Introduction

국내에서 발생 빈도가 점점 높아지고 있는 대장암은 Adenomastous polyposis coli를 포함한 다양한 유전적 요인에 의해 발생하는 것이 잘 알려져 있으나 이 외에도 궤양성 대장염이나 크론병과 같은 만성 염증, 세균 감염, 식생활과 같은 다양한 요소들이 발생 및 진행에 기여하는 것 으로 보고되고 있다[1,2]. 최근 Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum) 이 대장암 환자의 조직 표본에서 높은 수준으로 검출된 연구 결과를 바탕으로 F. nucleatum과 대장암 발생과의 관련성에 대한 관심 이 높아지고 있다. F. nucleatum은 혐기성 그람 음성균 중의 하나로 대 표적인 치주염 관련 병원균이나 대장암을 포함한 다양한 질환과의 상관 관계에 대한 실험 연구가 최근 활발해지고 있다[3-5].

엑소좀(exosome)은 세포에서 분비되는 막 소포(30–200 nm)로, mRNA와 microRNAs (miRNAs)와 같은 다양한 핵산을 패키징하여 체내순환에서 내용물의 손상 없이 다른 세포로의 침습적 접근이 가능한 운반체이다[6-8]. 주변 세포로 이동 가능한 형태라는 점에서 종양세포 와 주위 종양미세환경과의 상호작용을 매개하는 중요한 전달자로서의 역할을 하는 것으로 추정되면서 최근 엑소좀 내에 존재하는 다양한 유 전체에 대한 관심이 높아지고 있다. 이러한 엑소좀의 기능과 대장암 위 험인자로서의 F. nucleatum 역할에 대한 여러 연구들을 고려 시 대장 암 발생 및 진행에 미치는 과정 중에 F. nucleatum에 감염된 대장암세 포가 다양한 miRNA를 함유한 엑소좀을 유리하여 종양미세환경에 영 향을 미침으로써 병소 진행에 기여할 수 있을 것으로 추정된다[9,10].

엑소좀 내에 분포하고 있어 주위 종양미세환경 변화 및 암 진행에 영 향을 미치는 주요 유전체로 생각되고 miRNAs는 길이가 약 18–25 뉴 클레오타이드인 small non coding RNA이다[11,12]. miRNA는 다 양한 유전자들과 결합하여 유전자 기능을 조절하는 것으로 알려져 있 으며 암 진단 및 악성도 표지자로서의 활용 가능성도 탐색되고 있다 [13,14]. 각종 암에서 특정 miRNA 발현을 개별적으로 평가하고 이를 기반으로 암세포 발생 및 진행에 미치는 영향 및 기능에 대한 연구가 주 로 이루어지고 있으나 최근 차세대 염기서열 분석법(next-generation sequencing, NGS)을 이용하여 전반적인 miRNA 발현 변화를 관찰하 는 연구 또한 늘어나고 있다[12,15]. 본 연구에서도 NGS 기반 게놈 전 체 조사를 활용하여 F. nucleatum에 감염된 대장암세포에서 유리되 는 엑소좀 내에 존재하는 miRNAs를 면밀히 조사하였다. 본 연구는 F. nucleatum에 감염된 대장암 세포는 엑소좀을 유리하여 주변 종양환경 과의 상호작용을 보다 활발하게 한다는 가정에 기반하여 F. nucleatum 에 감염된 대장암 세포에서 유리되는 엑소좀 내 miRNAs의 발현 정도 와 특성을 파악하여 추후 기능 연구의 기반을 마련하고자 한다. 연구 결 과는 향후 대장암 진단에 대한 유용한 바이오마커 개발의 자료로도 활 용될 수 있을 것이다.

Materials and Methods

1. 세포 배양과 세균 감염

본 연구에서는 대표적인 대장암 세포주 SW480을 사용하였다. SW480 세포는 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 10% 소태아혈청 (fetal bovin serum, HyClone Laboratories Inc., South Logan, UT, USA)을 함유한 RPMI1640 배지(Welgene, Gyeongsan, Korea) 로 배양하였다. 대장암 세포에 치주 세균을 감염시키기 위해 4시 간 동안 F. nucleatum 과 Porphomonas gingivalis strain33277 를 감염 다중도(multiplicity of infection) 500으로 대장암 세포와 함 께 배양하여 세균이 대장암 세포 내부로 침투될 수 있도록 하였다. 그 후 배지에 남아있는 치주세균을 제거하기 위하여 인산완충식염수 용액 (phosphate-buffered saline, PBS)으로 두 번 세척하고 엑소좀이 제 거된 2% 소태아혈청을 포함하는 새로운 배지로 교체하여 20시간 동안 배양하였다.

2. 세균 배양

F. nucleatum과 P. gingivalis는 hemin (5 µg/mL)과 비타민 K (2 mg/mL)가 첨가된 Gifu Anaerobic Medium를 이용하여 37℃ 혐기 성 배양기에서 배양하였다.

3. 엑소좀 분리와 miRNA 추출

원심분리 프로토콜을 사용하여, 세포 배양 배지에서 엑소좀을 분리 및 정제하였다. 먼저 세포 배양 배지를 모으고 3,000 g의 속도로 15 분 동안 원심분리하여 세포를 제거하였다. 상등액 중 엑소좀 외의 소 포체를 제거하기 위하여 원심분리 필터 농축 컬럼(PALL)으로 옮긴 후 3,000 g의 속도로 40분간 원심분리하였다. 농축된 상등액을 10,000 g 의 속도로 초고속 원심분리를 실시하였고 다시 상등액을 취하여 100,000 g의 속도로 재원심분리하였다. 상등액을 제거하고 남은 최종 엑소좀을 100 µL의 PBS에 재현탁시켜 –80℃에 냉동 보관하였다. 그 후 miRCURYexosome Isolation Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) 를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA를 추출하였다.

4. miRNAs 라이브러리 구축 및 NGS 분석

F. nucleatum와 P. gingivalis 관련 miRNAs를 스크리닝하기 위 해 NGS 기법을 각 샘플에 적용하였다. Data 분석을 위해 miRBase v22.1 (http://www.mirbase.org/)과 RNAcentral version 14.0 (https://rnacentral.org/)을 사용하였고, Library는 Illumina User Manual을 위한 SMARTer smRNA-Seq kit (Clontech Laboratories Inc., San Diego, CA, USA)가 사용되었다. HCS2.2.70 sequencing control software (https://support.illumina.com/ downloads/hcs-2-2-68.html)를 사용하여 NGS 분석을 수행하였으 며, 데이터 세트에서 miRNAs 수준을 비교하기 위해 각 miRNAs의 염 기서열 읽기 수를 각 샘플에서 총 읽기 수 1,000,000으로 정규화하고 백만 당 읽기(read per million of each sample)로 표현하였다.

5. Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes (KEGG) 경로 분석

엑소좀 유래 miRNAs 표적 예측 및 경로 분석을 하기 위해 TargetScan 7.1 RNA22v2.0 (http://www.targetscan.org/vert_71/) 을 사용하였다. 예측된 miRNAs 표적 유전자는 KEGG 경로로 분석하 였고 중요한 신호전달 경로는 시각화하였다. KEGG 분석을 위해 ConsensusPathDB (http://cpdb.molgen.mpg.de/)를 사용하였다.

6. 통계 분석

결과는 NetworkAnalyst 소프트웨어(https://www.networkanalyst. ca/)를 사용하여 분석되었고, 통계 처리는 limma를 이용한 DEG analysis를 이용하였으며, 유의성 검정은 fold change ＞ 1.2 또는 fold change ＜ 1/1.2를 만족하고, p ＜ 0.05의 경우에서 유의한 것으 로 간주하였다. 예외적으로, Heatmap은 시각적인 효과를 고려하여 통 계 유의성을 p ＜ 0.1로 설정하여 표시하였다.

Results

1. 대장암 세포 배양 상층액에 포함된 엑소좀 유래 miRNAs 발현의 NGS 기반 분석

대표적인 대장암 세포주인 SW480 세포에 대장암을 촉진시키는 것 으로 알려진 대표적인 치주 세균 F. nucleatum을 감염시킨 후 배양하 여 얻은 상층액으로부터 엑소좀을 분리한 후 RNA를 추출하였다. NGS 분석 기법을 이용하여 miRNAs 발현 패턴을 비교 분석하였다. 세균으 로 감염시키지 않은 대장암 세포 배양액과 또 다른 치주병원균이지만 대장암 환자에게 특이적으로 발현되지 않는 치주세균인 P. gingivalis 에 감염된 대장암 세포 배양액을 각각 대조군으로 이용하였다.

NGS 분석에서 total reads (total number of reads)값은 대조군 에서 49,021,038, F. nucleatum 감염군에서 47,050,935, P. gingivalis 감염군에서 45,235,729였다. 분석된 species에서 알려진 miRNA (miRBase v22.1)는 2,656개인데, 이들 miRNA 중 많은 수 의 miRNAs가 엑소좀 내에 존재함을 확인할 수 있었다. 또한 대조군과 F. nucleatum 감염군 사이에 엑소좀 miRNAs 프로파일에서 상당한 차이가 있는 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 miRNAs를 엑소좀 내로 패키징하는 과정이 F. nucleatum에 의해 선택적으로 이루어질 수 있다 는 것을 말해준다. 그 중에서 유의성(p ＜ 0.05) 있게 변화된 대표적인 miRNAs와 logFC값은 Table 1[16-21]에 열거하였다 .

2. Heatmap 분석을 통한 엑소좀 miRNAs의 발현 패턴 프로 파일링

F. nucleatum에 의해서 증가되거나 감소한 엑소좀 miRNAs 중에서 p ＜ 0.1 이하인 miRNAs를 Fig. 1과 같이 heatmap으로 표시하였다. F. nucleatum 그룹은 대조군에 비해서 감소된 98개의 miRNAs (Fig. 1A)와 증가된 20개의 miRNAs (Fig. 1B)가 검출되었는데, 이 중에서 F. nucleatum 에 의해 증가된 hsa-miR-149-5p, hsa-miR-10b, hsa-miR-335, hsa-miR-26-5p, hsa-miR-324-3p, hsa-miR- 339-3p와 감소된 miR-518a-5p, miR-519, miR-1273h-3p와 같 은 miRNAs는 다양한 종류의 암과 관련된 마커로 이미 알려진 바 있다 [17,19,22-24].

3. KEGG 경로와 target 유전자 분석

도출된 엑소좀 miRNAs의 암발생 과정 관련 기전을 파악하기 위해 TargetScan 프로그램을 활용하여 miRNAs의 표적을 예측하고 관련 경로를 분석하였다(Table 2).

F. nucleatum 감염 시 감소된 경로는 60개이고, 증가된 경로는 29 개로 확인되었다. 대표적인 KEGG 신호 전달 경로는 Fig. 2에 나타내었 고, false discover rate 보정 p-value는 Table 2에 표시하였다. 이 경 로 중 많은 부분이 다양한 종류의 암과 관련되어 있었는데, 그 중에서도 대장암과 직접적으로 관련되어 감소된 miRNAs는 32개로, 44개의 유 전자와 관련되어 있었다. 또한, Table 1에서 알 수 있듯 하나의 miRNA 는 여러 가지 표적 유전자를 가지고 있었는데 이들 miRNAs의 대부분 은 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition, EMT) 관련 유 전자와 염증 유전자를 표적화하는 것으로 확인되었다.

Discussion

암은 다양한 위험요소에 의해 발병되고, 조기 발견과 개선된 치료법 이 필요한 치명적인 질병이다[25,26]. 그 중에서도 대장암은 세계적으 로 발병률과 치사율이 높은 악성 종양으로, 유전적인 요인이 대장암 발 병에 중요한 역할을 한다고 알려져 있으나 환경적인 요소 또한 대장암 의 발달에 영향을 줄 수 있다[26]. 최근 치주 질환의 병인에 중요한 역 할을 하는 것으로 알려진 치주 세균 F. nucleatum이 대장암 환자에게 서 높은 수준으로 발견되었고, 이것이 대장암의 악성도를 증가시킨다고 보고되고 있다. 이러한 보고는 치주 병원균인 F. nucleatum이 구강 외 의 다양한 유형의 숙주 세포에 부착하여 침입하고 상호작용을 하여 세 포 반응을 일으킬 수 있다는 것을 의미한다. 기전 연구와 관련해서는, F. nucleatum이 자가포식(autophagy) 또는 염증반응의 조절을 통해서 대장암의 진행을 촉진시킬 수 있다는 몇 가지 보고가 있지만 그 외의 다 양한 기전 연구에 대한 범위가 제한적이고 잘 알려져 있지 않은 실정이 다[27].

최근 miRNAs가 세포에서 다양한 유전자를 조절하여 암세포의 병인 기전 과정에 영향을 미치는 주요한 유전자로 보고되고 있으며, miRNAs 자체가 암 억제유전자(tumor suppressor gene), 암 발생 유전 자(oncogene)로 작용하고 있음이 밝혀지고 있다. 대장암처럼 바이오 마커가 부족한 암을 위해 miRNAs 발현 프로파일링을 진단 표지자로 사용하기 위한 연구가 진행되고 있다[28,29]. miRNAs는 진핵세포에 서 전사 후 유전자 발현을 규제하는 작은 non coding RNA로, 세포 외 환경으로 방출되는 엑소좀과 같은 유전자 전달 시스템에 의해 인접한 다른 세포와 상호작용을 하여 그 기능을 하는 것으로 여겨진다. 엑소좀 은 세포에서 분비되는 30–100 mm의 작은 소포체로, 증식, 분화와 같 은 생물학적 과정을 조절하는 것 이외에도 다양한 암에서 잠재적인 종 양 표지자로 작용하는 것으로 알려져 있으며, 대장암 진단에 사용할 수 있는 새로운 표지자 즉, 바이오마커로 엑소좀을 이용하기 위한 연구가 늘고 있다[30]. 하지만 그 중요성에 비해 엑소좀 miRNAs에 대한 연구 가 많지 않아 암 발생 기전 관련 miRNAs의 역할에 대한 이해는 부족한 상태로 miRNA의 기능과 암과의 상관관계에 대한 보다 활발한 연구가 필요하다. 엑소좀 자체는 그 크기가 매우 작아 RNA를 패키징하는 데 한 계가 있을 것이라 예상되지만, 엑소좀 내의 miRNAs는 이중 막 구조에 의해 보호되어 손상 없이 안정적으로 그 기능을 유지해 표적 세포에 전 달되어 표적 세포를 재프로그래밍할 수 있을 것이라 생각된다.

따라서, 본 연구에서는 엑소좀 내에 존재하는 miRNAs의 변화를 중 심으로 관찰하고자 하였다. NGS 접근법을 통해서 F. nucleatum이 감 염된 샘플과 대조군 사이의 엑소좀 유래 miRNAs 발현 수준을 비교했 을 때, 두 그룹 사이에서 뚜렷하게 증가하거나 감소한 수많은 엑소좀 유 래 miRNAs를 확인할 수 있었다. 여기에 P. gingivalis는 F. nucleatum과 함께 대표적인 치주세균이지만 대장암 환자에서 특이적으로 발 현이 높지 않는 세균으로 알려져 있어 음성 대조군으로 활용하였고 본 연구에서는 F. nucleatum에 의한 발현 변화에 초점을 맞추어 연구를 진행하였다.

이들 miRNAs의 기능적인 측면을 알아 보기 위해서 관련 생물학적 경로 예측 분석을 수행했고, 다양한 관련 경로가 밝혀졌다. 많은 신호전 달 경로 중 몇 가지가 암과 관련되어 있었고 그 중에서도 우리가 궁극적 으로 알고자 하는 대장암과 관련된 경로에도 32개 miRNAs가 관여한 다는 증거를 제공했다.

F. nucleatum에 의해 유의성 있게 변화한 엑소좀 miRNAs의 확인 후, 변화된 특정 miRNA에 의해 조절되는 잠재적인 표적 유전자를 분석 한 결과, 이들 miRNAs는 EMT, 세포 간의 연접 또는 염증반응과 관련 된 것들이 많았다. 또한 F. nucleatum 처리에 의해서 증가된 miRNAs 에는 기존에 알려진 다양한 암 발생 유전자들이 포함되어 있었다. 특히, miR-518 family 중 miR-518a-5p는 대장암 세포에서 케모카인 수 용체(chemokine receptor)인 CCR6의 발현을 조절하여 대장암세포 의 증식과 침입을 촉진한다고 보고된 유전자이다[31]. 그 외에도 miR- 519와 miR-1273h-3p는 유방암 세포의 증식을 조절하고, 유방암 진 단에 사용되는 것으로 알려져 있다[32,33]. 한편, miR-302d-5p는 암 증식에 중요한 역할을 하는 혈관재생(angiogenesis)에 관여하는 유전 자로 F. nucleatum은 엑소좀 miRNA를 이용하여 다양한 경로를 통해 대장암 세포 진행에 기여함을 추정할 수 있다[34].

본 연구에 이용한 세포주 종류가 제한적이고, 하위 기전에 대한 심화 연구가 필요하나 엑소좀 miRNA의 대장암 진단 바이오마커로서의 활 용가능성을 관찰할 수 있었다.