Introduction

현대인의 고염·고당식이(high salt and glucose diet, HSGD)는 다 양한 질병발생과 연관되어 있다[1-5]. 고염식이로 인해 축적되는 체 내 과량의 나트륨은 혈관벽과 심근의 두께를 증가시키고 신장기능을 감소 시키며 뇌 교감신경세포 감작 및 인슐린 저항성을 증가시킨다[1,2]. 피 부 축적 시 T 림프구의 pro-inflammatory Th17 세포로의 분화 촉진 및 염증성 사이토카인 생산을 촉진함으로써 자가면역 질환과 유사한 증 상을 매개한다[6]. 체 내 과량의 나트륨은 피부, 장, 위 점막에도 축적될 수 있으며[7,8], 따라서 치은과 치주 점막에 축적되는 경우 치주조직에 염증반응을 유발할 수 있을 것이라고 생각할 수 있다. 또한, 고당식이는 구강 내 정상 세균총의 변화를 유발하고 치주 조직의 상태를 변화시키 며[9], Streptococcus mutans를 증가시키고 타액분비를 감소시키는 것으로 보고되었다[10]. 위의 연구보고들은 HSGD가 치주염 발생 및 예후 관리에 중요한 인자로 작용할 것을 나타내고 있으나, 이에 대해 자 세히 연구된 바 없다.

본 연구는 치주염-유발 혼합미생물이 함유된 흡수성 봉합사의 치은 열구 내 삽입을 통해 치주염 동물모델을 확립하고, 치주염 유발 이후 8 주 회복기간 동안의 HSGD에 의한 치조골 회복 정도를 확인하였다.

Materials and Methods

1. 실험동물 및 치주질환 동물모델 확립

본 연구는 원광대학교 동물실험윤리규정을 준수하여 수행되었다(승 인번호 WKU17-64). 12주령 무균(specific-pathogen free, SPF) 상태의 백서(Sprague Dawley [SD] rat)는 샘타코 바이오코리아 (Osan, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 온도 23 ± 1℃, 습도 50 ± 5%, 소음 60 phone 이하, 조명시간 08:00–20:00 (1일 12시간), 조도 150–300 Lux, 환기 시간당 10회–12회의 무균상태의 사육조건 을 유지하였다. 사육기간 중 각 실험군에 따라 일반고형사료(38057, 퓨 리나; general diet, GD)를 중앙실험동물㈜(Seoul, Korea)에서 공급 받고, 일반고형사료에 4% NaCl과 68% sucrose를 추가한 고염고당 사료(HSGD)를 제작하여 급여하였으며, 음용수는 자유롭게 섭취하도 록 하였다(Table 1). 귀에 표식을 하여 각 백서들을 식별하고 체중과 식 이량, 음수량을 12주 동안 매주 측정하고, 백서의 안정 상태, 물, 음식의 섭취량 및 병징(설사, 직장 출혈, 통증) 여부를 매일 관찰하며 생존을 측 정하였다.

치주염 유발을 위해 4주 동안 1주일 간격으로 전신마취 하에 Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277)와 Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586)이 함유된 6-0 Vicryl (Ethicone, Cincinnati, OH, USA)을 우측 상악 제2대구치 치은열구에 삽입하였다. P. gingivalis와 F. nucleatum은 1 mL당 2 × 10⁹ CFU가 되도록 1:1로 혼합 하였으며, 6-0 Vicryl을 수 분 동안 혼합균에 노출 후 사용하였다. 4주 이후에는 전신마취 하에 micro-computed tomography (μCT) 촬영 을 제외하고는 아무런 개재 없이 8주간 회복기간을 두었으며, 마지막 12주차에는 모든 개체를 희생시킨 후 상악을 적출하여 μCT를 촬영하 였다(Fig. 1A).

2. μCT 촬영

각 개체는 전신마취 후 Quantum GX μCT imaging system (PerkinElmer, Hopkinton, MA, USA)를 이용하여 관전압 90 kVp, 관전류 88 μAm, 촬영범위는 45 mm (voxel size, 90 μm)의 조건 에서 촬영되었다. 촬영 이미지로부터 치조골 높이를 측정하기 위한 기 준영상으로 정중구개 봉합선을 통과하는 횡단면과 안면의 정중시상면 에 수직인 관상면에서 제2대구치 협측 2번째 치근의 중앙을 지나는 영 상을 선정하여 좌우측 치아가 비슷하게 관찰되는지 확인하였다. 이 영 상에서 정중구개 봉합선에서 구개측 치조정까지의 높이를 측정하였다 (Fig. 2A–D).

3. 통계분석

본 연구에서 얻은 결과들은 Origin 2020^® (OriginLab, Northampton, MA, USA)를 이용하여 분석되었고, 평균 ± 표준오차로 표기 되었다. 통계학적 유의성 검증을 위해 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 시행하였으며, 사후검정을 위해 Scheffe 분석을 실시하였 다. 통계적 유의성의 표준값은 p ＜ 0.05로 설정하였다.

Results

1. 식이 조건에 따른 체중 변화량 및 사료/물 섭취량 분석

식이 조건에 따른 백서의 체중 변화량과 사료 및 물 섭취량을 전체 실 험기간 동안 매주 측정한 결과, 실험 0주에 평균 체중은 362.8 g으로 모든 군의 백서에서 체중이 실험기간 동안 일정하게 증가하였으며, 그 룹 간 체중 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(Fig. 1B). 또한, 음성대 조군(정상 백서)에 비해 GD대조군과 HSGD실험군에서 식이 섭취량이 증가했으나, 이러한 차이는 통계학적으로 유의하지 않았다(p ＞ 0.05, Fig. 1C). 식이 조건에 따른 백서들의 물 섭취량을 조사한 결과, 음성대 조군과 GD대조군에 비해 HSGD실험군에서 증가하는 경향을 보였으 나, 이러한 차이는 통계학적으로 유의하지 않았다(Fig. 1D).

2. 식이 조건에 따른 치조골 높이의 변화

각각의 군에서 0주, 4주, 8주, 12주에 촬영한 in vivo μCT 실험결과, 대조군의 치조골 높이는 평균 0.567 ± 0.194 mm에서 시간이 지남에 따라 지속적으로 증가하였다. GD군과 HSGD군에서 모두 4주와 8주 사이에 우측의 치조골 높이가 감소하였으며, 8주 이후에는 치조골 높이 가 점차 증가하는 양상을 보였다(Table 2, Fig. 2E–L). 각 개체에서 봉 합사를 삽입하지 않은 좌측의 치조골 높이 대비 우측 치조골의 상대적 높이를 시기별, 군별로 평가하였다(Fig. 3). 음성대조군에서는 0주에 91.2% ± 7.63, 4주에 105.2% ± 7.54, 8주에 104.4% ± 4.60, 12 주에 96.1% ± 6.38로 좌측 치조골 높이와 비교했을 때 유의적인 차이 를 보이지 않았다(p ＜ 0.05). GD대조군에서는 0주에 97.3% ± 3.70, 4주에 65.8% ± 5.64, 8주에 73.5% ± 4.89, 12주에 71.4% ± 5.68 로 4주에 상대적 치조골높이가 가장 낮았으나, HSGD실험군에서는 99.6% ± 3.81, 63.7% ± 3.25, 61.6% ± 3.50, 72.7% ± 2.74로, 8주차에 치조골 높이가 가장 낮았다. GD 대조군과 마찬가지로 HSGD 실험군도 0주를 제외하고 4, 8, 12주에서 치주염이 잘 유발되었음을 보 여준다. 4주 및 12주차 GD대조군과 HSGD실험군의 우측 치조골 높이 에는 차이가 없었지만(p ＞ 0.05), 8주차에서는 HSGD실험군의 우측 치조골 높이가 GD대조군의 치조골 높이보다 상대적으로 낮았으며, 그 차이는 통계적으로 유의하였다(p ＜ 0.05). 봉합사 삽입으로 유도된 치 주염에 의한 치조골 감소가 4주차 이후부터 다시 회복되는 GD대조군과 달리 HSGD실험군에서는 8주차까지도 치조골 감소가 유지되었다. 이 러한 결과는 HSGD에 의해 치조골 흡수 정도가 증가되었으며, 치조골 흡수를 동반하는 치주염 동물모델로서 활용될 수 있는 가능성을 나타낸 다.

Discussion

고염식이로 인해 점막에 축적되는 나트륨은 점막에 고장성 변화를 일 으켜 부종과 염증성 사이토카인의 증가를 유발할 수 있다[3,4]. 그러나 지금까지 나트륨에 의해 점막이 병적 변화를 일으킨다는 가설은 위 점 막과 장 점막에서만 증명되었으며[7,8], 구강 점막에 대해서는 연구된 바가 없다. 그 밖에도 Aggregatibacter actinomycetemcomitans나 Gram 음성 혐기성을 띠는 병적 세균총을 포함하는 치태와 치은하 조직 의 환경변화와[11], 만성적 스트레스[12], 저산소증[13], 신경손상[14] 등의 다양한 조건도 치주질환의 발생에 영향을 미칠 수 있다고 알려져 있다. 이러한 기존의 연구들을 종합하여 저자들은 HSGD가 치주질환을 악화시킬 수 있다고 가설을 세웠다.

식이 또는 영양 불균형이 치주염의 발생에 영향을 미칠 수 있다는 연 구는 단백질 결핍[15], 고탄수화물 식이[16], 고당식이인 Keyes diet [17]가 치주염의 발생에 어떤 영향을 미치는지 연구된 바 있다. 그러나 설치류에서 Keyes 2000 식이만으로 치주염을 발생시키는 데에는 8개 월까지 소요되며, 치주염과 우식 발생에 실패하는 경우도 있다고 보고 되었다[18]. 식이만 이용한 치주염 모델의 한계를 극복하기 위해 고당 식이[17], 신체 억제에 의한 스트레스[19] 등을 구강 내 균을 주입하는 방법과 병행한 연구들도 이루어져 왔다.

이러한 모델에서는 수 일에서 수 주 내 예측 가능하게 질병이 시작되 지만[20], 구치부 치아에 실을 위치시키는 것이 기술적으로 어려울 뿐 아니라[21,22] 봉합사를 제거한 후에는 염증반응이 사라지고 치유반응 이 시작되므로 사람에서 발생하는 치주염과 다른 임상양상을 보인다는 한계가 있었다[23]. 본 연구에서는 흡수되는 봉합사에 P. gingivalis와 F. nucleatum를 묻혀 치주질환이 시작되도록 하였으며, 이러한 치주염 모델은 세균에 의해 발생하는 치주염을 재현하는 데 효과적일 것이라고 가정하였고, 치주염의 발생과 회복에 HSGD가 미치는 영향을 규명하고 자 하였다.

기존의 치주염 동물모델에 사용된 설치류는 대부분 hamster 혹은 Wistar rat이었으나, 저자들은 비교적 확보하기 쉬운 SD rat에서 치주 염 발생기간을 단축시키고자 하였다. SD rat은 치주질환 저항성이 있기 때문에[24] 저자들은 복합적인 방법을 이용하여 치주염을 유발하였고, 이 과정에서 균주를 함유한 봉합사를 함입한 치주염 모델에 HSGD를 추가적으로 적용하여 치주염이 더 악화되는지 확인하고자 하였다.

기존의 치주염 동물모델에서는 일정 시간 간격으로 동물을 희생하여 치주염 발생정도를 확인했기 때문에 대규모의 실험 동물을 사용해야 했 다. In vivo imaging은 시간에 따른 골의 변화 양상을 관찰할 수 있게 하여 치주염 발생정도를 시간별로 확인하기 위해 개체 수를 늘릴 필요 가 없으며, 개체 간 치조골 높이의 차이에 따른 오차가 적고, 따라서 치 주염 동물모델의 검증에 유용하게 사용할 수 있다.

고나트륨혈증을 유발할 수 있는 고염식이는 동물모델에서 식이량과 물 섭취량에 영향을 미칠 수 있다. 본 연구 결과 음성대조군에 비해 GD 대조군과 HSGD실험군에서 물 섭취량이 증가하는 패턴을 보였고, 특히 HSGD실험군에서 더 큰 차이를 보였지만, 그 차이는 통계학적으로 유 의하지 않았다. 그러나 이러한 증가 패턴은 고염·고당식이의 섭취로 인 해 혈중 나트륨의 농도가 증가하면서 물 섭취에 대한 요구도를 증가시 켰기 때문일 것이라 추측된다.

본 연구에서는 치조골의 절대높이는 GD군과 HSGD군에서 모두 0주 에서 4주까지 감소했으나 4주–12주까지는 치조골의 절대높이가 다시 증가하는 양상을 보였기 때문에, 치조골 흡수에 대한 HSGD의 영향을 확인하기가 쉽지 않았다. 그러나 치조골 높이는 봉합사를 삽입한 우측 뿐 아니라 대조측으로 사용한 좌측에서도 군 간 차이를 보였기 때문에, 치조골 높이 분석을 위해 좌측 치조골 높이에 대한 우측 치조골의 상대 적인 높이의 비율을 확인하였다. 그 결과 우측의 상대적 치조골 높이가 군 간에 유의한 차이가 있음을 확인할 수 있었으며, HSGD실험군에서 는 GD대조군과 다르게 봉합사를 삽입하지 않은 4주와 8주 사이에도 치 조골의 상대적 높이가 감소함을 확인하였다. 이러한 결과는 봉합사가 삽입되지 않은 좌측의 치조골의 성장 혹은 치아 맹출이 HSGD실험군 에서 더 빠르게 이루어지기 때문일 수 있다. 또한 봉합사가 삽입된 우측 치조골에서는 이러한 성장 혹은 맹출의 경향이 더 크게 억제되었을 수 도 있음을 시사한다.

그러나 8주–12주 사이에는 HSGD실험군에서 우측의 상대적 치조골 높이가 GD대조군과 통계학적으로 유의하지 않은 차이로 회복하였고, 이것은 HSGD가 치주염에 미치는 영향이 12주까지 지속되지는 않음을 의미하였다. 이러한 결과를 향후 치주염의 치료 동물모델에 응용한다면 4주간 치주염을 유발하고 치주염 치료방법을 적용하면서 4주간의 관찰 을 하고 분석을 하는 방법을 사용하는 것이 좋을 것이라 판단된다.

In vivo μCT 영상을 이용한 종적 연구는 임상전단계에서 시간에 따른 병적 변화와 치료 결과를 연구하는 데 유용하게 사용되고 있다[25,26]. 그러나 in vivo μCT를 이용한 치주염 모델에서는 백서의 주령을 신중 하게 선택해야 한다. 낮은 주령의 백서는 몸집이 작기 때문에 in vivo imaging 장비에 넣고 촬영하기가 용이하지만, 악골과 치아, 치조골의 성장이 지속되기 때문에 치주염의 발생에 있어서는 불리하다. 높은 주 령의 백서는 치주염을 비교적 쉽게 발생시킬 수 있지만, 사육과 구매 비 용이 증가하며 in vivo imaging을 위한 영상장비에 넣기가 어렵기 때문 에 치주염 발생정도를 측정하기도 어렵다. 이 연구에서는 백서에서 21 주령까지 in vivo imaging이 가능하였기 때문에, 시간에 따른 CT 촬영 및 치조골의 변화양상의 측정이 가능하였다.

In vivo CT를 촬영하기 위해 백서는 주기적 전신마취를 받는데, 이에 따른 스트레스가 치주염의 발생에 영향을 미치는지는 본 연구 결과로 알 수 없다. 또한 동일한 개체에서 시간차를 두고 in vivo μCT를 촬영하 여 치조골 높이의 변화를 분석할 때에는 백서의 주령이 증가하고 구치 교합면이 마모되면서 시멘트와 골이 영구적으로 침착되어 치아가 지속 적으로 맹출한다는 것을 고려해야 한다. 구치는 교합면-원심-협측 방 향으로 점진적으로 이동하며, 백악법랑경계는 치조정에서의 골침착보 다 더 빠르게 교합면 방향으로 이동한다[16]. 따라서 치조골 변화를 측 정하는 기준으로 사용가능한, 변하지 않는 위치를 선정하는 것이 매우 까다로운 일이었다. 저자들은 정중구개 봉합선으로부터 치조정까지의 높이를 재현성 있는 기준영상에서 측정하여 이러한 문제를 극복하고자 하였다.

12주차에 백서를 희생한 후 촬영한 μCT 결과는 in vivo μCT보다 높 은 해상도의 영상을 제공하고 정확한 분석을 가능하게 한다. 그러나 in vivo 영상에서 제공한 시간 경과에 따른 치주염의 악화와 회복의 양상 은 종료시점에 촬영한 μCT 결과로는 알 수 없다. 이전의 연구에서는 흡 수되지 않는 면사의 열구 내 삽입이나 wire ligature 등의 물리적인 방 법으로 단기간의 치주염 발생을 유도하고 연구 종료시점에 일회의 μCT 촬영으로 치주염 발생을 확인할 수 있었다. 그러나 본 연구에서는 기존 치주염 모델에서 치주염의 회복 시점과 그 양상을 평가하기 어려웠던 한계를 극복하기 위해, 가역적인 방법으로 4주 동안만 치주염을 유발하 고 이후 8주의 치유기간 동안 치주염으로부터의 회복 여부를 평가하였 다.

그러나 본 연구 결과는 HSGD와 흡수성 봉합사와 세균을 복합적으로 적용하여 치주염을 유발하였기 때문에, 각각의 개별적인 조건이 치주염 의 발생에 어떤 기전으로 영향을 미치는지에 대해서는 규명하기 어려웠 다는 한계를 가진다. 따라서 향후 고염식이와 고당식이가 각각 치주염 의 발생에 영향을 미치는 기전에 대한 구체적이고 심층적인 연구가 필 요하다고 생각된다.