Introduction

골조직은 뼈의 발달과 성장의 과정(modeling)이 끝난 성인에게도 골 재형성(bone remodeling) 과정이 일어나는 특수한 결합조직이다. 정 상인의 경우, 뼈의 항상성은 형성과 재형성 과정으로 조골세포(osteoblast) 에 의한 뼈의 형성과 파골세포(osteoclast)에 의한 뼈의 재흡수의 균형으로 항상 평형이 유지된다[1]. 하지만 폐경기 이후 여성들에게서 나타나는 급격한 에스트로겐의 분비 감소로 인한 결핍, 노화, 비타민 D 결핍 및 섭취감소, 흡연, 과량의 카페인, 알코올 섭취 등 여러 가지 원인 으로 골 흡수 기능이 골 형성 기능보다 우세하게 되어 골조직의 대사과 정이 평형을 잃게 된다. 이렇게 골대사에 영향을 미쳐 불균형으로 인해 상대적으로 과한 골흡수가 일어나게 되면 결과적으로 골격계 질환이 유 발될 수 있다[2]. 따라서 골격계 질환의 치료를 위해 조골세포의 분화가 기능을 자극하여 골형성을 촉진하거나 파골세포의 활성을 억제하여 골 질량의 감소를 막는 여러 물질들이 나타나고 있다[3,4].

골격계 질환의 치료를 위해 다양한 물질이 사용될 수 있으며, 이 중 골 다공증과 관련되는 영양성분 중 하나인 칼슘은 뼈를 구성하는 중요 성 분으로서 성인 체중의 약 1.5–2%로 인체의 무기질 중 가장 많이 존재 한다[5]. 특히 골질환 환자에게서 부갑상선 호르몬의 증가로 인해 신장 과 소장에서 흡수가 감소하므로 체내에서 요구하는 칼슘 양이 많아지게 된다. 이렇게 칼슘 섭취가 골량을 증가시키는 데 영향을 미친다는 많은 연구 결과가 알려져 있다[6]. 하지만 칼슘에 대한 연구들이 골량과 골 밀도의 다양한 변수에 따른 수준에 대한 내용은 일치되지 않아서, 뚜렷 한 결론을 내지 못하였다. 현재까지 고농도의 칼슘이 골다공증에 미치 는 영향에 관해서는 보고된 바가 없기에, 본 연구에서는 고농도의 칼슘 이 뼈 조직 내의 주 세포인 조골세포에 어떠한 영향을 미치는지 알아보 고자 하였다.

조골세포는 중간엽 줄기세포에서 분화하고, 조골세포 분화는 뼈 항 상성을 유지하는 데 중요하며, 일반적으로 성장호르몬과 사이토카인 (cytokine) 및 다양한 전사 인자(transcription factor)에 의해 유지된 다[7]. Bone morphogenetic proteins (BMP)는 조골세포의 분화와 골형성 조절에 중요한 역할을 하는 사이토카인이다[8]. 조골세포의 분 화에 있어 runt-related transcription factor 2 (Runx2)는 핵심 전 사 인자로 작용한다. Runx2는 osterix, osteocalcin (OC), alkaline phosphatase (ALP), collagen1과 같은 조골세포 분화 마커 유전자의 promoter에 결합하고 유전자들의 발현을 증가시킴으로써 조골세포의 분화를 유도한다[9].

따라서 본 연구에서는 bi-potential mesenchymal 전구 세포인 C2C12 세포를 이용하여 조골세포의 증식과 분화에 미치는 영향을 관 찰함으로써 조골세포 분화 마커 유전자 발현 및 단백질의 발현을 확인 하였다. 특히 고농도의 칼슘이 뼈의 대사에 미치는 영향에 관해 알아보 았다.

Materials and Methods

1. 세포 배양 및 조골세포 분화 유도

C2C12 세포주는 쥐로부터 유래된 전 근모세포의 서브 클론이다. 세 포는 37℃로 유지된 5% CO₂ 환경에서 10% fetal bovine serum와 1% penicillin-streptomycin antibiotics (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 함유하고 있는 Dulbecco’s modified Eagle’s Medium (Gibco, Waltham, MA, USA) 배지를 이용하여 배 양하였다. 조골세포 분화를 유도하기 위해 plate에 80% 이상 자라도록 배양한 후, 같은 배지에 BMP4 (500 ng/mL, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 첨가하여 똑같은 환경에서 24–48시간 동안 배양하였다.

2. Alkaline phosphatase 염색과 Alizarin red S (ARS) 염색

먼저 분화된 C2C12 세포에 4% formaldehyde를 넣고 15분간 상온 에 두어 고정시켰다. 그 후 BCIP/NBT color development substrate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 넣어주고 15분 간격으로 ALP의 활성을 관찰하였고(ALP 염색), 석회화된 칼슘 결절은 ARS 용 액을 이용하여 60분간 염색하였다(ARS 염색). 그리고 분석을 위해 dimethyl sulfoxide에 시편을 녹여 480 nm (ALP 염색), 405 nm (ARS 염색) 파장으로 흡광도를 측정하여 정량적으로 분석하였다.

3. 세포 독성 분석

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Thermo Fisher Scientific) assay를 사용하여 CaCl₂ 가 농도별로 세포생존율에 미치는 영향을 확인하였다. 세포 배양용 24 well plate에 키운 C2C12에 농도별로 화합물을 처리하고 각 24시간, 48시간 배양하였다. 그 후 MTT (5 μg/mL) 용액을 각 well에 넣고 최 종 농도를 0.5 μg/mL로 설정하였다. 1시간 동안 배양한 다음 상층액 을 제거하고 isopropanol (500 μL)을 넣어 MTT 결정을 용해시켜 96 well plate에 150 μL씩 넣어 490 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정 량적으로 분석하였다.

4. RNA 추출 및 real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)

RNA는 TRIzol 용액을 이용하여 phenol-chloroform 기법으로 추 출하였다. 배양된 6 well plate에 각 1 mL씩 넣고, chloroform을 200 μL씩 처리한 다음 4℃, 13,200 rpm에서 15분 동안 원심 분리하였다. 다음으로 상층액을 분리한 후, isopropanol을 같은 용량으로 넣어 섞어 주고 4℃, 13,200 rpm으로 15분간 원심분리하였다. 이후 상층액을 제 거하고 생긴 pellet을 80% EtOH로 씻어주고, 13,200 rpm에서 15초 간 원심분리 해준 다음 최종 pellet을 DEPC water에 녹여 농도를 정 량하였다. 올리고(dT) 프라이머와 역전사 효소(Takara, Nojihigashi, Japan)를 사용하여 cDNA를 합성했다. RT-PCR은 TOPreal^TMqPCR 2X PreMIX (SYBR Green with low ROX)을 사용하여 StepOne^TM Real-Time PCR System (Molecular Devices,San Jose, CA, USA)으로 실험하였다. 모든 샘플들은 95℃에서 30초간 반응시킨 다음 95℃에서 5초, 60℃에서 30초간 40 cycle을 반응시켜 CT 값을 얻어 내었다. 내부 대조군으로 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)의 발현량이 mRNA의 발현량을 표준화하기 위하여 이용되었다. △C_t는 타겟 값에서 GAPDH의 C_t 값을 빼서 결정되었다. 각 유전자의 발현 수준은 2 △△C_t에 의해 계산되었다. PCR에 사용되 는 프라이머의 서열은 Table 1에 나열되어 있다.

5. 단백질 추출, 전기영동 및 Western blot

단백질을 추출하기 위해 준비된 6 well plate의 세포에 phosphate buffered saline로 세척 후 ice로 온도를 유지하며 RIPA lysis buffer (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 20분간 세포를 떼었다. 4℃ 에서 13,200 rpm으로 30분간 원심분리 하여 상층액에 있는 세포 추 출물을 분리하였다. 추출된 단백질의 농도를 정량하고 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis를 이용하여 전기영동을 통해 polyvinylidene fluoride (GE Healthcare, Buckinghamshire, United Kingdom) 막에 분리시켰다. 이를 다시 membrane으로 transfer시켰다. Membrane은 5% milk로 1시간 blocking 한 후 Tris-buffered saline로 씻었다. 그 다음 각 단백질의 1차 항 체를 넣고 상온에서 반응시킨 후 1차 항체에 맞는 2차 항체를 사용하여 1시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 후 enhanced chemiluminoesence (GE Healthcare) 용액을 넣어준 다음 LAS-4000 (Fujifilm, Tokyo, Japan)에 감광하여 단백질의 발현을 분석하였다.

6. 통계 분석

GraphPad Prism 5.03 software (La Jolla, CA, USA)를 이용하 여 통계를 분석하였다. 실험 결과는 평균(mean) ± 표준편차(standard deviation)로 표시하였다. p-value는 p ＜ 0.05인 수준에서 통계적으 로 유의성을 가진다고 판단하였다.

Results

1. CaCl₂의 농도에 따른 세포 독성 평가

CaCl₂가 세포의 독성에 미치는 영향에 대해 알아보기 위해 MTT assay를 시행하였다. 농도를 0.008, 0.04, 0.2, 1, 5, 25, 125, 625 mM로 처리하고 시간을 24시간, 48시간 동안 배양시키면서 생존도를 관찰하였다. 칼슘의 농도가 증가함에 따라 1 mM까지는 비슷한 생존율 을 보였으나 고농도에서는 대조군에 비해 세포 독성을 보였다(Fig. 1).

2. CaCl₂의 ALP 염색 결과

ALP 활성은 조골세포 분화의 표시자로서 중요한 역할을 하므로 CaCl₂의 농도에 따른 세포의 분화를 관찰하기 위해 염색을 진행하였다. 대조군은 BMP4 (500 ng/mL)를 처리하지 않은 세포로 하여 C2C12 cell에 BMP4와 농도별로 CaCl₂를 처리하여 효과를 확인하였다. CaCl₂ 의 농도가 0.2 mM, 1 mM일 때 비교적 높은 ALP의 활성을 보여주 었다. 정량적으로 측정하였을 때, 저농도에서 고농도로 갈수록 ALP의 발현이 줄어들었다. 또한 고농도인 5 mM인 CaCl₂를 처리한 세포는 BMP4만 처리한 대조군에 비해 ALP의 활성이 감소하였다(Fig. 2A). 추가로 뼈를 구성하는 칼슘의 형성에 대한 효과를 확인하기 위해 ARS 염색을 진행한 결과, 비교적 고농도인 1 mM, 5 mM의 CaCl₂에서 억 제 효능이 나타났다(Fig. 2B).

3. 고농도의 CaCl₂가 골 형성 유전자의 발현에 미치는 영향

뼈가 형성되는 과정에서 조골세포의 특정 유전자의 발현이 증가한다. C2C12 세포주 분화 과정에 5 mM CaCl₂를 처리한 후 ALP mRNA 발 현을 관찰하기 위해 RT-PCR을 시행하였다. 대표적인 조골세포 분화 표지자인 ALP의 mRNA 발현은 대조군과 비교하여 가장 높게 감소하 였으며, bone sialoprotein (BSP), Col1α1의 mRNA 발현도 유효하 게 감소하였다. 하지만 조골세포 분화 후기 표지자인 OC과 전사 인자인 Runx2와 osterix의 mRNA 발현은 크게 영향을 받지 않았다(Fig. 3).

4. 고농도의 CaCl₂가 조골세포 분화관련 유전자의 단백질 수 준에 미치는 영향

CaCl₂가 조골세포 분화 관련 유전자를 단백질 수준에서 어떻게 조절 하는지 알아보기 위해 BPS, Col1α1, Runx2와 osterix 항체를 이용하 여 Western blot을 진행하였다. 대조군으로 α-tubulin 항체를 이용하 였다. 조골세포 분화 표지자인 BSP와 Col1α1의 단백질 수준이 BMP4 를 처리하였을 때와 비교하여 5 mM의 CaCl₂에 의해 감소하였다. 또한 전사인자인 Runx2와 osterix의 단백질 수준도 CaCl₂에 의해 억제되었 다(Fig. 4).

Discussion

칼슘은 우리 몸에 중요한 필수 영양소 중 하나로 음식물이나 영양제 로 섭취되어 다양한 생리작용을 나타낸다[10]. 대표적으로 칼슘은 이온 형태로 전환되어 다양한 세포 내의 신호전달을 매개하고 세포나 조직 사이의 상호작용에 중요한 역할을 한다[11]. 또한 인체 내의 무기질 중 가장 비중이 높으며 골격과 치아를 형성하고 일부는 혈액순환, 신경전 달, 심장박동, 근육의 수축 및 이완, 혈액응고에 쓰인다[12]. 따라서 칼 슘의 결핍은 여러 가지 이상증이나 질환을 유발할 수 있는데 그 중에서 도 칼슘 결핍으로 인한 골다공증은 뼈의 형성과 흡수의 균형이 깨지면 서 생기는 질환으로써, 여성에게서 폐경기 이후 흔히 발생한다. 폐경기 이후 여성호르몬의 감소로 뼈 흡수가 증가하고 칼슘의 흡수가 감소되 어서 발병한다[13]. 정상적인 경우에는 칼슘이 체내에 들어오고 나가는 양이 같아 평형을 이루고 있으나, 칼슘을 저장하는 인 골격계에 칼슘의 양이 부족하거나 혹은 칼슘이 과도하게 빠져나가는 경우 골량이 감소하 며 골다공증에 의한 골절이 빈번히 발생하게 된다[14]. 골다공증을 치 료하기 위해 bisphosphonates, 부갑상선 호르몬 제제, denosumab 등의 항체제제가 사용되고 있으며, 예방 차원에서 칼슘제를 복용하기 도 한다[15]. 칼슘을 투여하면 혈청 칼슘 농도가 증가되고, 칼시토닌의 분비가 촉진되어 뼈에서 칼슘이 빠져나가는 것을 막으며 칼슘의 투여 가 뼈 손상과 약한 골질의 재수복에 좋은 영향을 미친다[16]. 하지만 이 러한 목적으로 칼슘을 과도하게 많이 섭취하거나 투여하게 되면 오히려 뼈 기능을 악화시킨다는 연구결과도 있다. 한 가지 예로 고농도의 칼슘 은 T림프구를 활성화시키고 파골세포-활성인자 유사물질을 분비하여 파골세포의 증식을 유도하여 결과적으로 골흡수를 증가시키는 결과가 있다[17]. 혈장 속의 칼슘 농도가 정상치(2.1–2.6 mM)보다 높은 상태, 즉 고칼슘혈증은 이외에도 골절, 뼈 통증 등의 골격계 질환을 일으킬 수 있고 뿐만 아니라 부정맥, 신장결석 등의 원인이 될 수 있다[18]. 따라 서 무조건 칼슘의 섭취를 권장하기 보다는 골형성과 골흡수 균형을 통 해 뼈의 항상성을 유지할 수 있는 칼슘 농도에 대한 연구가 필요하다.

본 연구에서는 정상 농도의 약 2배에 해당하는 칼슘을 이용하여 실 험을 진행하였다. 더욱 높은 농도의 칼슘을 이용하여 실험을 진행하려 고 하였으나, 정상의 약 10배의 농도인 25 mM의 칼슘에서는 세포독 성이 나타났다(Fig. 1). 이 농도를 이용하여 실험을 진행하면 세포독성 에 의한 것인지 분화를 억제하는 효과인 것인지를 판단하기 어려워 그 보다 낮은 농도에서 실험을 진행하였다. 칼슘에 의해서 ALP의 활성과 골형성 지표인 칼슘의 축적이 억제되는 결과를 확인하였다(Fig. 2). 이 러한 효과는 1 mM의 칼슘보다는 5 mM의 칼슘에서 더욱 뚜렷하게 관 찰되었으며 이는 농도 의존적으로 칼슘이 조골세포의 분화를 억제한다 는 것을 의미한다. 조골전세포(pre-osteoblast)가 조골세포가 되는 과 정은 크게 3단계를 거쳐 진행되며 그 과정 동안 다양한 유전자들이 발 현되어 복잡한 과정을 순차적으로 조절한다. 첫째로 1단계는 분화에 필 요한 충분한 세포를 확보하는 단계로 조골전세포의 증식이 활발하게 일 어나며 이 때 fibronectin, transforming growth factor-β 수용체 1, osteopontin, collagen이 주로 발현된다. 2단계는 세포주기를 멈추고 분화가 본격적으로 시작되는 단계로 ALP, BSP, collagen이 발현되어 일부 세포외기질의 성숙을 유도한다. 마지막 3단계에서는 칼슘 등의 무 기 광물질이 기질에 쌓이면서 축적되어 세포외기질이 단단하게 석회화 (minerlization)되는 과정으로 이 때 OC이 주로 발현되어 역할을 한다 [19]. 본 연구에서도 다양한 골형성 표지자에 대한 영향을 확인하였는 데, 그 결과 ALP, BSP, Col1α1의 발현을 유효하게 감소시키는 반면 OC의 발현에는 영향을 주지 않았다(Fig. 3). 이러한 결과는 고농도의 칼슘에 의한 조골세포 분화 억제효과가 주로 분화 후기보다는 초기에 더욱 강하게 작용한다는 것을 의미한다. 본 연구는 고농도의 칼슘에 의 한 조골세포 분화의 핵심 전사인자인 Runx2와 osterix의 변화를 확인 하였다. 조골세포 분화 초기에 주로 관여하는 Runx2는 골형성과 조골 세포 분화에 필수적인 유전자로 Runx2 유전자 기능이 완전히 결여되면 연골성 골형성과 막성 골형성의 어느 것도 발생하지 않고 조골세포 분 화는 완전히 차단된다[20,21]. Osterix는 조골세포 분화 중, 후반에 주 로 발현되는 전사인자로 osterix 결핍 시 연골 발생은 정상적이지만 골 형성이 억제된다고 알려져 있다[22]. 결과적으로 골형성에 있어서는 두 가지 유전자의 발현이 모두 중요한데, 고농도의 칼슘은 RNA 수준에서 두 가지 유전자의 발현에 크게 영향을 미치지 않았다(Fig. 3). 반면 단백 질 수준에서 Runx2와 osterix를 감소시켰는데, 고농도의 칼슘이 두 전 사인자의 단백질 안정화를 억제하고 분해를 촉진시킬 가능성이 있다. Runx2와 osterix는 공통적으로 ubiquitin-proteasomal 경로를 통해 분해되며 ubiquitin을 단백질에 결합시키는 E3 ligase이 확인되었다 [23,24]. 따라서 고농도의 칼슘은 동일한 E3 ligase를 통해 ubiquitinproteasomal 경로를 활성화하고 Runx2나 osterix의 단백질 분해를 촉진시킬 수 있을 것이라 판단된다.

본 연구를 통해 골질환에 좋다고 인식되어 있는 칼슘이 오히려 고농 도에서는 조골세포의 분화를 억제하여 부작용으로 나타날 수 있다는 것 을 확인하였다. 물론 농도에 대한 정확한 설정, 작용기전에 대한 세부적 인 연구, 동물 실험을 통한 확인 등이 추가로 필요하겠지만, 이러한 결 과를 통해 칼슘의 섭취나 투여에 관해 다른 시각에서 고려가 가능할 것 으로 기대된다.