구에서 그 발현 양상 과 기능분석이 현재까지 정확하게 알려진 내용이 없는 유전자이다. 향 후 본 연구에서 확인한 후보유전자들의 다양한 기능분석 연구가 필요하 며, 이를 통해 치아 발생과 관련된 유전자 조절기작을 보다 심도있게 이 해할 수 있는 계기를 마련하여야 할 것이다.
본 연구를 통해 확인한 일차 법랑질 결절 특이적으로 발현이 관찰되 는 유전자들을 대상으로 string 10.0 database를 활용하여 이전 연구 결과에서 확인되는 상호관계를 확인해보았으나, 현재까지 확인되는 이 전 연구결과가 없었으며, 특히 법랑질 결절 특이적으로 발현된다고 알 려진 Bmps, Fgfs, Shh, 그리고 Wnt와 같은 유전자들과의 상호관계도 확인하였으나 자세한 발생생물학 분야의 연구가 진행된 결과는 없는 실 정이다(Fig. 3)[6,9,11].
대체적으로 일차 법랑질 결절의 신호에 대한 수용체는 일차 법랑질 결절을 둘러싸고 있는 상피세포와 중간엽 조직에 분포하고 있다고 확인 된다[31,32]. 법랑질 결절은 발생중인 사지의 첨단외배엽융기(apical ectodermal ridge) 조직과 형태학 및 분자생물학적으로 많은 유사점 을 가지고 있는 것으로 알려져 있는데, 두 구조 모두 분열하지 않는 세 포들로 이루어져 있으며 Fgfs, Bmps, Msx2와 같은 신호전달물질을 발현하며 기관의 발생 동안 신호 중심(signaling center)으로서의 기능 을 한다고 알려져 있다[23,33-36]. 팔다리 발생의 경우 현재까지 다양 한 연구가 지속적으로 진행되었으나, 치아 발생동안 나타나는 법랑질 결절에 대해서는 아직까지 연구가 매우 미흡하여 정확한 기능적 차별성 에 대한 분석이 부족하다. 또한, 일차 법랑질 결절과 이차 법랑질 결절 의 차이를 분자수준에서 확인하여 교두의 형성과 같은 치아 형태 형성 에 직접적으로 관여한다고 알려진 이차 법랑질 결절 특이적인 유전자를 발굴하고 그 발현 조절 기작을 면밀히 분석하여 치아의 형태가 상이한 다른 척추동물의 치아발생단계의 종간 분석을 통해 유전자 조절로 치 아 형태 형성이 변화하는 양상을 직접적으로 확인하는 연구가 필요하다 [28].
본 연구에서 확인된 치아 특이적 유전자의 경우, 치아의 다양한 발생 시기에서도 발현 양상을 자세하게 확인하여야 하며, 다양한 기능분석 연구를 통해 신호전달 물질들의 정확한 기능분석을 진행하게 된다면, 치아 발생 특이적인 신호전달 네트워크를 확인할 수 있을 것이며, 이러 한 결과를 치아의 구조 및 기능적 재생을 위한 기반 연구로 활용한다면 치아 재생의 임상 적용도 먼 미래가 아닐 것이라고 생각한다.
