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ISSN : 1226-7155(Print)
ISSN : 2287-6618(Online)
International Journal of Oral Biology Vol.45 No.3 pp.115-125
DOI : https://doi.org/10.11620/IJOB.2020.45.3.115

Resveratrol inhibits cell growth via targeting the Bmi-1 pathway in YD-10B human oral squamous cell carcinoma cells

Kyoung-Eun Park1, Chang Youp Ok1,2,3, Hye-Ock Jang1, Moon-Kyoung Bae3,4, Soo-Kyung Bae1,2,3*
1Department of Dental Pharmacology, School of Dentistry, Pusan National University, Yangsan 50612, Republic of Korea
2BK21 PLUS Project, School of Dentistry, Pusan National University, Yangsan 50612, Republic of Korea
3Periodontal Disease Signaling Network Research Center, School of Dentistry, Pusan National University, Yangsan 50612, Republic of
Korea
4Department of Oral Physiology, School of Dentistry, Pusan National University, Yangsan 50612, Republic of Korea
*Correspondence to: Soo-Kyung Bae, E-mail: skbae@pusan.ac.kr
August 7, 2020 August 26, 2020 August 26, 2020

Abstract


Resveratrol has been reported to exert anticancer activity via modulation of multiple pathways and genes. In this study, we examined the effect of resveratrol on YD-10B human oral squamous cell carcinoma cells and its molecular mechanisms of action. We found that resveratrol inhibited the proliferation of YD-10B cells in a dose- and timedependent manner. The suppressive effect of resveratrol was accompanied by a reduction in Bmi-1 gene expression. We observed that silencing the Bmi-1 gene by small interfering RNA effectively downregulated the levels of GLUT1 mRNA and protein, which were also repressed by resveratrol. Bmi-1 silencing increased the number of YD-10B cells in S-phase arrest by approximately 2.3-fold compared with the control. In conclusion, the results of the present study demonstrate, for the first time, that resveratrol suppresses Bmi-1-mediated GLUT1 expression in human oral squamous cell carcinoma cells and suggest that the specific molecular targeting of Bmi-1 and/or GLUT1 expression can be combined with a chemotherapeutic strategy to improve the response of oral cancer cells to resveratrol.


Resveratrol , Bmi-1 , GLUT1 , Human oral squamous cell carcinoma

초록

    Pusan National University
    © The Korean Academy of Oral Biology. All rights reserved.

    This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/bync/4.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

    Introduction

    구강암은 구강조직에 생기는 악성종양을 일컫는다. 구강의 상피조 직에서 발생하는 편평상피 구강암(oral squamous cell carcinoma, OSCC)은 구강암의 90% 이상을 차지하며 전 세계에서 11번째로 가장 흔한 암종으로 보고되어 있다[1]. 구강암은 전체 암발생률의 약 3%를 차지하며 일반적으로 55세–64세 사이의 연령층에서 가장 빈발하고 여 성보다는 남성에서 2-3배 더 발생률이 높은 것으로 알려져 있다[2,3]. 구강암 진단에서 임상 단계는 중요한 예후 지표로 인식된다. 하지만 구 강암의 진단 시기가 대체로 늦은 편이라 치료가 어렵고 전이가 동반되 어 있을 가능성이 높아 예후가 좋지 않다[4]. 실제 OSCC의 전체 5년 생 존율은 악성 종양 중에서 가장 낮으며 실제로 지난 30년간 50% 이하인 것으로 보고되었다[5,6]. 따라서 새로운 항암물질이나 바이오마커를 지 속적으로 발굴하여 구강암의 조기 진단을 가능하게 하고 최소의 부작용 으로 최대의 항암효과를 나타내는 치료요법을 개발하고자 하는 연구는 매우 중요하다.

    레스베라트롤(3,5,4’-trihydroxystilbene; resveratrol)은 포도를 포 함한 각종 베리류 및 땅콩 등에 함유된 천연 식물항독소(phytoalexin) 이며 자외선 등의 외부 스트레스에 반응하여 식물이 합성해 내는 폴리 페놀로 식물 스스로를 보호하는 역할을 수행한다[7,8]. 레스베라트롤은 1992년부터 세계적인 주목을 받기 시작했는데 그 이유는 심장보호 효 과를 가진 적포도주의 주요 성분으로 알려졌기 때문이다. 이후 많은 연 구를 통해 항바이러스, 신경보호, 항노화, 항산화, 항염증, 면역조절, 항 암 효과 등 레스베라트롤의 다양하고 유용한 약리학적 활성이 보고되었 다[9,10]. 레스베라트롤의 항암효과는 유방암을 포함한 여러 종류의 암 세포와 동물모델 연구에서 입증되었으며[11,12] 항암효과를 설명하는 기전으로는 레스베라트롤에 의한 암세포 내 DNA 합성 저해 또는 DNA damage 유발과 같은 genotoxicity 증가 및 이에 의한 cellular apoptosis, autophagy, 그리고 senescence의 유도 등을 포함한다[13- 16]. 구강암에 대한 레스베라트롤의 효과는 구강편평세포암종 세포주 (SCC-25)를 이용한 실험에서 레스베라트롤이 암세포의 증식을 억제 하고 DNA 합성도 저해함으로써 효과적인 항암효과를 나타낸다는 연구 결과가 보고된 바 있다[17]. 또한 레스베라트롤은 포도주의 다른 폴리 페놀 성분인 quercetin과 병용으로 사용하였을 경우 quercetin의 항암 효과를 크게 증가시킴으로써 낮은 농도로도 구강암세포 성장을 억제시 킬 수 있었다[18,19]. 레스베라트롤의 항암효과는 nuclear factor-κB (NF-κB)와 STAT3로 대표되는 세포 내 주요 신호전달계의 활성 변화 를 통해 암억제유전자 p53의 증가 또는 암유전자 Myc의 감소 등 세포 증식과 관련된 일련의 표적 유전자군의 발현을 조절함으로써 유발된다 [12,20]. 따라서 구강암세포에서 레스베라트롤의 표적 유전자를 동정 하는 연구는 레스베라트롤의 항암 작용을 분자수준에서 더 정확히 규 명하여 향후 구강암의 항암 과정에 관여하는 유전자군을 이용한 유전자 치료법 개발에 기여할 것으로 기대된다.

    Bmi-1은 326개의 아미노산으로 이루어진 Polycomb 유전자이며 전사인자로 작용하여 줄기세포 자가증식, 세포의 주기, 불멸화, 노화 등 의 조절과정에 관여하고 있다[21]. 다양한 종류의 암에서 높은 발현을 보이는 Bmi-1은 임상에서 예후가 좋지 않은 양성 상관관계를 나타낸 다[22]. Bmi-1은 Cyclin D1의 발현을 증가시키고 NF-κB의 신호전 달계를 활성화시켜 암세포의 증식과 게놈 불안정성을 높인다[23,24]. 구강암의 경우, Bmi-1 발현은 정상 세포와 정상 조직에 비해 암 세포 와 암 조직에서 높은 편이며 구강암의 4-nitroquinoline 1-oxide (4- NQO) 생쥐모델을 이용한 연구에서 Bmi-1의 과발현은 4-NQO-유도 성 구강암화 과정에 대한 민감도를 증가시켰다[25,26]. 또한 머리 목 편 평 세포암에서 Bmi-1를 표적으로 한 억제(silencing) 실험을 수행한 결과, Bmi-1 발현 억제는 방사선에 대한 암세포의 저항성을 낮추었고 nude mouse를 이용한 xenograft 실험에서는 암화과정을 억제하는 효과를 나타내었다[27]. 이러한 연구 결과들을 통해 Bmi-1는 구강암의 항암 표적 유전자로 부각되기 시작했다.

    본 연구는 구강편평상피세포암종 세포주인 YD-10B에서 레스베 라트롤에 의한 Bmi-1 유전자의 발현 변화를 조사하였고 레스베라트 롤-Bmi-1 signaling 하위에 있는 표적 유전자로서 GLUT1을 최초로 동정하였다.

    Materials and Methods

    1. 실험재료

    세포배양에 사용된 RPMI1640와 penicillin/streptomycin은 Hyclone (Rockford, IL, USA) 제품이고, fetal bovine serum (FBS) 은 Gibco (Waltham, MA, USA) 제품을 사용하였다. 레스베라트롤과 3,4,5-dimethyl Nmethylthiazol-2-yl-2, 5-diphenyl tetrazolium bromid (MTT) 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 제품 을 사용하였고, polymerase chain reaction (PCR)은 HelixAmpTM Ready-2x-Go [Taq-Plus]로 NanoHelix (Daejeon, Korea) 제품 을 사용하였다. Bmi-1에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) 제품을 사용하였고, α-Tubulin 항체는 Bioworld Technology (St Louis Park, MN, USA) 제품을 사용하였다. GLUT1과 β-actin의 항체는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구매하였 고, cyclin D1 그리고 NF-κB p65의 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였다. Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG와 goat anti-mouse IgG 는 Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY, USA) 제품을 사용하였 고 Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG는 Molecular Probes (Eugene, OR, USA) 제품을 사용하였다. FxCycle PI/Rnase Staining Solution은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다.

    2. 세포배양

    Human 유래 구강편평상피세포암종 세포주인 YD-10B 세포의 성장 은 RPMI-1640 배지에 heat inactivation한 10% 우태아혈청(FBS)과 1% 항생제(penicillin/streptomycin)를 첨가한 배양액으로 유지하였 다. 세포 배양은 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 계대배 양은 세포가 충분히 배양된 것을 확인하고 일주일에 2–3회 실시하였다.

    3. 세포 생존율 측정

    레스베라트롤 처리에 대한 세포생존율을 측정하기 위해 YD-10B 세 포를 24 well plate에 각각 5 × 104 cell/well씩 분주하고 500 µL의 배양액 안에 레스베라트롤을 0–500 µM 농도로 처리하여 24시간 동 안 배양하였다. 배양액 제거 후 0.5 mg/mL 농도의 MTT 시약이 녹 아있는 배양액을 첨가하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 4시간 동 안 반응시켰다. MTT 시약이 포함된 상층액 배지를 제거하고 각 well에 dimethyl sulfoxide를 500 µL씩 넣어 세포 내 formazan을 녹인 후 ELISA reader (Sunrise; Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용 하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

    4. RNA 분리 및 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription-PCR, RT-PCR)

    YD-10B 세포에서 total RNA를 추출하기 위해 Tri-RNA reagent (FAVORGEN, Ping-Tung, Taiwan)을 사용하였고, cDNA를 합성하 기 위해 Maxime PCR PreMix Kit (iNtRON, Seongnam, Korea) 를 사용하여 2 µg의 total RNA로 역전사 반응을 시행하였다. PCR 에 사용된 oligonucleotide primer는 다음과 같다. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH): Forward 5’-ATCTTCCAGGAGCGAGATCC- 3’, GAPDH: Reverse 5’-AGGAGGCATTGCTGATGATC- 3’, Bmi-1: Forward 5’-ATCCCCACCTGATGTGTGTG- 3’, Bmi-1: Reverse 5’-GCTGCTGGGCATCGTAAGTA-3’, GLUT1: Forward 5’-CCTGCAGTTTGGCTACAACA-3’, GLUT1: Reverse 5’-GTCTGGTTGTAGAACTCCTCG-3’.

    5. Western blot analysis

    10% protease inhibitor cocktail를 함유한 RIPA Buffer (50 mM Tris hydrochloride [Tris-HCl] pH7.5, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 1% Triton X-100, 150 mM sodium chloride [NaCl], 0.5% sodium deoxycholate, 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 5 mM sodium fluoride, 1 mM Na3VO4)로 세포를 용해시켰 다. Cell lysate는 10분마다 votexing하면서 30분간 얼음에 방치 후 14,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 total cell lysate로 사용하였다. BCA Protein assay kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 사용하여 단백질을 정량한 다음 30 µg의 cell lysate를 10–12% gel로 sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 전기영동을 실 시하고, polyvinylidene difluoride membrane으로 transfer하였다. Membrane을 5% skim milk가 함유된 Tris-buffered saline and Tween-20 (TBST) buffer (20 mM Tris-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20)에 1차 항체(primary antibody)를 처리하 여 4℃에서 overnight 반응시켰다. 1차 항체 반응 후 membrane을 TBST buffer로 상온에서 10분씩 3회 세척한 다음 HRP-conjugated secondary antibody를 실온에서 1시간 반응시켰다. 이를 다시 TBST buffer로 10분씩 3회 세척한 다음 ECL detection kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)로 밴드를 확인하였다.

    6. Transient transfection of small interfering (si)RNA

    실험에 사용된 Bmi-1의 double-strand siRNA oligonucleotides 와 negative-control siRNA는 Bioneer (Daejeon, Korea)에서 구입 하였다. Lipofectamine RNAiMAX transfection reagent (Invitrogen) 을 사용하여 50 nM의 siRNA를 serum-free OPTI-MEM 배양 액에 처리한 후 YD-10B 세포에 형질주입시켰다.

    7. 유세포 분석(flow cytometry analysis)

    레스베라트롤을 처리하거나 Bmi-1 siRNA로 transient transfection을 실시한 YD-10B 세포를 차가운 phosphate buffered saline (PBS)로 두 번 세척하고 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 세포가 서로 뭉치지 않도록 주의하며, 차가운 70% 에탄올을 첨가하여 4℃에 서 overnight 고정시켰다. 고정된 세포를 원심분리하여 에탄올을 제거 하고 다시 PBS로 세척한 후, 500 µL의 FxCycle PI/Rnase Staining Solution을 넣고 차광된 상온에서 30분 동안 반응시킨 다음 유세포측 정분석기(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA)로 측정하였다.

    8. 면역세포화학 염색법(immunocytochemistry)

    YD-10B 세포를 gelatin으로 코팅한 유리 슬라이드에 부착시켜 키 운 다음 4% paraformaldehyde로 고정시켜 GLUT1에 대한 면역세포 화학 염색을 시행하였다. 1% bovine serum albumin이 포함된 PBS 용액으로 GLUT1의 1차 항체를 희석하여 4℃에서 overnight 반응 후, PBS-T (0.1% Tween-20)로 3회 세척하였다. 녹색의 형광이 붙어있 는 2차 항체를 상온에서 1시간 반응시킨 다음 다시 PBS-T로 3회 세 척하고 mounting medium으로 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) 염색시켜 confocal microscopy LSM 510 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 확인하였다.

    9. 통계처리

    본 실험의 통계처리는 3번의 실험을 통해 얻어진 평균값과 표준편차 를 Student’s t-test를 이용하여 분석하였고, 대조군과의 유의성은 p 값 0.05 이하에서 나타내었다.

    Results

    1. 레스베라트롤이 구강암세포의 증식에 미치는 영향

    레스베라트롤이 구강암세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 구강편평상피세포암종 세포주인 YD-10B 세포를 사용하여 레스베라트 롤을 0–500 µM 농도로 24시간 동안 처리한 뒤 MTT assay로 관찰하 였다. 그 결과 레스베라트롤의 농도가 증가함에 따라 YD-10B 세포는 농도-의존적인 증식 억제를 나타내었다. 또한 본 실험을 통해 세포생존 율이 50% 감소되는 농도인 IC50은 레스베라트롤 농도 400 µM임을 확인하였다(Fig. 1).

    2. 구강암세포에서 레스베라트롤에 의한 Bmi-1의 발현 변화

    YD-10B 세포에서 종양유전자로 알려진 Bmi-1의 발현이 레스베 라트롤에 의해 변화되는지를 조사하기 위해 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR)을 실시한 결과, IC50 농도인 레스베라트롤 400 µM에서 Bmi-1의 mRNA 발현량은 50% 가량 감소된 것을 확인하였다(Fig. 2A and 2B). 레스베라트롤 400 μM을 시간별로 처리한 RT-PCR 결 과에서 Bmi-1 mRNA 발현량이 4시간부터 감소되어 24시간까지 유 의성 있게 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 2C and 2D). 또한 단백질 발 현 변화를 조사하기 위하여 실시한 Western blot analysis에서도 동일 한 결과를 확인할 수 있었다. YD-10B 세포에 레스베라트롤을 농도별 로 24시간 동안 처리한 결과 Bmi-1 단백질은 레스베라트롤의 농도에 의존적으로 감소하였다(Fig. 3A and 3B). 레스베라트롤 400 μM 처리 후 시간별로 Bmi-1 단백질량을 확인한 결과 8시간부터 감소하기 시작 하여 24시간까지 지속적으로 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 3C and 3D).

    3. Bmi-1 silencing이 구강암세포의 세포주기에 미치는 영향

    레스베라트롤에 의한 Bmi-1 발현감소가 YD-10B 세포의 세포주 기(cell cycle)에 미치는 영향을 확인하기 위해 Bmi-1 siRNA를 YD- 10B 세포 내로 transient transfection한 후 Bmi-1 유전자 발현을 인 위적으로 억제시켰다. Western blot 실험을 통해 Bmi-1 발현 억제 여 부를 확인한 결과, transient transfection 24시간 이후 실험군 세포에 서 Bmi-1 단백질 발현량이 대조군 대비 현저히 감소되어 있음을 확인 하였다(Fig. 4A and 4B). 또한 Bmi-1의 타킷 유전자로 알려져 있는 Cyclin D1과 NF-κB p65 단백질의 발현량을 조사한 결과, Bmi-1 발 현이 감소된 세포에서는 Cyclin D1과 p65 단백질의 발현량도 대조군 대비 감소되어 있었다(Fig. 4A and 4C-4E). 세포 내 Bmi-1 단백질의 감소가 YD-10B 세포의 세포주기에 미치는 영향을 확인하기 위해 유세 포분석(fluorescence-activated cell sorting, FACS)을 시행하였다. Propidium iodide 염색을 통해 DNA content를 관찰한 결과, Bmi-1 발현이 억제되었을 경우 sub G1기, S기, 그리고 G2/M기 정체가 증가 되었으며 특히 S기 정체는 대조군 대비 2배 이상의 증가를 보임을 확인 하였다(Fig. 4F).

    4. 구강암세포에서 Bmi-1 silencing에 의한 GLUT1의 발현 변화

    YD-10B 세포에서 Bmi-1 발현억제가 GLUT1 유전자의 발현에 미 치는 영향을 조사하기 위해 RT-PCR을 실시한 결과, Bmi-1의 siRNA 가 형질 주입된 실험군 세포 내에서는 GLUT1 mRNA 발현이 감소하였 다(Fig. 5A-5C). Western blot 실험을 통해 GLUT1 단백질 발현 변화 를 확인한 경우, RT-PCR과 동일한 결과를 확인하였다(Fig. 5D-5F). 또한 YD-10B 세포 내에서 GLUT1 단백질의 발현 변화를 검증하기 위 하여 면역세포화학 염색(immunocytochemistry)을 시행하였다. 그 결과, GLUT1 단백질은 세포막에 분포하고 있음을 관찰하였고 Bmi-1 의 siRNA가 형질 주입된 실험군 세포에서는 GLUT1 단백질의 발현량 이 대조군에 비해 감소되어 있음을 확인하였다(Fig. 5G).

    5. 구강암세포에서 레스베라트롤에 의한 GLUT1 발현 변화

    YD-10B 세포에서 레스베라트롤이 GLUT1 유전자의 발현에 미치 는 영향을 조사하기 위해 RT-PCR을 실시하였다. 그 결과, 300 μM 레 스베라트롤 처리에 의해 GLUT1 mRNA의 발현이 대조군 대비 40% 정도 감소하였고 400 μM 이상에서는 50% 정도까지 감소되었다(Fig. 6A and 6B). 또한 레스베라트롤 400 μM을 시간별로 처리하였을 경 우, GLUT1의 mRNA 발현량은 4시간부터 감소하기 시작하여 24시 간까지 감소하는 경향을 보였다(Fig. 6C and 6D). 레스베라트롤에 의한 GLUT1의 단백질 발현의 변화를 확인하기 위해 Western blot analysis를 실시한 결과, 100 μM 레스베라트롤 처리에서부터 GLUT1 mRNA의 발현이 대조군 대비 감소하였고 다른 농도의 레스베라트롤 에서도 GLUT1 단백질 발현의 감소 정도는 유사한 것으로 확인되었다 (Fig. 6E and 6F). 레스베라트롤 400 μM을 시간별로 처리하였을 경 우, 8시간에서 GLUT1 단백질의 발현량이 대조군 대비 50% 감소하였 고 24시간에서는 대조군 대비 70% 정도 감소하는 패턴을 보였다(Fig.6G and 6H).

    Discussion

    본 연구를 통해 레스베라트롤은 구강편평상피세포암종 세포주인 YD-10B의 증식을 억제하고 Bmi-1 발현을 감소시킨다는 사실을 처음 으로 밝혔다. 그리고 siRNA를 이용한 silencing 실험에서 Bmi-1 발현 을 억제시켰을 경우, 대조군 대비 2배 이상으로 S기 정체(arrest)가 증 가하였다. 이상의 결과들을 통해 레스베라트롤에 의한 YD-10B 세포의 증식 억제는 적어도 Bmi-1 발현의 감소를 통해 이루어지며 특히 S기 정체와 상관성이 있음을 알 수 있다. 따라서 레스베라트롤 등과 같이 구 강편평상피세포암종 세포에 효과적인 항암효과를 가진 약물과 Bmi-1 발현 감소를 표적으로 한 유전자 조절의 병용요법 개발은 향후 부작용 을 줄이면서 항암효과는 향상시키는 구강암 치료제로서 활용될 가능성 이 높을 것으로 생각한다.

    일반적으로 DNA 손상이 발생하면 세포는 증식을 위한 세포주기를 진행하는 대신 G1기에 정체됨으로써 DNA 복구시스템(repair system) 이 작용할 시간을 확보하게 하고 이후 DNA 복구가 완료되면 비로 소 세포는 S기로 진입하게 된다[28]. Cyclin D1은 세포주기의 G1-S 전이에 관여하는 단백질이며 DNA 손상이 발생하면 세포 내 Cyclin D1 의 단백질 분해가 신속하게 일어남으로써 세포는 G1기에 머물게 된 다. 하지만 이러한 세포주기에 따른 Cyclin D1의 조절이 비정상적으로 될 경우 암유전자로 작용하여 암 형성을 유발하는 것으로 알려져 있다 [29]. SW480 세포를 대상으로 한 연구결과에 따르면 레스베라트롤이 처리된 세포 내에서 Cyclin D1 단백질 양은 급속히 감소하였으나 세포 는 예상과는 달리 G1보다는 S기에 정체되었다[30]. 본 연구에서 Bmi- 1 silencing에 의한 Bmi-1 단백질 발현의 감소가 YD-10B 세포의 세 포주기에 미치는 영향을 조사하였을 때 대조군 대비 2배 이상의 증가를 나타낸 것은 흥미롭게도 S기 정체였다. 이러한 연구 결과는 상기에 설 명한 바와 같이 SW480 세포에 대한 레스베라트롤의 효과와 상당히 유 사하다. 또한 Bmi-1 silencing에 의해 Bmi-1 단백질 발현이 감소된 YD-10B 세포에서 Cyclin D1 단백질의 발현량도 상당이 감소해 있음 을 확인하였다. S기에 머무는 이유에 대해서는 아직 명확히 규명되진 않았지만 제시 가능한 기전으로는 Cyclin E, Cyclin A, 그리고 Cyclin B1 단백질의 양적 변화를 들 수 있다. 이전의 연구결과에 의하면, 레스 베라트롤 처리에 의해 Cyclin D1의 감소가 일어나더라도 Cyclin E 단 백질의 지속적인 발현과 Cyclin B1 단백질 감소 등의 변화가 동반될 경 우 세포는 G1에 머물기보다는 S기로 진행한 뒤 S기에서 정체된다고 보 고된 바 있다[30]. 또한 Cyclin E와 Cyclin A의 증가가 레스베라트롤에 의한 U937의 S기 정체와 관련 있다는 연구결과도 발표되었다[31]. 이 러한 사실들로 미루어 볼 때 YD-10B 세포에서 Bmi-1 silencing에 의 한 S기 정체 증가에는 Cyclin D1뿐만 아니라 Cyclin E, Cyclin A, 그리 고 Cyclin B1 단백질을 포함한 다양한 Cyclin family 단백질들의 발현 변화와 상당한 관련성이 있을 것으로 여겨지며 향후 후속 연구를 통해 이에 관한 규명이 필요할 것으로 생각한다.

    암세포에서 중요한 특징 중 하나는 포도당 흡수의 증가다[32]. 포도 당 흡수(glucose uptake)는 glucose transporter로 작용하고 있는 GLUT family의 주요 기능이다[32]. 특히 거의 대부분의 세포에 존재하 고 있는 GLUT1의 비정상적 조절은 대사질환 그리고 암과 같은 다양한 질병과 관련이 있다. 따라서 GLUT1은 암 치료에서 중요한 표적이 되 며 GLUT1의 활성이나 발현을 억제하기 위한 조절자를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다[33]. Genistein, quercetin과 같은 flavone계 저해제들이나 caffeine, theophylline 등의 tyrosine kinase 저해제, 그리고 curcumin, 레스베라트롤로 대표되는 polyphenol계 물 질 등은 대표적인 GLUT1 억제제이며[33] NF-κB는 GLUT1 발현을 조절할 수 있는 상위 신호전달경로이다[34]. 레스베라트롤과 포도당 흡 수의 상호 관련성은 인간 백혈구 세포주 U-937 및 HL-60의 연구를 통해 최초로 밝혀졌으며 이 후 다양한 암세포에서 레스베라트롤에 의한 포도당 흡수 억제 결과들이 보고되었다[33,35]. 레스베라트롤에 의한 포도당의 흡수 억제는 GLUT1의 발현 억제와 관련이 있다[33,35]. 이 러한 결과를 바탕으로 GLUT1이 과발현되고 있는 암세포의 치료에 항 암제로서 레스베라트롤의 유효성이 지지를 받고 있다. 본 연구에서 사 용한 구강편평상피세포암종 세포주인 YD-10B의 경우, 대조군에서 높 은 발현을 보이던 GLUT1의 mRNA와 단백질 양이 레스베라트롤 처 리뿐만 아니라 Bmi-1 silencing에 의해서도 감소하는 결과를 나타내 었다. 따라서 본 연구결과는 구강암 세포 내 레스베라트롤-Bmi-1- GLUT1 axis를 제시해 준다. 하지만 레스베라트롤-GLUT1-Bmi-1 axis의 경우도 그 가능성을 배제할 수 없다. 그 이유는 다양한 종류의 암 줄기세포에서 GLUT1의 발현을 인위적으로 억제시켰을 때 Bmi-1의 발현이 감소되어 줄기세포능이 약화되었다는 연구결과가 보고된 바 있 기 때문이다[36]. GLUT1은 구강편평상피세포암종의 유용한 진단 바이 오마커로서의 가능성이 제시된 바 있으나[37], GLUT1의 비정상적인 발현이 구강암세포에 어떠한 영향을 미치는지에 대해서는 구체적으로 알려진 바 없다. 향후 추가적인 연구를 통해 GLUT1과 Bmi-1 유전자 상호 간의 관련성 및 인위적인 GLUT1 발현 조절에 의한 구강암세포의 증식/이동/침윤 등의 변화 양상에 대한 구체적인 규명이 가능할 것으로 생각한다. 본 연구결과를 기반으로 하여 레스베라트롤과 같은 항암효과 를 가진 물질을 이용한 항암화학요법과 Bmi-1과 GLUT1의 감소를 표 적으로 한 유전자 치료의 병용요법에 관한 구강암 치료 연구가 in vitro 뿐만 아니라 in vivo 동물실험을 통해 추가적으로 이루어지기를 기대하 는 바이다.

    Acknowledgements

    이 논문은 부산대학교 기본연구지원사업(2년)에 의하여 연구되었음 (to Bae S-K).

    Figure

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    Effect of resveratrol on the proliferation of human oral squamous cell carcinoma cells. YD-10B cells were treated with various concentration of resveratrol (0–500 μM) for 24 hours. Cell viability was measured by 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Data was expressed as means ± standard deviation from triplicates of at least three independent experiments.

    *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 versus untreated YD-10B cells.

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    Effect of resveratrol on Bmi-1 mRNA levels. (A, B) YD-10B cells were treated with different concentration of resveratrol (0–500 μM) for 24 hours. (A) Total RNA was prepared for reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) of Bmi-1 gene expression. PCR using housekeeping gene glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA was carried out in parallel to confirm equivalency of cDNA preparation. (B) Relative Bmi-1 mRNA levels normalized with GAPDH mRNA. (C, D) YD-10B cells were treated with 400 μM of resveratrol for the indicated times. (C) Total RNA was prepared for RT-PCR of Bmi-1 gene expression. (D) Relative Bmi-1 mRNA levels normalized with GAPDH mRNA. The density of each band in each lane from three independent experiments was quantified by ImageJ program (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

    *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 versus untreated YD-10B cells.

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    Effect of resveratrol on Bmi-1 protein levels. (A, B) YD-10B cells were exposed to different concentration of resveratrol (0–500 μM) for 24 hours. (A) Equal amounts of total proteins were subjected to 10% sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Whole cell lysate was prepared and analyzed by Western blotting for measuring the expression of Bmi-1 protein using specific antibody. α-Tubulin was used to control for loading differences. (B) Relative Bmi-1 protein levels normalized with α-Tubulin. (C, D) YD-10B cells were treated with 400 μM of resveratrol for the indicated times. (C) Whole cell lysate was prepared and analyzed by Western blotting for measuring the expression of Bmi-1 protein using specific antibody. α-Tubulin was used to control for loading differences. (D) Relative Bmi-1 protein levels normalized with α-Tubulin. The density of each band in each lane from three independent experiments was quantified by ImageJ program (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

    *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 versus untreated YD-10B cells.

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    Effect of Bmi-1 silencing on cell cycle phase distribution. YD-10B cells were transiently transfected with control siRNA or Bmi-1 siRNA for 48 hours. (A) The expression of Bmi-1, Cyclin D1 and β-Actin protein was detected by Western blot using specific antibodies. Relative (B) Bmi-1 and (C) Cyclin D1 protein levels normalized with β-Actin. (D) The expression of nuclear factor-κB (NF-κB) p65 and β-Actin protein was detected by Western blot using specific antibodies. (E) Relative NF-κB p65 protein levels normalized with β-Actin. The density of each band in each lane from three independent experiments was quantified by ImageJ program (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). (F) For flow cytometry analysis, nuclei were stained with propidium iodide and the DNA content of the cell nuclei was measured. The proportion of DNA in the different phase was quantified.

    **p < 0.01, ***p < 0.001 compared to control.

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    Effect of Bmi-1 silencing on GLUT1 expression. YD-10B cells were transiently transfected with control siRNA or Bmi-1 siRNA for 48 hours. (A) Total RNA was prepared for reverse transcription polymerase chain reaction of Bmi-1 and GLUT1 expression. Quantitative mRNA levels of (B) Bmi-1 and (C) GLUT1. (D) Protein expression level of GLUT1 was confirmed by Western blot using GLUT1 antibody. β-Actin served as the loading control. Quantitative protein levels of (E) Bmi-1 and (F) GLUT1. The density of each band in each lane from three independent experiments was quantified by ImageJ program (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). (G) Immunocytochemical analysis of nuclear translocation of p65 subunit of nuclear factor-κB of YD-10B cells were transfected with Bmi-1 siRNA. Cells were fixed after 48 hours of Bmi-1 siRNA transfection, permeabilized and stained with primary anti-p65 antibody followed by 488-Alexa conjugated secondary antibody (green). Nuclei were counterstaind with 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) (blue). The cells were analyzed using a confocal microscope LSM 510 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany). Magnification × 400.

    GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.

    **p < 0.01, ***p < 0.001 compared to control.

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    Effect of resveratrol on GLUT1 expression. (A, B) YD-10B cells were treated with different concentration of resveratrol (0–500 μM) for 24 hours. (A) Total RNA was prepared for reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) of GLUT1 gene expression. PCR using housekeeping gene glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA wad carried out in parallel to confirm equivalency of cDNA preparation. (B) Relative GLUT1 mRNA levels normalized with GAPDH mRNA. (C, D) YD-10B cells were treated with 400 μM of resveratrol for the indicated times. (C) Total RNA was prepared for RT-PCR of GLUT1 gene expression. (D) Relative GLUT1 mRNA levels normalized with GAPDH mRNA. (E, F) YD-10B cells were treated with different concentration of resveratrol (0–500 μM) for 24 hours at 37℃. (E) The expression of GLUT1 and β-Actin protein was detected by Western blot using specific antibodies. (F) Quantitative protein levels of GLUT1. (G, H) YD-10B cells were treated with 400 μM of resveratrol for the indicated times. (G) The expression of GLUT1 and β-Actin protein was detected by Western blot using specific antibodies. (H) Quantitative protein levels of GLUT1. The density of each band in each lane from three independent experiments was quantified by ImageJ program (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

    *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 versus untreated YD-10B cells.

    Table

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