Journal Search Engine

ISSN : 1226-7155(Print)
ISSN : 2287-6618(Online)

International Journal of Oral Biology Vol.45 No.3 pp.84-91
DOI : https://doi.org/10.11620/IJOB.2020.45.3.84

Participation of D-serine and NR2 subunits in EphA4-mediated trigeminal neuropathic pain

Myung-Dong Kim, Min-Ji Kim, Jo-Young Son, Yu-Mi Kim, Jin-Sook Ju, Dong-Kuk Ahn*

Department of Oral Physiology, School of Dentistry, Kyungpook National University, Daegu 41940, Republic of Korea

†

Myung-Dong Kim and Min-Ji Kim contributed equally to this study as first authors.

^*Correspondence to: Dong-Kuk Ahn, E-mail: dkahn@knu.ac.kr

Received May 19, 2020 Review July 6, 2020 Accepted August 20, 2020

Abstract

The present study investigated the participation of D-serine and NR2 in antinociception produced by blockade of central erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma (Eph) A4 (EphA4) signaling in rats with trigeminal neuropathic pain. Trigeminal neuropathic pain was modeled in male Sprague-Dawley rats using mal-positioned dental implants. The left mandibular second molar was extracted under anesthesia, and a miniature dental implant was placed to induce injury to the inferior alveolar nerve. Our current findings showed that nerve injury induced by malpositioned dental implants significantly produced mechanical allodynia; additionally, the inferior alveolar nerve injury increased the expression of D-serine and NR2 subunits in the ipsilateral medullary dorsal horn (trigeminal subnucleus caudalis). Intracisternal administration of EphA4-Fc, an EphA4 inhibitor, inhibited nerve injury-induced mechanical allodynia and upregulated the expression of D-serine and NR2 subunits. Moreover, intracisternal administration of D-amino acids oxidase, a D-serine inhibitor, inhibited trigeminal mechanical allodynia. These results show that D-serine and NR2 subunit pathways participate in central EphA4 signaling after an inferior alveolar nerve injury. Therefore, blockade of D-serine and NR2 subunit pathways in central EphA4 signaling provides a new therapeutic target for the treatment of trigeminal neuropathic pain.

Key Words : Ephrin-A4 , D-serine , NR2 subunits , Trigeminal , Neuropathic pain

초록

키워드 :

This article has been cited by 0 article in crossref

Cited-By

Funding:

National Research Foundation of Korea
2018R1D1A1B07049025

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/bync/4.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Introduction

최근 연구에서 중추신경계에 존재하는 신경교세포가 신경병성통증 (neuropathic pain) 유발에 중요한 작용을 한다는 것[1,2]이 알려지면 서 신경손상 후 유발되는 만성통증 발생기전에 대한 연구가 비약적으로 발전하였다. 일반적으로 알려진 만성통증의 발생기전은 말초신경을 묶 거나 자르거나 하여 신경손상을 유발하거나 척수신경을 손상시켜서 척 수에 존재하는 신경교세포를 활성화하게 되고 이어서 다양한 화학물질 들이 유리되어 유발한다[3-7]. 특히 활성화된 신경교세포는 염증과 관 련되는 다양한 사이토카인(cytokine)이나 키모카인(chemokine)을 유 리하고, 유리된 화학물질들은 신경교세포나 신경세포에 존재하는 수용 기와 결합하여 통증전도를 증가시키는 것[2,8,9]으로 알려져 있다. 이 러한 실험결과는 신경교세포와 신경세포의 연결이 말초신경 손상 후 나 타나는 신경병성통증 유발에 매우 중요하다는 것을 말해주고 있다.

Ephrine (Eph) 수용기는 tyrosine kinase군에 속하는 수용기로서 세포막에 존재하여 인접세포와 결합하여 세포와 세포 사이에서 신호를 전달하는 수용기이다[10]. 일반적으로 신경이 손상되면 신경세포(neuron), 별아교세포(astrocyte), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)에 서 Eph 발현이 증가한다[11]고 알려져 있다. 특히 Ephrin type-A4 (EphA4) 수용기는 실험동물에서 중추신경계가 손상되면 별아교세포에 서 발현이 증가[12]되고, 척수신경 손상 시 별아교세포의 활성화를 조 절한다[13]. 또한 EphA4 수용기를 실험동물에서 제거하거나 차단하면 척수신경 손상 후 나타나는 신경재생과 기능회복을 촉진[12,13]하였으 며, 허혈에 의해 나타나는 해마의 피라미드 신경세포의 사멸을 억제하 였다[14]. 이러한 실험결과는 EphA4 수용기가 신경손상 후 나타나는 신경재생과 회복에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.

최근 연구에서 Eph 수용기나 수용기에 반응하는 리간드(ligand)인 Eph이 만성통증 발생에 중요한 역할을 한다는 것을 보고하였다. EphB 수용기 억제제인 EphB1-Fc을 척수로 주입하면 포르말린에 의해 나타 나는 통증반응이나 신경병증성 통증을 유의하게 억제하였다[15]. 본 연 구실에서 수행한 이전 실험에서 또한 EphA4 수용기 억제제인 EphA4- Fc나 EphA4 siRNA를 소뇌연수조(intracisternal)로 주입하여 EphA4 발현을 억제하면 얼굴영역에서 신경손상으로 발생하는 신경병성통증을 유의하게 억제함을 확인하였다[16]. 이러한 실험결과는 중추신경계에 서 Eph와 관련되는 경로가 만성통증 유발에 중요하다는 것을 보여준다.

신경병성통증의 발생원인은 매우 다양하나 중추성 감작도 매우 중요 한 역할을 한다[17]. N-methyl-D-aspartate (NMDA) 수용기는 중 추성 감작을 통하여 만성통증을 유발하는 중요한 수용기 중의 하나이 다. 최근 연구결과들은 NMDA 수용기의 NR2 subunits이 장기강화나 중추성 감작에 중요하다[18,19]는 것을 보여주고 있다. 특히 NMDA 수용기의 glycine site에 결합하면서 co-agonist로서 작용하는 물질 인 D-serine [20]이 NMDA 수용기를 활성화하여 통증을 증가시키 는[21-23] 역할을 함으로써 만성통증 발생에 중요하게 관여한다[24] 는 것이 선행연구를 통하여 밝혀졌다. 이러한 실험결과는 D-serine과 NR2 subunits을 연결하는 신호조절기전이 신경병성통증과 같은 만 성통증 발생에 중요하게 작용한다는 것을 보여주고 있다. 그러나 Dserine과 NR2 subunits이 EphA4 신호조절에 관여하여 신경병성통 증을 유발시키는지에 연구는 아직까지 밝혀져 있지 않다.

본 연구에서는 악안면 영역에서 발생하는 신경병성통증 발생에 중요 하게 관여하는 EphA4를 통한 신호조절에 D-serine과 NR2 subunits 이 관여하는지 알아보고자 수행하였다. 먼저 아랫니틀신경(mandibular) 손상으로 나타나는 신경병성증성통증이 EphA4를 차단하였을 때 나타나는 진통작용을 관찰하였다. 신경손상 후 삼차신경 척수감각핵 꼬 리핵(trigeminal subnucleus caudalis)에서 D-serine과 NR2에 면 역 염색되는 신경세포 수 변화를 관찰하였으며 EphA4를 차단하였을 때 D-serine과 NR2 함유 신경세포 발현에 미치는 영향을 관찰하였다. 또한 D-serine을 차단하였을 때 신경병성통증 발생에 미치는 영향을 관찰하였다.

Materials and Methods

1. 실험동물

실험동물은 수컷 Sprague-Dawley계 흰쥐(230–280 g)를 사용하 였고, 경북대학교 치의학전문대학원 동물실에서 일정한 온도와 12시 간 주/야 빛 순환주기를 갖는 환경에서 실험동물용 사료와 물을 자유롭 게 공급하여 사육하였다. 본 연구는 경북대학교 실험동물위원회의 승인 (2015-0053)을 얻었으며, 의식이 있는 동물실험에 관한 세계통증연 구학회의 윤리적 규정을 준수하였다. 모든 행동반응의 측정은 블라인드 테스트로 수행하였다.

2. 악안면 신경병성통증 동물모델

실험동물은 ketamine (40 mg/kg)과 xylazine (4 mg/kg) 혼합액으 로 근육으로 주사하여 마취한 뒤, 선행연구에서 사용된 방법과 동일하 게 수술을 실시하였다[25,26]. 아래턱 좌측 제2대구치를 발거하고, 아 래이틀신경 손상을 유발하기 위해 작게 만든 임플란트(직경 1 mm, 길 이 4 mm, MegaGen, Daegu, Korea)를 발치된 부위에 식립하였다. 대조군은 아래턱 좌측 제2대구치를 발거하고 임플란트를 식립하지 않 았다. 실험이 종료된 후 임플란트가 정확하게 아래이틀신경을 손상시킨 것을 확인하였고, 확인된 실험동물만 실험 결과 분석에 사용하였다.

3. 소뇌연수조 내 약물주입

소뇌연수조로 약물을 투여하기 위해 수술을 시행하였다. 약물을 주입 하기 3일 전 실험동물을 ketamine (40 mg/kg)과 xylazine (4 mg/ kg) 혼합액으로 마취하여 뇌정위고정장치(model 900; David Kopf Instruments,Tujunga, CA, USA)에 머리를 고정하였다. 두경부 피 부의 일부를 절개하고, 후두골로부터 근육을 박리하여 고리뒤통수막 (atlantooccipital membrane)의 일부를 노출시켰다. 주사기 바늘(27 gauge)을 사용하여 막에 작은 구멍을 만들고, 소뇌연수조로 약물을 주 입하기 위해 선행연구의 방법[27-30]에 따라 폴리에틸렌 관(PE10; Clay Adams, Parsippany, NJ, USA)을 삽입한 뒤 접착제로 고정시켰 다. 폴리에틸렌관은 두개골 부위로 빼내어 금속 나사못과 치과용 레진 을 사용하여 머리에 고정하였다. 실험동물을 72시간 동안 회복시킨 다 음 약물을 주입하였다. EphA4 수용기 억제제인 EphA4-Fc를 0.1 또 는 1 μg 농도로, D-serine을 파괴하는 효소로 알려져 있는 D-amino acids oxidase (D-AAO)를 2 또는 5 unit 농도로 임플란트 식립 3일 뒤 소뇌연수조로 주입한 다음 이질통증을 평가하였다.

4. 안면 이질통증의 평가

행위반응을 관찰하기 위해 실험동물이 목을 빼내어 자유롭게 움직일 수 있도록 설계된 투명한 플라스틱 관찰용 통에 한 마리씩 넣어 안면영 역에 공기자극(air-puffs)을 받을 수 있도록 하였다. 동물실험은 밝지 않으면서 조용한 곳에서 최소 30분 이상 동물을 안정화시킨 다음 실험 을 실시하였다. 안면영역에 가해지는 연속된 10회의 공기자극(4초 동 안의 지속시간, 10초의 간격)에 반응하여 머리를 회피하거나 깨무는 등 의 공격적인 행동을 통증 행위반사의 평가기준으로 삼았다[31-34]. 공기자극 세기와 간격은 pneumatic pump module (BH2 system, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)로 조절하였다. 공기자극 은 금속관(26 gauge, 10 cm)을 통해 피부로부터 1 cm 떨어진 곳에서 90° 각도로 적용하였다. 자극의 역치는 총 시도한 횟수에서 50% 이상 의 반응을 보인 경우로 평가하였으며[35-37], 40 psi 이상의 자극에서 도 반응이 나타나지 않으면 자극을 중지하였다. 정상적인 동물(naive) 은 40 psi 이하의 압력에서는 어떠한 통증 행위반응도 보이지 않았다.

5. 면역조직화학염색

실험동물(n = 6 per group)은 수술 후 9일째에 0.9% 생리식염수 로 관류하고, 0.1 M phosphates buffer (pH 7.4)에 용해시킨 4% paraformaldehyde로 고정하였다. 숨뇌뒷뿔(caudal medulla)을 적 출하여 동일한 고정액으로 4℃에서 24시간 동안 후고정한 뒤 조직을 다시 4℃에서 30% sucrose 용액에 24시간 두었다. 그 후 조직을 얼 린 뒤, 미세조직절단기를 이용하여 30 μm 두께로 잘랐다. 이어서 비특 이성 항원에 대한 면역반응을 방지하기 위하여 phosphate buffered saline 용액에 0.2% Triton X-100, 5% goat serum을 첨가하여 실 온에서 1시간동안 반응시켰다. 면역조직화학염색은 1차 항체인 Dserine (1:400; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 혹은 NR2 (1:1,000, EDM Millipore, Temecula, CA, USA)를 4℃에 서 24시간 반응시킨 다음, 2차 항체인 Alexa 555-conjugated rabbit IgG antibodies (1:200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 실온 에서 1시간 반응시켰다. 이중면역염색을 위하여 mouse anti-GFAP (1:10,000, Cell Signaling Technology)을 반응시킨 다음 Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG antibody (1:200, Invitrogen) 를 이용하여 염색하였다. 발색된 절편은 형광현미경(BX 41 and URFL- T; Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하고 사진을 촬영하였다. 이미지 분석은 software인 I-solution (Innerview Co., Seongnam, Korea)을 이용하여 분석하였다.

6. 통계분석

실험결과 중 행위반응의 통계분석은 다중 그룹에서 least significant difference post-hoc test에 의한 반복측정자료의 분산분석법과 면역 염색에 따른 발현차이는 일원배치 분산분석법을 이용하여 분석하였다. 통계적인 비교를 위해 통계적 유의성의 표준값은 p ＜ 0.05로 설정하였 다. 모든 결과는 평균 ± 표준 오차(standard error of the mean)로 표 시하였다.

Results

비정상적인 방향으로 삽입한 임플란트에 의해 아래이틀신경을 손상 시켜서 나타나는 실험동물의 통증 행위반응을 평가한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 제2대구치를 발거하고 임플란트를 식립하지 않은 대조군 에서는 이질통증을 평가하는 공기자극역치(air-puffs thresholds)에 아무런 영향을 미치지 않았다. 그러나 임플란트 식립에 의해 신경이 손 상된 실험군은 대조군과 비교하여 볼 때 공기자극 역치가 유의하게 감 소하였다(p ＜ 0.05). 이때 나타나는 기계적 이질통증은 수술 후 1일째 에 발현하여 수술 후 35일까지 지속되었으며 수술 후 40일째 회복되는 것을 관찰하였다.

Fig. 2는 EphA4 수용기 억제제인 EphA4-Fc를 소뇌연수조로 주 입한 다음 신경손상에 의해 유발되는 이질통증에 미치는 영향을 관 찰한 결과를 나타내었다. 신경손상 후 3일째, EphA4 수용기 억제제 인 EphA4-Fc 1 μg를 소뇌연수조로 주입한 다음 나타나는 반응을 vehicle을 주입한 군과 비교하였을 때, 1 μg EphA4-Fc을 주입한 군 에서 신경손상에 의해 유발되는 이질통증을 유의하게 억제하였다(p ＜ 0.05). 그러나 낮은 농도인 0.1 μg EphA4-Fc를 주입하였을 때는 신 경손상에 의해 유발되는 이질통증에 어떠한 영향도 미치지 않았다.

D-serine이 소뇌연수조로 투여한 EphA4-Fc에 의해 나타나는 진통 작용에 관여하는지 알아보기 위하여 신경손상 후 3일째 되는 날 신경병 성통증이 유발된 실험동물에서 D-serine을 형광면역염색을 실시하였 다. 소뇌연수조로 vehicle과 1 μg EphA4-Fc를 주입하여 D-serine 발현에 미치는 영향을 평가하였다(Fig. 3). 이중면역염색법으로 염색한 결과 D-serine을 함유한 신경세포는 별아교세포를 나타내는 GFAP 염 색과 같이 나타났다. 임플란트에 의해 아래이틀신경이 손상된 실험동물 에서는 삼차신경 척수감각핵 꼬리핵에서 아래이틀신경이 투사하는 영 역에 D-serine을 함유하는 신경세포 수가 유의하게 증가하였다. 증가 한 D-serine 함유 신경세포는 소뇌연수조로 주입한 1 μg EphA4-Fc 에 의해 유의하게 감소하였다. 대조군 꼬리핵에서는 D-serine의 형광 면역 반응의 증가를 관찰하지 못하였다.

신경손상 후 별아교세포에서 증가한 D-serine이 신경병성통증 발생 에 미치는 영향을 알아보기 위하여 신경손상 후 3일째 되는 날 D-AAO 를 소뇌연수조로 주입한 다음, 신경손상에 의해 유발되는 이질통증을 관찰한 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 2 또는 5 unit의 농도로 투여한 D-AAO군은 vehicle을 투여한 군과 비교하였을 때 신경손상에 의해 나타나는 이질통증을 유의하게 억제하였다(p ＜ 0.05). 약물의 효과는 주입 10분 이후부터 진통효과를 나타내었으며 2 unit는 주입 후 50분 까지, 5 unit는 90분까지 지속되었다.

EphA4-Fc에 의해 나타나는 진통작용이 NR2 subunits에 관여하는 지 알아보기 위하여 신경손상 후 3일째 되는 날 소뇌연수조로 vehicle 과 1 μg EphA4-Fc를 각각 주입 후 조직을 적출하여 삼차신경 척수감 각핵의 꼬리핵에서 NR2 수용기를 형광면역염색을 실시하여 Fig. 5에 나타내었다. 면역염색된 NR2 subunits을 함유하는 신경세포를 대조군 과 vehicle군을 비교하여 볼 때 신경손상 후 vehicle을 주입한 군에서 NR2 subunits에 반응하는 신경세포 수가 삼차신경 척수감각핵 꼬리핵 에서 유의하게 증가하였다(p ＜ 0.05).

신경손상 후 vehicle을 주입한 군과 1 μg EphA4-Fc를 주입한 군을 비교하여 볼 때 증가된 NR2 subunits를 발현하는 신경세포는 소뇌연 수조로 주입한 1 μg EphA4-Fc군에서 통증이 유의하게 감소하였다(p ＜ 0.05).

Discussion

아래이틀신경의 손상은 악안면 영역에서 이질통증을 유발시켰고 삼 차신경 척수감각핵의 꼬리핵에서 D-serine과 NR2 subunits의 발현 을 증가시켰다. EphA4를 차단하면 이질통증이 감소하였으며, 발현이 증가된 D-serine과 NR2 subunits을 억제하였다. 이러한 실험결과는 EphA4 차단으로 유발되는 진통작용에 D-serine과 NR2 subunits이 작용한다는 것을 보여준다.

중추신경계에서 Eph 수용기와 수용기에 작용하는 리간드인 Eph은 주로 신경과 신경 사이에서 그리고 신경과 신경교세포 사이에서 시냅 스 형성과 조절에 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다[38,39]. 최 근 연구에서 EphA4/EphA3 신호조절은 신경세포와 신경교세포 사 이 글루탐산염을 함유한 시냅스에서 장기강화를 유발시키는 것으로 보 고되었다[40]. 일반적으로 EphA에 의한 신호경로는 해마에서 나타나 는 시냅스의 형성과 조절 등 신경가소성에서 중요하다고 알려져 있으 며[40,41], 신경근육에 존재하는 시냅스에서도 중요하게 작용한다고 보고되었다[42]. 일반적으로 신경세포나 신경교세포 사이에 존재하는 EphA4/EphB3 수용기와 관련된 리간드는 양방향으로 신호를 조절하 는 것으로 알려져 있다[43]. 본 연구에서 아래이틀신경 손상은 실험동 물에서 유의한 이질통증을 유발하였고, EphA4를 차단하면 유의하게 이질통증이 감소하였다. 이러한 실험결과는 선행연구에서 아래이틀신 경 손상으로 나타나는 이질통증이 삼차신경 척수감각핵의 꼬리핵에서 EphA4의 발현을 억제하면 이질통증도 유의하게 억제한 실험결과[16] 와도 일치한다. 이러한 실험결과는 신경손상으로 유발하는 이질통증은 EphA4 발현을 조절하면 억제할 수 있다는 것을 말해주며 신경병성통 증 치료에 EphA4 발현을 조절하는 것이 매우 중요하다는 것을 보여준다.

본 연구에서 아래이틀신경 손상으로 이질통증이 유발된 삼차신경 척 수감각핵 꼬리핵에서 D-serine의 발현이 증가하였으며, 발현이 증가 된 D-serine은 별아교세포의 마커인 GFAP와 같이 발현되었다. 이러 한 실험결과는 신경손상으로 유발된 이질통증에 별아교세포에서 발현 이 증가된 D-serine이 중요하다는 것으로 말해준다. 이러한 사실을 증명하기 위하여 D-serine을 파괴하는 효소로 알려져 있는 D-AAO 를 소뇌연수조로 주입하면 아래이틀신경 손상으로 유발되는 이질통증 을 유의하게 억제하였다. 나아가 EphA4-Fc를 소뇌연수조로 주입하여 EphA4 수용기를 차단하면 신경손상으로 유발되는 이질통증을 억제할 뿐만 아니라 삼차신경 척수감각핵 꼬리핵의 D-serine 발현도 유의하 게 억제하였다. 이러한 실험결과는 신경손상으로 유발되는 이질통증에 EphA4 수용기를 통한 신호조절이 중요하다는 사실과 D-serine이 관 여한다는 것을 보여준다. 중추신경계에서 D-serine이 통증조절에 관 여할 수 있다는 사실은 선행연구에서도 일부 보고되었다. D-serine은 통증조절에 중요한 별아교세포에서 발현되며[44] 시냅스의 장기강화에 작용하여 통증을 조절하고[45], 나아가 D-serine을 주입하면 NMDA 수용기를 활성화시켰다[21]. 이러한 실험결과는 중추신경계에서 Dserine이 신경손상으로 유발하는 만성통증 유발에 매우 중요하게 작용 할 수 있다는 것을 보여주고 있다. 본 실험결과에서 EphA4 수용기를 차단하면 이질통증을 억제할 뿐만 아니라 D-serine의 발현을 유의하 게 억제한 실험결과와 종합해 보면 신경손상으로 유발되는 이질통증에 EphA4 수용기를 통한 D-serine의 조절기전이 매우 중요하게 작용하 며, 이러한 경로를 조절하면 신경병성통증을 조절할 수 있다는 것을 보 여준다.

NMDA 수용기는 척수 수준에서 신경병성통증을 유발하는 중요한 요소 중 하나다[46,47]. 기능적으로 NMDA 수용기는 NR1과 NR2 subunits으로 구성되어 있다[48]. 최근 연구에서 NR2 subunits이 통 증 전도와 조절에 중요하게 작용하는 척수후각에 발현하며[49], 글루탐 산염에 의해 유발되는 통증 신호조절에서 중요하게 작용한다[50]는 실 험 결과는 NR2 subunits이 통증 발생과 전도에 매우 중요하게 작용 한다는 것을 잘 설명하고 있다. 본 연구에서 아래이틀신경 손상으로 삼 차신경 척수감각핵 중 꼬리핵의 척수후각 바깥부위에 NR2 subunits 의 발현이 유의하게 증가하였다. 특히 EphA4를 차단하면 증가된 NR2 subunits의 발현이 유의하게 억제되었다. 이러한 실험결과는 신경손상 으로 유발되는 만성 신경병성통증 유발에 EphA4 신호조절이 중요하며 이때 NR2 subunits이 중요하게 작용한다는 것을 보여준다. 나아가 선 행연구에서 EphA4/EphB3 수용기나 EphB3가 별아교세포에서 Dserine 유리에 중요하게 작용하고[51], D-AAO가 결핍된 실험동물에 서 NMDA에 의해 유도되는 통증반응이 증가한다는 실험결과[52]로 미 루어 볼 때 본 연구에서 신경손상으로 발현이 증가된 D-serine과 NR2 subunits은 서로 밀접한 관계를 가지고 있다고 볼 수 있다.

실험결과를 종합해 보면 아래이틀신경 손상은 실험동물에서 이질통 증을 유발하였고 삼차신경 척수감각핵의 꼬리핵에서 D-serine와 NR2 subunit의 발현을 증가시켰다. EphA4를 차단하면 이질통증을 억제할 뿐만 아니라 발현이 증가된 D-serine와 NR2 subunit을 억제하였다. 나아가 D-serine을 억제하는 D-AAO를 소뇌연수조로 주입하면 신경 손상으로 유발되는 이질통증이 유의하게 억제되었다. 이러한 실험결과 는 EphA4를 억제하여 나타나는 진통작용에 D-serine과 NR2 subunit이 매우 중요하게 작용한다는 것으로 보여주며, 향후 새로운 진통제 의 개발에 EphA4 경로를 조절하는 것이 중요하다는 근거를 제시해 줄 수 있다.

Acknowledgements

This research was supported by the National Research Foundation of Korea (NRF) grant funded by the Korea government NRF-2018R1D1A1B07049025. The authors thank MegaGen (Daegu, Republic of Korea) for providing miniature dental implants.

Figure

Fig. 1.

Changes in the air-puff thresholds after an inferior alveolar nerve injury by a mal-positioned dental implant (MDI). Inferior alveolar nerve injury produces significant attenuation of air-puff thresholds compared to the sham-operated groups. The cut-off pressure was 40 psi and sham animals did not respond to pressures below 40 psi.

*p ＜ 0.05, sham- vs. MDI-treated group. There were eight animals in each group.

Fig. 2.

The effects of treatment with EphA4-Fc, an EphA4 receptor inhibitor, on mechanical allodynia produced by an inferior alveolar nerve injury. On postoperative day 3, intracisternal administration of 1 μg EphA4-Fc produced anti-allodynic effects. Neither vehicle nor low dose of 0.1 μg EphA4-Fc produce anti-allodynic effects.

*p ＜ 0.05, vehicle- vs. EphA4-Fc-treated group. There were eight animals in each group.

Fig. 3.

The effects of intracisternal treatments with EphA4-Fc on the expression of D-serine. D-serine positive signals were rare in the medullary dorsal horn of naive rats. Inferior alveolar nerve injury increased D-serine expression on postoperative day 3. The up-regulation of D-serine expression was reduced following treatments with 1 μg EphA4-Fc. Most of the D-serine immunoreactive signals were co-localized with an astrocyte marker, GFAP. Square box is the magnified images of the arrow. There were six animals in each group. Scale bar, 100 μm.

MDI, mal-positioned dental implant; GFAP, glial fibrillary acidic protein.

Fig. 4.

The effects of treatment with D-amino acid oxidase (D-AAO) on mechanical allodynia after an inferior alveolar nerve injury. On postoperative day 3, intracisternal administration of 2 or 5 unit (U) D-AAO produced anti-allodynic effects compared to the vehicle-treated group.

*p ＜ 0.05, vehicle- vs . D-AAO-treated group. There were eight animals in each group.

Fig. 5.

The effects of treatments with EphA4-Fc on the NR2 expression on postoperative day 3. (A) Inferior alveolar nerve injury produced upregulation of NR2 expression in the medullary dorsal horn. The upregulated NR2 expression was reduced after intracisternal administration of 1 μg EphA4-Fc. Scale bar, 100 μm. (B) Histogram showed quantitative analysis on the fluorescence intensity of NR2 NR2-positive fluoresecence intensity in the medullary dorsal horn. Intracisternal injection of EphA4-Fc produced significant attenuation of NR2 expression compared with the vehicle-treat group. MDI, mal-positioned dental implant.

*p ＜ 0.05, naive vs. MDI treated vehicle group. ^#p < 0.05, vehicle- vs . EphA4-Fc-treated group. There were six animals in each group.

Table

Reference

Watkins LR, Milligan ED, Maier SF. Spinal cord glia: new players in pain. Pain 2001;93:201-5.
Watkins LR, Maier SF. Beyond neurons: evidence that immune and glial cells contribute to pathological pain states. Physiol Rev 2002;82:981-1011.
Colburn RW, Rickman AJ, DeLeo JA. The effect of site and type of nerve injury on spinal glial activation and neuropathic pain behavior. Exp Neurol 1999;157:289-304.
Hashizume H, DeLeo JA, Colburn RW, Weinstein JN. Spinal glial activation and cytokine expression after lumbar root injury in the rat. Spine (Phila Pa 1976) 2000;25:1206-17.
Tanga FY, Raghavendra V, DeLeo JA. Quantitative real-time RT-PCR assessment of spinal microglial and astrocytic activation markers in a rat model of neuropathic pain. Neurochem Int 2004;45:397-407.
Piao ZG, Cho IH, Park CK, Hong JP, Choi SY, Lee SJ, Lee S, Park K, Kim JS, Oh SB. Activation of glia and microglial p38 MAPK in medullary dorsal horn contributes to tactile hypersensitivity following trigeminal sensory nerve injury. Pain 2006;121:219-31.
Xu M, Aita M, Chavkin C. Partial infraorbital nerve ligation as a model of trigeminal nerve injury in the mouse: behavioral, neural, and glial reactions. J Pain 2008;9:1036-48.
Haydon PG. GLIA: listening and talking to the synapse. Nat Rev Neurosci 2001;2:185-93.
Benarroch EE. Central neuron-glia interactions and neuropathic pain: overview of recent concepts and clinical implications. Neurology 2010;75:273-8.
Pasquale EB. Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol 2005;6:462-75.
Goldshmit Y, McLenachan S, Turnley A. Roles of Eph receptors and ephrins in the normal and damaged adult CNS. Brain Res Rev 2006;52:327-45.
Goldshmit Y, Galea MP, Wise G, Bartlett PF, Turnley AM. Axonal regeneration and lack of astrocytic gliosis in EphA4- deficient mice. J Neurosci 2004;24:10064-73.
Goldshmit Y, Spanevello MD, Tajouri S, Li L, Rogers F, Pearse M, Galea M, Bartlett PF, Boyd AW, Turnley AM. EphA4 blockers promote axonal regeneration and functional recovery following spinal cord injury in mice. PLoS One 2011;6:e24636.
Li J, Liu N, Wang Y, Wang R, Guo D, Zhang C. Inhibition of EphA4 signaling after ischemia-reperfusion reduces apoptosis of CA1 pyramidal neurons. Neurosci Lett 2012;518:92-5.
Ruan JP, Zhang HX, Lu XF, Liu YP, Cao JL. EphrinBs/EphBs signaling is involved in modulation of spinal nociceptive processing through a mitogen-activated protein kinases-dependent mechanism. Anesthesiology 2010;112:1234-49.
Kim MJ, Son JY, Ju JS, Ahn DK. Early blockade of EphA4 pathway reduces trigeminal neuropathic pain. J Pain Res 2020;13:1173-1183.
Sandkühler J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev 2009;89:707-58.
Rosenblum K, Dudai Y, Richter-Levin G. Long-term potentiation increases tyrosine phosphorylation of the N-methyl- D-aspartate receptor subunit 2B in rat dentate gyrus in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93:10457-60.
Guo W, Zou S, Guan Y, Ikeda T, Tal M, Dubner R, Ren K. Tyrosine phosphorylation of the NR2B subunit of the NMDA receptor in the spinal cord during the development and maintenance of inflammatory hyperalgesia. J Neurosci 2002;22:6208-17.
Wolosker H. D-serine regulation of NMDA receptor activity. Sci STKE 2006;2006:pe41.
Zhang YH, Shu YS, Zhao ZQ. Substance P potentiates thermal hyperalgesia induced by intrathecal administration of D-serine in rats. Acta Pharmacol Sin 2001;22:817-20.
Muth-Selbach U, Hermanns H, Stegmann JU, Kollosche K, Freynhagen R, Bauer I, Lipfert P. Antinociceptive effects of systemic lidocaine: involvement of the spinal glycinergic system. Eur J Pharmacol 2009;613:68-73.
Miraucourt LS, Peirs C, Dallel R, Voisin DL. Glycine inhibitory dysfunction turns touch into pain through astrocyte-derived D-serine. Pain 2011;152:1340-8.
Dieb W, Hafidi A. Astrocytes are involved in trigeminal dynamic mechanical allodynia: potential role of D-serine. J Dent Res 2013;92:808-13.
Han SR, Yeo SP, Lee MK, Bae YC, Ahn DK. Early dexamethasone relieves trigeminal neuropathic pain. J Dent Res 2010; 89:915-20.
Lee MK, Han SR, Park MK, Kim MJ, Bae YC, Kim SK, Park JS, Ahn DK. Behavioral evidence for the differential regulation of p-p38 MAPK and p-NF-κB in rats with trigeminal neuropathic pain. Mol Pain 2011;7:57.
Ahn DK, Choi HS, Yeo SP, Woo YW, Lee MK, Yang GY, Jeon HJ, Park JS, Mokha SS. Blockade of central cyclooxygenase (COX) pathways enhances the cannabinoid-induced antinociceptive effects on inflammatory temporomandibular joint (TMJ) nociception. Pain 2007;132:23-32.
Won KA, Park SH, Kim BK, Baek KS, Yoon DH, Ahn DK. Intracisternal administration of voltage dependent calcium channel blockers attenuates orofacial inflammatory nociceptive behavior in rats. Int J Oral Biol 2011;36:43-50.
Yaksh TL, Rudy TA. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol Behav 1976;17:1031-6.
Yang KY, Kim HK, Jin MY, Ju JS, Ahn DK. Glia dose not participate in antinociceptive effects of gabapentin in rats with trigeminal neuropathic pain. Int J Oral Biol 2012;37:121-9.
Ahn DK, Jung CY, Lee HJ, Choi HS, Ju JS, Bae YC. Peripheral glutamate receptors participate in interleukin-1beta-induced mechanical allodynia in the orofacial area of rats. Neurosci Lett 2004;357:203-6.
Ahn DK, Kim KH, Jung CY, Choi HS, Lim EJ, Youn DH, Bae YC. Role of peripheral group I and II metabotropic glutamate receptors in IL-1beta-induced mechanical allodynia in the orofacial area of conscious rats. Pain 2005;118:53-60.
Ahn DK, Lim EJ, Kim BC, Yang GY, Lee MK, Ju JS, Han SR, Bae YC. Compression of the trigeminal ganglion produces prolonged nociceptive behavior in rats. Eur J Pain 2009a; 13:568-75.
Ahn DK, Lee SY, Han SR, Ju JS, Yang GY, Lee MK, Youn DH, Bae YC. Intratrigeminal ganglionic injection of LPA causes neuropathic pain-like behavior and demyelination in rats. Pain 2009b;146:114-20.
Jung CY, Choi HS, Ju JS, Park HS, Kwon TG, Bae YC, Ahn DK. Central metabotropic glutamate receptors differentially participate in interleukin-1beta-induced mechanical allodynia in the orofacial area of conscious rats. J Pain 2006;7:747-56.
Ahn DK, Lee MK, Yoon JH, Park MK, Yang GY, Won KA, Park YY. The intracisternal administration of MEK inhibitor attenuates mechanical and cold allodynia in a rat model of compression of the trigeminal ganglion. Int J Oral Biol 2010;35:75-81.
Yang CS, Jung CY, Ju JS, Lee MK, Ahn DK. Intracisternal administration of mitogen-activated protein kinase inhibitors reduced IL-1beta-induced mirror-image mechanical allodynia in the orofacial area of rats. Neurosci Lett 2005;387:32-7.
Klein R. Bidirectional modulation of synaptic functions by Eph/ ephrin signaling. Nat Neurosci 2009;12:15-20.
Murai KK, Pasquale EB. Eph receptors and ephrins in neuronastrocyte communication at synapses. Glia 2011;59:1567-78.
Filosa A, Paixão S, Honsek SD, Carmona MA, Becker L, Feddersen B, Gaitanos L, Rudhard Y, Schoepfer R, Klopstock T, Kullander K, Rose CR, Pasquale EB, Klein R. Neuron-glia communication via EphA4/ephrin-A3 modulates LTP through glial glutamate transport. Nat Neurosci 2009;12:1285-92.
Murai KK, Nguyen LN, Irie F, Yamaguchi Y, Pasquale EB. Control of hippocampal dendritic spine morphology through ephrin-A3/EphA4 signaling. Nat Neurosci 2003;6:153-60.
Lai KO, Ip FC, Cheung J, Fu AK, Ip NY. Expression of Eph receptors in skeletal muscle and their localization at the neuromuscular junction. Mol Cell Neurosci 2001;17:1034-47.
Pasquale EB. Eph-ephrin bidirectional signaling in physiology and disease. Cell 2008;133:38-52.
Henneberger C, Bard L, Rusakov DA. D-Serine: a key to synaptic plasticity? Int J Biochem Cell Biol 2012;44:587-90.
Ying B, Lü N, Zhang YQ, Zhao ZQ. Involvement of spinal glia in tetanically sciatic stimulation-induced bilateral mechanical allodynia in rats. Biochem Biophys Res Commun 2006;340: 1264-72.
Petrenko AB, Yamakura T, Baba H, Shimoji K. The role of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors in pain: a review. Anesth Analg 2003;97:1108-16.
Zhou HY, Chen SR, Pan HL. Targeting N-methyl-D-aspartate receptors for treatment of neuropathic pain. Expert Rev Clin Pharmacol 2011;4:379-88.
Paoletti P, Neyton J. NMDA receptor subunits: function and pharmacology. Curr Opin Pharmacol 2007;7:39-47.
Laurie DJ, Bartke I, Schoepfer R, Naujoks K, Seeburg PH. Regional, developmental and interspecies expression of the four NMDAR2 subunits, examined using monoclonal antibodies. Brain Res Mol Brain Res 1997;51:23-32.
Kato H, Narita M, Miyatake M, Yajima Y, Suzuki T. Role of neuronal NR2B subunit-containing NMDA receptor-mediated Ca2+ influx and astrocytic activation in cultured mouse cortical neurons and astrocytes. Synapse 2006;59:10-7.
Zhuang Z, Yang B, Theus MH, Sick JT, Bethea JR, Sick TJ, Liebl DJ. EphrinBs regulate D-serine synthesis and release in astrocytes. J Neurosci 2010;30:16015-24.
Wake K, Yamazaki H, Hanzawa S, Konno R, Sakio H, Niwa A, Hori Y. Exaggerated responses to chronic nociceptive stimuli and enhancement of N-methyl-D-aspartate receptor-mediated synaptic transmission in mutant mice lacking D-aminoacid oxidase. Neurosci Lett 2001;297:25-8.