Introduction

척수후각의 아교질(substantia gelatinosa) 신경세포는 말초조직으 로부터 감각신경섬유를 통해 정보를 전달받고 이를 통합한다. 조직손상 과 관련된 통각정보는 Aδ 섬유와 C 섬유와 같은 일차 감각신경섬유를 통해 척수의 아교질로 전달되며 이곳을 경유하여 시상으로 통각정보를 전달한다[1].

Superoxide 음이온(O₂^∙-), 과산화수소(H₂O₂) 등으로 대표되는 활성 산소(reactive oxygen species, ROS)는 조직손상이나 유해반응과 관련된다. ROS가 통증발생과 유지에 관여한다는 연구를 보면, H₂O₂ 의 피하투여로 통증이 유발되고 항산화제 투여에 의해서는 통증이 감소 하였으며[2], 피부 내 capsaicin 투여로 통증이 유발된 생쥐의 척수후 각 뉴론에서 O₂^∙-가 증가되었음을 관찰하였다[3]. 또한 본 실험실에서 는 hydroxyl radical을 발생시키는 tert-buthylhydroperoxide를 척 수에 주입하여 행동학적으로 통각과민을 관찰하고, 아교질 세포의 흥 분성의 증가를 확인하였으며[4], 최근의 연구에서는 O₂^∙-를 발생시키는 xanthine/xanthine oxidase (X/XO)의 투여에 의해 아교질세포의 시 냅스 전에 작용하여 신경전달물질의 양을 증가시키거나 시냅스 후 뉴론 의 이온통로에 직접 작용하여 탈분극시킬 수 있음을 확인하였다[5]. 그 러나 Park과 Chun [5]의 연구에서 효소처리에 의해 단일세포로 분리된 아교질세포에서는 X/XO가 전혀 효과를 나타내지 않아, X/XO의 효과 는 먼저 아교질세포 주위의 세포에 먼저 영향을 주고 이차적으로 아교 질세포에 영향을 미쳤으리라 추측할 수 있다.

중추신경계의 신경교세포는 성상세포(astrocyte), 미세아교세포(mi-croglia), 희돌기교세포(olygodendrocyte) 등으로 구성된다. 성상세포 는 중추신경계에서 가장 많은 수를 차지하는데, 설치류에서 보고된 바 에 의하면 하나의 성상세포는 4–6개의 신경세포체와 300–600개의 수 상돌기와 14만여 개의 시냅스를 하고 있다[6]. 이러한 밀접한 접촉이 신 경세포를 지지하는 역할을 함과 동시에 시냅스 신호전달 동안 신경세포 외부의 화학적 조성을 조절하는 역할을 한다[7]. 미세아교세포는 중추 신경계에서 면역에 관계하는 세포로[8], 세포 주위 환경의 변화에 빠르 고 역동적으로 반응한다[9].

성상세포와 미세아교세포는 신경병증성 통증이나 염증성 통증의 발 생과 유지에 중요한 역할을 하고 있다[10-12]. 피하염증, 말초신경손 상, 척수손상 등 통각과민을 일으킬 수 있는 여러 상황에서 성상세포 표 지자인 glial acidic fibrillary protein의 발현이 척수에서 증가하였으며 [13], 또한 여러 자극에 의해 활성화된 미세아교세포는 신경세포 기능 을 조절할 수 있는 다양한 신경전달물질과 사이토카인 같은 작은 분자 들을 분비하는 것으로 보고되었다[14,15]. 그러나 중추신경계에서 통 증의 발생과 전달에 신경교세포가 중요하게 관여함이 보고되어 있음에 도 불구하고, 신경교세포가 직접적으로 척수후각 뉴론의 흥분성에 미치 는 효과를 확인한 연구는 많지 않은 상황이다.

이 연구에서는 X/XO 투여에 의해 발생한 ROS가 통증전달에 일차적 중계역할을 하는 척수 아교질세포의 흥분성을 조절하는 과정에서 미세 아교세포의 관련성을 확인하고자 toll-like 4 수용체(TLR4)의 활성이 아교질세포의 신경활동성에 어떠한 영향을 미치는지 patch clamp 방 법으로 조사하였다.

Materials and Methods

1. 척수절편 제작

Patch clamp 실험은 생후 12–18일 된 Sprague-Dawley 흰쥐를 사용하였으며, 동물실험에 관한 사항은 원광대학교 동물실험 윤리위원 회의 규정을 준수하였다. 흰쥐에 25% urethane (4 mL/kg)을 복강 내 투여하여 마취하였다. 요추 부위를 척추제거술(laminectomy)로 척수 를 노출하고 요천수 팽대부(L1-S3)에서 1 cm 정도 길이로 척수를 절 단하였다. 미리 95% O₂-5% CO₂를 공급한 차가운 용액(1–2℃)에서 조직절편기(752M; Campden Instruments, Loughborough, UK)를 이용하여 두께 300 μm의 척수절편을 절단하였다. 척수절편은 32℃의 인공 뇌척수액에 1시간 정도 보관하여 정상상태로 회복시켰고, 이후에 실험을 진행하였다. 척수절편을 현미경(BX50WI; Olympus, Tokyo, Japan) 위의 기록용기에 위치시킨 후 지속적으로 95% O₂-5% CO₂를 공급한 용액을 관류펌프(Minipuls 3; Gilson, Villiers le Bel, France) 를 이용하여 순환시키면서 막전압과 전류의 기록을 시행하였다.

2. 실험용액

기록을 위한 세포외 용액의 조성은 117 NaCl, 3.6 KCl, 2.5 CaCl₂, 1.2 MgCl₂, 1.2 NaH₂PO₄, 25 NaHCO₃, 11 glucose였고 95% O₂- 5% CO₂를 공급하여 pH를 7.4로 유지하였다. 기록전극 내 용액은 150 K-Glu, 10 HEPES, 5 KCl, 0.1 EGTA, 5 MgATP, 0.3 Na GTP를 사 용하였고, pH는 KOH를 추가하여 7.3으로 만들었다.

실험에 사용된 X, XO, DL-fluorocitric acid barium salt (fluorocitrate), phenyl N-t-butylnitrone (PBN), minocycline은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, pyridoxalphosphate- 6-azophenyl-2＇,4＇-disulfonic acid (PPADS), lipopolysaccharide (LPS), Ethyl-(6R)-6-(N-(2-chloro-4-fluorophenyl) sulfamoyl)cyclohex–1-ene-1-carboxylate (Tak-242) 는 Calbiochem (La Jolla, CA, USA)에서 구입하였다. Tak-242는 DMSO (dimethyl sulfoxide; Sigma-Aldrich)에 일차적으로 녹인 후 최종농도로 세포외 용액에 희석하여 사용하였고, 그 밖의 다른 약 물은 실험 전에 세포외 용액에 녹여 사용하였다. 실험용액의 공급은 중력을 이용한 관류장치(BPS-4SG; ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY, USA)를 이용하였다.

3. 전기생리학적 기록방법

막전압과 전류의 기록을 위하여 whole cell patch clamp의 전류고 정법과 전압고정법을 각각 사용하였다. 미세유리전극 제조기(PP-830; Narishige, Tokyo, Japan)를 이용하여 외경 1.5 mm의 가는 유리피펫 (TW150-3; WPI, Sarasota, FL, USA)을 5–7 MΩ 정도의 저항을 갖 도록 미세전극을 제작하였다. 기록용기에 척수절편을 위치시키고 밝은 띠를 나타내는 척수 아교질 부위를 확인한 후 양압을 가하면서 미세 전 극조절기(ROE-200; Sutter, Novato, CA, USA)를 이용하여 세포에 접근하였다. 세포에 접근하여 기록전극의 저항이 순간적으로 올라가는 것으로 세포에 근접하였음을 확인하였으며, 이후 천천히 음압을 가하 여 세포와의 gigaohm seal을 이루었다. 다시 빠르고 짧은 음압을 가하 여 whole cell을 만들었으며 막전압이 –45 mV 이하로 안정된 상태의 세포에서만 기록을 시작하였다. 전압과 전류측정은 Axopatch 200B 증폭기(Axon instruments, Union City, CA, USA)를 사용하였으며, 이 증폭기는 AD변환기(Digidata 1200B; Axon instruments)를 통 해 컴퓨터와 연결하였다. pCLAMP software (version 10.0; Axon instruments)를 사용하여 데이터의 기록 및 분석을 시행하였으며 발생 된 전류는 low pass 8-pole Bessel filter로 2 kHz로 여과하였다. 모 든 실험은 실온(23 ± 1℃)에서 시행하였다.

4. 실험자료의 분석

막전압과 전류의 분석은 Clampfit (version 10.0; Axon instruments) 를 사용하였다. 약물처리군 사이에 통계적으로 유의한 차이가 있는지의 여부는 independent t-test를 이용하였고 약물처리 전후 비 교는 paired t-test를 이용하였다. 결과 값은 평균 ± 표준오차(mean ± standard error of the mean)로 표시하였으며, p ＜ 0.05에서 통계적 으로 유의하다고 판정하였다(SPSS ver. 12, SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Results

1. 척수아교질 뉴론의 흥분성에 대한 X/XO의 효과

Superoxide 음이온(O₂^∙-)을 발생시키는 것으로 알려진 X/XO의 병용 투여가 척수후각의 아교질 신경세포의 흥분성에 어떠한 효과를 나타내 는지 확인하였다. X/XO가 막전압에 미치는 효과를 확인하기 위하여 안 정막전압 상태에서 X/XO (300 μM/30 mU)를 투여하였는데, 세포는 약물투여 후 30초 이후부터 서서히 탈분극(9.5 ± 1.0 mV, n = 9)이 발생되었으며, 정상용액으로 관류 시 막전압은 서서히 원래 값으로 회 복되었다(Fig. 1A). X/XO가 전류에 미치는 효과를 알아보기 위하여 유 지전압을 –70 mV로 고정하고 지속적으로 전류를 기록하였다. X/XO 투여에 의해 발생된 전류는 하향성의 시냅스 전류를 포함하고 있었으 며, 막전압에서의 변화와 유사한 양상으로 서서히 발생하는 내향성 전 류(–9.3 ± 0.7 pA, n = 29)를 관찰하였다(Fig. 1B).

2. 척수아교질 세포에서 X/XO의 효과에 대한 신경교세포의 역할

이 연구에서는 먼저 X/XO 투여에 의한 내향성 전류의 발생에 신경 교세포의 활성이 관여하는지를 알아보고자 미세아교세포의 억제제인 minocycline과 성상세포의 억제제인 fluorocitrate의 효과를 확인하 였다. X/XO 투여에 의한 내향성 전류는 minocycline (100 μM) 전처 리에 의해 유의하게 감소하였으며(–1.2 ± 2.4 pA, n = 4, p ＜ 0.05) (Fig. 2A and 2C), fluorocitrate (100 μM)에 의해서도 유의하게 억제 되었다(–2.6 ± 1.2 pA, n = 5, p ＜ 0.05) (Fig. 2B and 2C). 이러한 결과는 아교질 세포의 흥분성에 대한 X/XO의 효과가 신경교세포와 관 련된 신호전달 경로를 통하여 이루어짐을 추측할 수 있다.

3. X/XO의 효과에 대한 TLR4의 역할

TLR4는 말초신경 손상 후 미세아교세포의 활성에 의한 통증의 발생 에 밀접히 관련되어 있다고 알려져 있다[16]. X/XO 투여에 의한 내향 성 전류의 발생에 TLR4가 관여하는지를 알아보기 위하여 TLR4 억제 제인 Tak-242의 효과를 확인하였다. X/XO 투여에 의해 발생된 내향 성 전류는 Tak-242의 전처리 후 유의하게 감소하였다(–2.6 ± 0.9 pA, n = 7, p ＜ 0.001) (Fig. 3A and 3B).

ROS가 신호전달에 영향을 미치는 대표적인 경로로 LPS에 의해 진행 되는 경로를 들 수 있는데, LPS 유도 경로는 미세아교세포의 활성을 증 가시키고 미세아교세포에서 세포외로 ROS를 방출하여 신경독성을 나 타낸다[17]. X/XO 투여에 의한 ROS의 증가가 내향성 전류를 유발하는 데 TLR4가 관여함을 확인하였으므로, 다음에는 LPS 처치에 의해서도 ROS가 발생되어 신경흥분성에 영향을 미치는지와 여기에 TLR4가 관 여하는지를 확인하였다. LPS를 5분 동안 5 μg/mL 투여하였을 때 X/ XO 투여와 유사한 내향성 전류가 발생하였으며(–8.1 ± 0.8 pA, n = 18), 이는 비특이적 ROS scavenger인 PBN (1 mM)에 의해 유의하 게 감소하였고(0.8 ± 1.2 pA, n = 4, p ＜ 0.001), Tak-242 (1 μM) 전처리에 의해서도 유의하게 감소하였다(–1.6 ± 2.1 pA, n = 5, p ＜ 0.05) (Fig. 3C–3E). 이러한 결과는 미세아교세포 내의 ROS 증가가 TLR4의 활성을 통하여 이루어지며, 이어지는 경로를 통하여 인접한 아 교질 세포의 흥분성을 변화시킬 수 있음을 의미한다.

Discussion

ROS는 조직손상이나 유해반응에 의해 세포 내에서 증가하여 세포손 상을 일으키는 물질로 작용하는 한편 유전자 발현, 세포 분화와 증식 등 여러 가지 세포기능을 조절하는 조절물질로서의 역할도 보고되어 있다 [3,18]. 최근에는 ROS가 통증발생과 유지에 중요하게 관여되어 있다 고 보고되었는데, 예를 들면 척수의 ROS 양이 증가 〮 감소함에 따라 비 례적으로 통증행동 반응이 증가 〮 감소되었고[3,19,20], superoxide dismutase [20], tirilazad [21], PBN [4], vitamin E [22] 같은 다양 한 항산화제를 투여함으로써 진통효과가 나타나는 것이 보고되었다. 이 러한 결과들은 척수에서 작용하는 ROS가 통증의 발생과 유지에 관여 하고 있음을 나타낸다.

최근 ROS의 통증조절에 대한 역할을 규명하기 위하여 본 실험실에서 는 여러 가지 ROS donor가 척수 아교질세포의 흥분성에 미치는 효과 에 대한 연구를 진행하였다. NaOCl에 의해 아교질 세포의 막전압의 변 화를 보고하였고[23], NO donor인 sodium nitroprusside의 농도에 따른 막전압에 미치는 서로 다른 효과를 규명하였으며[24], ∙OH를 발 생시키는 tert-buthylhydroperoxide가 척수 아교질세포의 흥분성 시 냅스 후 전압을 증가시킴을 확인하였다[22]. 최근에는 X/XO의 투여에 의해 발생한 O₂^∙-가 시냅스 전과 후에 서로 다른 기전으로 작용하여 탈 분극시킬 수 있음을 확인하였다[5]. 그러나 Park과 Chun [5]의 연구에 서는 아교질세포가 효소처리에 의해 단일세포로 분리된 상태에서는 X/ XO에 의해 전혀 반응을 보이지 않아, X/XO는 먼저 척수 아교질세포의 주위 세포에 영향을 주고 이차적으로 척수 아교질세포에 영향을 미쳤으 리라 추측할 수 있다.

ROS는 정상 세포에서 미토콘드리아의 세포호흡 과정이나 세포질 혹 은 세포막 효소활성에 의해 지속적으로 생성된다[25]. 특히 미세아교세 포에서 생성된 ROS는 신경세포에 직접적인 산화스트레스를 가하여 신 경세포의 기능이상과 세포죽음의 주요한 요인으로 여겨진다[26-28]. ROS가 미세아교세포를 통하여 신호전달에 영향을 미치는 대표적인 경 로로 LPS에 의해 진행되는 경로를 들 수 있는데, 이 경로는 LPS가 미 세아교세포의 활성을 증가시키고, 그로 인하여 미세아교세포에서 세포 외로 ROS를 방출하여 신경독성을 나타낸다[17].

미세아교세포의 활성은 인접하고 있는 신경세포와 성상세포의 활성 에 영향을 주는데, 빠르게 세포외 환경을 변화시키고, 시냅스 신호전달 이나 신경세포의 기능을 조절하기 위하여 화학물질을 분비한다[29]. 그 러나 중추에서의 신호전달에 신경교세포의 기능들이 보고되고 있음에 도 불구하고 통증전달과 관련된 척수 아교질세포의 신경활동성에 대한 미세아교세포의 역할에 대한 연구는 잘 이루어지지 않고 있는 실정이 다. 따라서 이 연구에서는 X/XO에 의한 척수 아교질세포의 흥분성의 증가에 대한 주변 미세아교세포의 영향을 확인하고자 TLR4의 역할을 조사하였다.

X와 XO를 혼합 투여하면 XO는 X을 산화시켜 uric acid로 만드는 과정에서 O₂^∙-를 발생시키고 이것은 세포내 superoxide dismutase (SOD)에 의해 H₂O₂로 변환된다. 이 연구결과에서 X/XO에 의한 ROS 는 아교질세포에서 내향성 전류와 탈분극을 유발하였다. Sato 등[30] 은 X/XO 투여에 의해 약물투여 직후부터 O₂^∙-가 발생되기 시작하여 5 분 정도 경과하면 SOD에 의해 H₂O₂로 전환된다고 하였으며, Zhou 등 [31]도 X/XO 투여는 즉각적인 변화를 보이지만 H₂O₂에 의해서는 느 리고 지속적인 변화를 보인다고 하였다. 이 연구에서도 X/XO는 투여 후 1분 이내부터 즉각적인 내향성 전류와 탈분극을 나타냈는데(Fig. 1), 이것은 이전에 보고한 H₂O₂에 의한 작고 느린 반응과는 차이가 있었다 [32].

최근 연구에서 신경교세포의 억제제가 염증성 통증과 신경병증성 통 증을 감소시키는 등[33], 신경세포에 이웃하고 있는 성상세포와 미세아 교세포가 통증전달의 강력한 조절자로 작용함이 보고되고 있다[12]. 따 라서 X/XO 투여에 의한 내향성 전류의 발생에 신경교세포의 활성이 관 여하는지를 알아보고자 minocycline과 fluorocitrate의 효과를 확인하 였다. X/XO 투여에 의한 내향성 전류는 미세아교세포의 억제제인 minocycline과 성상세포의 억제제인 fluorocitrate의 전처리에 의해 억제 되었다(Fig. 2). 이러한 결과는 아교질 세포의 흥분성에 대한 X/XO의 효 과가 신경교세포와 관련된 경로를 통하여 이루어짐을 추측할 수 있다.

신경교세포가 통증조절과 관련된다는 연구는 많이 시행되고 있다. 신경교세포의 억제제가 염증성 통증과 신경병증성 통증을 감소시키고 [33], minocycline의 전신투여로 포르말린에 의해 유발되는 염증성 통 증이 억제된다고 하였으며[34], 말초신경 손상에 의한 신경병증성 통 증의 발생에 미세아교세포의 활성이 증가함이 보고되었다[35]. 또한 Tanga 등[16]은 말초신경 손상 후 미세아교세포의 활성에 의한 통증의 발생에 TLR4가 밀접히 관련되어 있다고 하였다.

신경교세포가 ROS에 의해 영향을 받는 기전은 다양하게 보고되어 있 는데, Little 등[36]은 신경교세포에 존재하는 glutamate transporter (GLT1)가 ROS에 의해 억제되며, 이것은 시냅스 공간에서 glutamate 농도를 증가시켜 흥분성 전달을 강화할 수 있다고 하였으며, Ficker 등 [37]은 ROS가 신경교세포의 P2X 수용체를 활성화하여 통증전달에 영 향을 미친다고 하였다. Kim 등[38]은 다양한 외부자극에 의해서 발생 된 ROS가 TLR의 기능과 발현을 조절한다고 하였다. 특히 미세아교세 포에서 LPS에 의해 매개된 TLR4의 활성은 신경염증 연구의 모델로 사 용되고 있는데, 생쥐의 뇌에 LPS를 주입하여 광범위한 미세아교세포의 활성을 일으키고 ROS 발생을 증가시켰다[39].

이 연구에서는 X/XO 투여에 의해 발생한 ROS의 작용에 TLR4가 관 여하는지를 알아보기 위하여 TLR4 억제제인 Tak-242의 효과를 확 인하였는데, Tak-242의 전처리 후 X/XO에 의해 발생된 내향성 전류 를 유의하게 감소시켰다(Fig. 3A and 3B). 또한 LPS 처치에 의해서도 ROS가 발생되어 신경흥분성에 영향을 미치는지와 여기에 TLR4가 관 여하는지를 확인한 결과 LPS는 X/XO와 유사하게 내향성 전류를 발생 시켰으며 이는 ROS scavenger인 PBN과 TLR4 억제제인 Tak-242 전처리에 의해 유의하게 감소하였다(Fig. 3C–3E). 이러한 결과는 미세 아교세포 내의 ROS 증가가 TLR4의 활성을 통하여 이루어지며, 이어 지는 경로를 통하여 인접한 아교질세포의 흥분성을 변화시킬 수 있음을 의미한다. 이러한 일련의 과정을 종합하여 Fig. 4에 나타내었다.

이상의 연구결과를 종합하면 X와 XO의 병용투여는 직접적으로 척수 아교질세포에 ROS를 증가시키기보다는 인접한 미세아교세포의 TRL4 에 작용하여 세포내 ROS를 증가시키며, 이어지는 작용을 통하여 아교 질세포에 영향을 미쳤을 것으로 생각된다. 차후의 연구에서는 척수 아 교질세포 주위의 신경교세포에서 어떠한 조절물질이 분비되어 작용을 나타내는지 확인하고자 한다.