Introduction

질병을 개선하고 건강을 증진하기 위해 약용식물을 사용하는 것은 인 류의 역사만큼 오래된 방법이다[1]. 그 중 무화과는 인간에게서 처음으 로 경작된 식물로 그 역사는 11,000년 이상 된 것으로 보고되고 있다 [2]. 무화과(Ficus carica L.)는 아열대성 반교목성 낙엽활엽수로 뽕나 무(Moraceae)에 속하며, 서아시아에서 시작되어 인간에 의해 지중해 로 퍼져 현재는 전 세계 곳곳에서 재배되고 있다[3]. 민간요법으로 무화 과의 잎은 위장질환(복통, 소화 불량 및 식욕부진), 과실은 호흡기질환 (인후염, 기침 및 기관지염), 뿌리는 염증 및 심혈관 질환 치료를 담당하 는 등 질병에 따라 사용하는 부위가 명확하게 구분되어 있다[4,5]. 무화 과는 무화과에 다량 함유되어 있는 비타민과 미네랄의 건강-증진 성질 과 더불어 민속의약 오랜 사용으로 질병 완화를 위한 다양한 연구의 소 재가 되고 있다[3-5]. 무화과 나무는 잎, 줄기 및 목질부의 메탄올추출 물에서 psoralen, bergapten, β-sitosterol과 같은 항균 및 항산화 물 질이 존재한다고 보고되었으며, 최근에는 무화과 잎 추출물(열수, 메탄 올)이 유방암 세포주 Hela, MDA-MB-231와 간암세포주 Huh7it의 세포성장을 억제시키고, 세포사멸을 유도한다고 보고되어 있다[6-8]. 그러나 무화과 잎 추출물의 구강암에 대한 항암효과 및 그 기전은 아 직 밝혀지지 않았으며, 본 연구를 통해 FaDu 사람 인두 편평암세포종 에 대한 무화과 잎 메탄올추출물(methanol extracts of Ficus carica, MeFC)의 항암효능을 밝히고자 한다.

구강암(oral cancer)은 편평상피세포 암종(squamous cell carcinoma), 우상암종(verrucous carcinoma), 소타액선 암종(minor salivary gland carcinoma), 림프종(lymphoma) 및 양성 구강 종양 (benign oral cavity tumors)으로 분류하며, 구강암의 90% 이상이 편 평상피세포 암종이다[9]. 편평상피세포 암종은 타고난 림프절 전이 능 력 때문에 다른 조직으로 쉽게 침윤되기 때문에 치료가 쉽지 않으며 5 년 생존율이 약 20% 정도로 예후가 매우 좋지 않다[10,11]. 암은 세포 사멸이 적절히 조절되지 않아 비정상세포가 과다 증식하는 것이 특징으 로 많은 항암연구는 암세포의 성장억제, 세포주기 조절 및 세포사멸 기 전을 밝히는 것에 중심을 두고 있다[12]. 그 중, 세포사멸(apoptosis) 은 유전학적으로 조절되는 세포사의 한 형태를 의미하며, 세포 수를 조 절하기 위한 항상성 기전 또는 외부로부터 손상을 입은 세포를 제거 하기 위한 방어 기전으로 발생한다[12-14]. 세포사멸은 외인성 및 내 인성 신호전달경로를 통해 유발되는 것으로, 외인성 신호전달경로는 death-receptor에 리간드가 결합하면 caspase-8의 가수분해가 유 도되고 이는 caspase-9, -3, -7이 가수분해를 촉진시킨다[12-14]. 또, caspase-8의 가수분해는 미토콘드리아-의존성 경로인 내인성 신 호전달경로를 활성화시켜 Bcl-2가 세포질 내로 cytochrome C의 방 출을 촉진하며 이에 apaf-1과 caspase-9이 apoptosome을 이루면 서 caspase-9의 가수분해를 촉진한다[12-14]. 이러한 세포사멸의 두 경로는 궁극적으로 손상된 DNA를 복구하는 poly (ADP-riboe) polymerase (PARP) 단백질의 가수분해를 유도하여 세포사멸을 일으킨다 [15]. 그러므로 암세포의 세포사멸 기전에서 caspase 신호전달경로와 미토콘드리아-의존성 신호전달경로는 매우 중요한 기전으로 대부분 항 암제의 세포사멸 기전이며 지표이다[16,17].

본 연구에서는 무화과 잎을 메탄올 추출하여 사람 유래 인두 편평암 세포 FaDu에서의 세포 성장억제 효과 및 그 억제 기전을 밝히고자 하 며, 아울러 천연물을 이용한 항암제 개발의 강력한 후보물질로서 기초 를 제공하고자 한다.

Materials and Methods

1. 실험재료

본 실험에 이용된 무화과 잎은 7월에 전라남도 화순에서 채취하였 으며, crystal violet, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)와 4’6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용 하였다. Live & Dead viability/cytotoxicity kit는 Molecular probe (Eugene, OR, USA)에서 구입하여 사용하였다. 1차 항체인 cleaved caspase-9, -3, PARP, Bcl-2 및 Bax는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, α-tubulin은 Thermo Fisher Scientific (Mt Prospect, IL, USA)에서 구입하여 사 용하였다.

2. 무화과 잎(Leaf of Ficus carica L.) 메탄올추출물 제조 방법

무화과 잎 10 g을 메탄올 400 mL에 24시간 동안 추출하고 거름종 이를 이용하여 추출액을 거른 뒤 감압 농축하였다. 동결건조 후 분말 추 출물을 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 100 mg/mL로 녹여 filtering 한 후 –20℃에 보관하였으며, 여러 가지 농도로 세포배양액에 희석하여 사용하였다.

3. 세포 배양

사람 유래 하인두 편평암세포 FaDu (ATCC No, CCL17)와 마우스 유래 피하결합조직 정상세포 L929 (ATCC No, CCL1)는 각각 minimum essential medium (MEM, Welgene, Gyeongsan, Korea)과 Dulbecco’s modified eagles medium (DMEM, Welgene)에 10% fetal bovine serum (FBS, iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea) 및 항생제(100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin) 를 첨가한 배지를 이용하여, 5% CO₂, 37℃ incubator에서 배양하면서 실험에 이용하였다.

4. 세포 생존 효과 분석

추출물에 대한 각 세포 생존율은 MTT assay를 통해 분석하였다. 12-well cell culture plate에 well 당 2 × 10⁵개의 세포를 접종하여 18시간 배양한 후, MeFC를 다양한 농도(0.25, 0.5, 1, 2, 4 mg/mL) 로 처리한 후 24시간 반응하였다. 반응 후 배양액을 제거하고 인산 완충 용액으로 두 번 세정한 다음 900 µL 배양액과 100 µL MTT (5 mg/ mL) 용액을 첨가하여 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 4시간 반응하였다. 반응 후, 배양액을 제거하고 형성된 formazan을 녹이기 위해 DMSO 를 첨가하여 교반기에서 20분간 용해하였다. 완전히 용해되면 ELISA reader (Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하 여 570 nm 흡광도에서 세포 생존율을 측정하였다. 결과 분석은 시료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도를 생존율 100%로 하고 시료를 처리한 실험군의 흡광도를 대조군과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

5. Colony formation

6-well cell culture plate에 well 당 2 × 10³개의 FaDu 및 L929 세포를 접종하여 18시간 배양한 후, FaDu 세포에 대한 MeFC의 세포 독성이 없는 농도(0.25 mg/mL)와 cytotoxicity를 유도하는 가장 낮 은 농도(0.5, 1 mg/mL)를 24시간 동안 반응하였다. 반응 후, 3일마 다 배양액을 교체하면서 10일 동안 배양한 다음, 배양액을 제거하고 phosphate-buffered saline (PBS)로 가볍게 세정한 다음 95% 에 탄올을 이용하여 10분간 고정하였다. 고정 후 말린 다음 0.1% crystal violet 용액을 첨가하여 10분간 염색하였다. Dstilled water로 염색되 지 않은 부분을 제거한 후 Canon G16 (Canon, Tokyo, Japan)으로 형성된 colony를 관찰하였다.

6. Live & dead assay

4-well chamber slide에 well 당 1 × 10⁵개의 FaDu 세포를 접종 하여 18시간 배양한 후, MeFC를 처리한 후 24시간 반응하였다. 반응 후 배양액을 제거하고 인산 완충 용액으로 두 번 세정한 다음 PBS에 Calcein-AM과 Ethd-1을 1:1 혼합한 혼합액을 각 well에 200 µL씩 첨가한 후 20분간 반응하였다. 염색약을 제거하고 mounting하여 형광 현미경(Eclipse TE2000; Nikon Instruments, Melville, NY, USA) 을 이용한 후 녹색으로 염색된 살아있는 세포와 빨간색으로 염색된 죽 은 세포를 관찰하였다.

7. DAPI stain

4-well chamber slide에 well 당 1 × 10⁵개의 FaDu 세포를 접종 하여 18시간 배양한 후, MeFC를 처리한 후 24시간 반응하였다. 반응 후, 인산 완충 용액으로 세정한 다음 4% paraformaldehyde로 10분 간 고정하고 DAPI (300 nM)를 첨가하여 5분간 염색하였다. 인산 완충 용액으로 가볍게 세정한 다음 mounting하여 cover glass를 덮고 형광 현미경(Eclipse TE2000; Nikon Instruments)을 이용하여 핵의 형태 와 염색질의 분절화를 관찰하였다. 핵이 응축되어 크기가 작고 염색질 이 조각나 있거나 막 투과성이 비정상적으로 증가되어 핵 염색이 진하 게 되었을 때 세포사멸이 일어난 세포로 판단하였으며, 정상세포와 세 포사멸이 일어난 세포를 counting하여 백분율(%)로 나타내었다.

8. 단백질 면역 발색법

6-well cell culture plate에 well 당 4 × 10⁵개의 FaDu 세포를 접종하여 18시간 배양한 후, MeFC를 처리하여 24시간 동안 반응 한 뒤, 부유세포 및 plate에 붙어있는 세포를 모두 수확하였다. 수확 한 세포를 PBS로 두 번 세정한 다음, protein lysis buffer (iNtRON Biotechnology)를 첨가하여 매 10분마다 vortexing하면서 30분간 반응하여 단백질을 추출하였다. 추출한 total protein은 BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA)을 이용하여 정량하였다. 20 µg 단백질을 5X sample buffer와 혼합하여 100℃에서 5분간 변성 시킨 뒤, 10% 혹은 15% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis에서 전기영동한 후, polyvinylidene fluoride membrane으로 이동시켰다. Membrane은 5% blocking solution (5% bovine serum albumin in tris-buffered saline [TBS] containing 0.1% Tween-20)에서 30분 동안 blocking하고, 1차항체인 cleaved caspase-9, cleaved caspase-3, cleaved PARP, Bax, Bcl-2는 1:1,000으로 희석하고, α-tubulin은 1:2,500으로 희석하 여 4℃에서 overnight 반응하였다. 이후, TBS-T로 15분씩 세 번 세척 한 다음, horseredish peroxidase가 접합된 이차항체로(1:5,000) 실 온에서 1시간 반응한 다음 TBS-T로 15분씩 세 번 세척하였다. 결과 분석은 ECL kit (Millpore, Bedford, MA)을 이용하여 MicroChemi 4.2 (DNR Bio-Imaging Systems Ltd., Jerusalem, Israel)를 통해 protein band를 가시화하였으며, 각 밴드는 Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 그래프화 하였다.

9. 실험자료의 통계학적 검정

모든 실험성적은 mean ± standard deviation으로 나타내었고, 각 실험군 간의 유의성 검정은 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 이용하여 Tukey t-test를 하였으며, p-value가 0.05 미만(p ＜ 0.05)의 경우에서 통계적 유의성이 있는 것 을 간주하였다.

Results

1. MeFC에 대한 마우스 섬유아세포 L-929의 독성 평가

마우스의 섬유아세포 L-929에 대한 MeFC의 독성을 평가하기 위하 여 MTT assay를 수행하였다. MeFC를 다양한 농도(0.25, 0.5, 1, 2, 4 mg/mL)로 24시간 처리한 결과, 세포 증식에 농도 간의 유의할 만한 차이가 없었으며 독성 또한 나타나지 않았다(Fig. 1A). 이것은 MeFC가 정상 세포에 대해 독성이 없음을 시사하고 있으며, MeFC의 암세포에 대한 성장억제 효과를 확인하기 위하여 정상 세포에서 독성이 전혀 없 는 범위인 4 mg/mL까지를 최고농도로 설정하여 본 실험을 진행하였 다.

2. MeFC에 의한 사람 인두 편평암세포 FaDu의 성장억제 효과

MeFC가 사람 인두 편평암세포 FaDu 성장에 미치는 영향을 알아 보기 위해 마우스의 섬유아세포 L-929와 같은 농도(0.25, 0.5, 1, 2, 4 mg/mL)로 24시간 동안 처리하였다. 그 결과, 1 mg/mL 처리한 FaDu 암세포에서 약 20% 세포성장이 억제되었으며, 이후 농도-의존 적으로 성장을 억제하였다(Fig. 1B). 이러한 성장억제 효과가 FaDu 및 L929 세포의 무제한 재생(증식) 능력 또한 억제할 수 있는지를 colony formation 분석을 통해 평가하였다. 세포독성이 나타나지 않는 농도 0.25 mg/mL, 세포독성을 나타내는 가장 낮은 농도 0.5 mg/mL 및 약 20% 세포 성장억제를 보이는 1 mg/mL을 FaDu 및 L929 세포에 24시간 동안 처리한 후, crystal violet 염색을 통해 형성된 colony를 분석하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 1 mg/mL를 처리한 실험군에 서 거의 완전하게 FaDu 암세포의 colony 형성을 저해하였으며, 세포 독성이 없는 농도 0.25 mg/mL과 세포독성을 나타내는 가장 낮은 농 도 0.5 mg/mL에서도 colony 형성이 저해되는 것을 확인하였다(Fig. 1C). 반면, L929 세포에는 영향을 미치지 못한 것을 확인하였다(Fig. 1C). 이는 MeFC가 FaDu 암세포의 성장억제와 재생억제에 효과적임 을 시사한다. 통계적으로 유효한 억제 효과를 나타내는 투여량은 1–4 mg/mL이었으므로, 이후 모든 실험은 세포 성장억제 효과를 확실히 보 이는 1.5 및 3 mg/mL로 24시간 동안 처리하여 수행하였다.

3. Live & dead 염색을 이용한 MeFC에 의한 FaDu 암세포의 세포사멸

MeFC에 의한 암세포 증식 억제 효과가 세포사멸과 관련 있는지 확 인하기 위해 live & dead assay를 수행하였다. FaDu 암세포에 MeFC 를 1.5 및 3 mg/mL로 24시간 동안 처리한 후 live-dye와 dead-dye 를 염색하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 관찰한 결과, 대조군보다 1.5 및 3 mg/mL의 추출물을 처리한 실험군에서 농도-의존적으로 살 아있는 세포를 나타내는 녹색형광이 점차 감소하였으며 죽은 세포를 나 타내는 붉은 형광은 점차 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 2).

4. DAPI 염색을 이용한 MeFC에 의한 FaDu의 세포핵 형태 변화

세포사멸로 인해 나타나는 특이적인 핵의 형태학적 변화를 관찰하기 위해 DAPI stain을 수행하였다. DAPI 분자는 세포 내 핵에 특이적으 로 결합하는 형광물질로, 세포사멸이 유발되었을 때 세포질의 위축, 비 정상적인 막 투과성으로 인한 진한 핵 염색, 염색질의 응축과 깨짐 등 핵의 형태학적 변화를 관찰함으로써 세포사멸의 발생 정도를 확인할 수 있다. FaDu 암세포에 MeFC를 1.5 및 3 mg/mL로 24시간 동안 처리 한 후 DAPI 염색을 수행한 결과, 대조군(2%)과 비교하여 1.5 mg/mL 을 처리한 실험군에서 6배(18%), 3 mg/mL을 처리한 실험군에서 18 배(36%)로 사멸된 세포가 증가함을 확인하였다(Fig. 3). 이는 MeFC의 FaDu 암세포 성장억제가 세포사멸과 관련 있음을 시사하고 있다(Fig. 3).

5. MeFC에 의한 FaDu 암세포의 세포사멸에 관여하는 단백질 발현

Caspase는 세포의 손상 및 스트레스 신호가 오면 가수분해되어 cleaved가 일어나면서 세포사멸 활성을 가지게 되므로 이들 효소의 활 성은 세포사멸 분석을 위한 중요한 인자로 평가된다. 따라서 MeFC에 의한 FaDu의 세포사멸이 caspase의 활성과 관련되어있는지 확인하 기 위해 cleaved caspase의 단백 발현을 분석하였다. FaDu 암세포에 MeFC 1.5 및 3 mg/mL을 24시간 동안 처리한 결과, caspase-9 및 caspase-3의 가수분해가 유도되었으며 이에 PAPR에 가수분해가 일 어남으로써 세포사멸이 유도됨을 확인하였다(Fig. 4). 또한, 미토콘드리 아 외막에서 세포사멸을 조절하는 Bcl-2 family 단백 발현을 확인한 결 과, MeFC 처리한 실험군에서 항-세포사멸 인자인 Bcl-2의 단백 발현 이 감소하였으며 세포사멸 인자인 Bax의 단백 발현이 증가함을 확인하 였다(Fig. 4). 이러한 결과는 MeFC의 FaDu 암세포에 대한 증식억제 효과가 caspase 및 미토콘드리아 세포사멸 경로를 통해 매개됨을 시사 한다.

Discussion

무화과(Ficus carica L.)는 뽕나무과(Moraceae)에 속하는 식물로 수분과 칼슘함량이 매우 높고, 지방과 나트륨 함량이 적어 콜레스테 롤을 저하시키는 건강 과일로 알려져 있으며, 전통의학에서는 소화촉 진, 변비완화, 어독, 청열해독 등과 같은 증상 치료제로 사용되어 왔다 [3,4,6]. 또, 무화과는 세균, 효모, 곰팡이 등 다양한 미생물에 대해 광범 위한 항균효과와 항산화 능력에 따른 항고지혈증 효과가 있다고 보고되 었으며, 최근에는 유방암, 간암, 위암, 식도암 등의 다양한 세포주에서 세포사멸을 통한 항암 효능이 보고되었다[7,8,18,19]. 그러나 이러한 오랜 전통과 다양한 연구에도 불구하고 구강암에 대한 항암 활성은 아 직 보고된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 무화과 잎 메탄올추출물의 사 람 하인두 편평상피암세포 FaDu에서 암세포 성장 억제효과와 그 분자 적 기전을 연구하였다.

암세포의 가장 대표적인 특징이 과도한 증식이므로, 우리는 가장 먼 저 MeFC가 FaDu 암세포의 증식에 영향을 주는지 분석하기 위해 MTT assay를 수행하였다. MeFC를 FaDu 암세포에 다양한 농도로 24시간 처리한 결과, 0.5 mg/mL부터 농도-의존적으로 암세포의 증식이 억제 하는 것을 확인하였으며, 정상세포인 L929세포의 증식에는 영향을 미 치지 않았다. 또, 암세포의 콜로니 형성능력을 분석하기 위해 MeFC를 FaDu 암세포에 24시간 처리한 후 10일간 성장배지에서 배양한 결과, 세포독성이 없는 0.25 mg/mL에서 콜로니 형성을 효과적으로 억제하 였으며, 이후 농도-의존적으로 콜로니 형성이 저해되었다. 이러한 결과 는 무화과 잎의 다른 암세포의 증식 억제효과와 비슷한 결과로, 무화과 잎 열수추출물과 메탄올추출물은 각각 유방암 세포주 MDA-MB-231 와 간암 세포주 Huh7it의 증식을 농도-의존적으로 억제하였다[7,8]. 특 히, 간암세포에서 무화과 잎 메탄올추출물의 IC₅₀값은 7.9875 µg/mL 로 구강암세포주인 FaDu (IC₅₀ = 3.8 mg/mL)에 비해 더 민감하게 반 응하였다[8]. 이러한 결과는 Purnamasari의 연구팀이[8] 추출에 사용 한 무화과 잎의 양(100 g)과 추출시간(3일)이 본 연구팀의 추출방법(10 g, 1일)과 상이하여 효능에서 차이가 나타나는 것으로 생각하며, 더 효 과적인 추출방법을 선택하기 위해서는 더 많은 암세포에서의 연구가 필 요하며 각 추출물의 성분분석 및 활성성분의 함량 또한 고려되어야 할 것이다. 암세포의 증식만 억제하고 정상세포의 증식에는 영향을 미치 지 않는 것은 항암제의 부작용을 줄일 수 있는 가장 효과적인 방법이다 [20]. 본 연구결과, 정상세포인 L929세포의 증식에 최고농도인 4 mg/ mL까지 영향을 미치지 않았으며, 마찬가지로 Zhang 연구팀[7]의 결 과에서도 무화과 잎 열수추출물의 최고농도(8 mg/mL)까지 정상세포 (MCF-10A)의 증식에 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 무화과 잎 추출물이 암세포에 선택적인 증식억제 효과를 나타낼 수 있음을 시사한 다.

MeFC에 의한 FaDu 암세포의 증식억제 효과가 세포사멸에 의한 것 인지 알아보기 위해 live & dead assay와 DAPI stain을 수행한 결과, MeFC 농도-의존적으로 죽은 세포를 의미하는 붉은 형광이 증가하는 것을 확인하였으며, DAPI 염색결과에서도 세포사멸의 특징인 핵의 응 축과 염색질의 분절이 관찰되었다. 이러한 결과는 다른 여러 추출물의 암세포 증식억제 기전 연구결과와 일치하는 것으로, 오이풀 열수추출 물을 대장암세포주(HCT-116, RKO)에 처리하자 시간- 및 농도-의존 적으로 세포 증식을 억제하였으며 DAPI 염색결과를 통해 추출물의 암 세포 증식억제가 세포사멸 기전을 통해 매개될 수 있음을 확인하였다 [21]. 또, 다형성교모세포종 암세포 및 유방암 세포주에 붉은토끼풀 잎 에탄올추출물을 처리하자 autophagy를 통해 농도-의존적으로 세포 사멸이 유도되는 것을 acridine orange/ethidium bromide double staining와 TUNEL staining을 통해 확인하였다[22,23]. 암세포의 과 다증식은 세포사멸이 정상적으로 조절되지 않아 유발되는 것으로 암세 포의 세포사멸 유도는 항암제 개발에서 매우 중요한 지표이다[19]. 그 러므로 MeFC에 의한 FaDu 암세포의 세포사멸 기전을 규명하기 위 해 세포사멸을 조절하는 주요 인자인 caspase의 활성을 분석하였다. Caspase 중에서 caspase-3, -7, -8 및 -9가 apoptosis를 유도하는 단백질로 알려져 있으며, proteolytic cleavage 현상을 통해 그 활성을 일으킨다[12-14,24]. PARP는 손상된 DNA를 복구하는 역할을 하는 단백질로 cleaved caspase-3에 의해 가수분해되며 apoptosis의 궁 극적인 지표로 알려져 있다[15]. 본 연구 결과, MeFC를 처리한 실험군 에서 caspase-9, -3 및 PARP의 단백질이 가수분해됨을 확인하였다. 또, 미토콘드리아-의존적인 세포사멸 인자인 Bcl-2 (항-세포사멸 인 자)와 Bax (세포사멸 인자)의 단백 발현을 확인한 결과, Bcl-2 단백 발 현이 현저히 감소하였으며 Bax 단백 발현이 농도-의존적으로 증가함을 확인하였다. 이는 Purnamasari 연구팀의[8] 간암에서 무화과 잎 메탄 올추출물의 항암기전과 일부 일치하는 것으로, 무화과 잎 메탄올추출물 의 간암세포 증식억제효과가 세포사멸 및 세포괴사를 통해 유도된다고 보고하였다. 세포괴사(necrosis)는 치명적인 외부인자들에 의해 세포 가 살해당하는 것으로 자연사인 세포사멸과는 죽는 과정에 차이가 있으 나 서로 연속성상에 있다. Zhang 연구팀은[7] 유방암세포에서 무화과 잎 열수추출물의 증식억제효과가 caspase 및 미토콘드리아-의존적인 세포사멸 기전에 의해 매개된다고 보고하였다. 그러나 무화과 잎의 항 암효과를 규명하기 위해서는 무화과 잎의 추출방법과 세포주에 따른 증 식억제효과 및 그 기전연구는 더 추구하여야 할 과제로 생각한다.

결론적으로, 본 연구에서 무화과 잎 메탄올추출물에 의한 사람 인두 편평암세포 FaDu의 증식억제가 caspase 및 미토콘드리아-의존적 신 호전달체계를 통한 세포사멸에 매개되어 있음을 시사한다. 또, 이러한 결과는 천연 항암 후보물질로써 구강암 항암제로서 개발을 위한 하나의 방향을 제시할 수 있을 것으로 생각한다.