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ISSN : 1226-7155(Print)
ISSN : 2287-6618(Online)

International Journal of Oral Biology Vol.46 No.1 pp.30-38
DOI : https://doi.org/10.11620/IJOB.2021.46.1.30

Autophagy inhibition by cudraxanthone D regulates epithelial–mesenchymal transition in SCC25 cells

Su-Bin Yu^1,2, Tae-Hyun Bang², Hae-Mi Kang², Bong-Soo Park^2,3,4, In-Ryoung Kim^2,3,4*

¹Department of Dental Hygiene, Gimhae College, Gimhae 50811, Republic of Korea
²Department of Oral Anatomy, School of Dentistry, Pusan National University, Yangsan 50612, Republic of Korea
³Education and Research Team for Life Science on Dentistry, Pusan National University, Yangsan 50612, Republic of Korea
⁴Institute of Translational Dental Sciences, Pusan National University, Yangsan 50612, Republic of Korea

^*Correspondence to: In-Ryoung Kim, E-mail: biowool@pusan.ac.kr

Received February 11, 2021 Review March 11, 2021 Accepted March 15, 2021

Abstract

Cudraxanthone D (CD) is a natural xanthone compound derived from the root barks of Cudrania tricuspidata . However, the biological functions of CD in human metabolism have been rarely reported until now. Autophagy is the self-degradation process related to cancer cell metastasis. Here, we elucidated the effects of CD on human oral squamous cell carcinoma (OSCC) cells’ metastatic ability. We confirmed that CD effectively decreased the proliferation and viability of SCC25 human OSCC cells in time- and dose-dependent manners. Also, the metastasis phenotype of the SCC25 cell (migration, invasion, and epithelial–mesenchymal transition [EMT]) was inhibited by CD. To further investigate the mechanism by which CD inhibited the metastatic capacity, we detected the relationship between EMT and autophagy in the SCC25 cells. The results revealed that CD inhibited the metastasis of the SCC25 cells by attenuating autophagy. Thus, our findings produced a potential novel agent for the treatment of human OSCC metastasis.

Key Words : Autophagy , Epithelial-mesenchymal transition , Oral squamous cell carcinoma , Xanthone

초록

키워드 :

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This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/bync/4.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Introduction

자가포식작용(autophagy)은 저산소증, 영양결핍 상태, 여러 세포화 학적 작용과 같은 스트레스 상태로부터 세포의 항상성 파괴를 막기 위 해 발생하는 현상이다[1]. 자가포식작용 과정 동안, 이중막 구조의 자가 포식소체가 형성되고, 이것은 용해소체와 융합되어 그 내부에 포함된 여러 기관 및 물질을 분해시킨다[2]. 자가포식작용은 세포자멸사나 암 세포의 전이와 같은 많은 병리적 및 생리적 대사와 관련 있는 것으로 알 려져 있다. 종양세포에서의 자가포식작용은 ‘양날의 검’이라 불리는데, 종양형성 과정에서 스트레스에 의한 단백질 변화를 막음으로써 종양을 억제하는 기능과, 세포 대사 균형을 위한 기질을 분배하며 종양의 성장 에 기여하는 역할이 있다. 많은 선행연구에서 자가포식작용을 조절하는 것이 종양세포의 증식 및 전이를 막는 데 얼마나 중요한 것인지 강조하 고 있다[3-6].

종양의 전이를 결정하는 것은 상피세포가 간엽성세포로 이행되는 성 질에 의존하게 되는데, 이 현상은 국소적 침윤을 시작으로 진행된다[7]. 국소적 침윤이 시작되면 상피세포는 자체의 성질을 잃고 간엽성 성질을 가진 다른 형태의 세포로 형태 및 기질이 전환되면서 세포 이동능이 증 가하게 된다[8]. 많은 선행연구에서 종양세포의 상피간엽이행은 자가포 식작용과 깊은 관련성을 가진다고 보고된 바 있는데, 한 연구에서는 자 가포식 현상이 증가되면 종양세포의 상피 및 간엽 성질 전환을 촉진시 켜 종양의 전이를 촉진시킨다는 보고가 있었다[9-11]. 이러한 결과들 을 바탕으로 자가포식작용과 상피간엽이행의 상호관계를 파악하는 것 은 종양의 전이를 조절할 수 있는 핵심이다.

Cudraxanthone D는 동아시아에 주로 서식하는 꾸지뽕나무 뿌리껍 질에서 추출한 천연 크산톤 화합물이다[12]. 이 성분은 전통적으로 예 로부터 다양한 질병에 많이 사용된 천연 약물로 알려져 있다[13-16]. 그러나, 이 나무의 여러 성분 중 하나인 cudraxanthone D는 사람 구강 암세포를 비롯한 그 어느 암세포에서도 연구된 바가 없으며, 이 약물의 생물학적 활성에 대하여도 알려진 바가 거의 없다. 따라서 본 연구에서 는, 사람 구강편평상피세포암종세포의 전이에 관여하는 자가포식작용 의 역할에 대하여 조사하였고, cudraxanthone D 약물이 일련의 과정 에서 어떠한 효과를 보이는지, 또한 구강암 진행을 억제시켜줄 새로운 항암제로서의 가능성이 있는지를 알아보고자 한다.

Materials and Methods

1. 세포배양(cell culture)

본 연구에서 사용한 세포는 Ca9-22, SCC25, CAL27이며, America Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하 였다. HSC4 세포주는 전북대학교 치의학전문대학원 구강병리학교실의 조성대 교수 연구팀으로부터 분양 받았다(Jeonju, Korea). CAL27 세포 는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA), SCC25 세포는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Nutrient Mixture F-12 (Thermo Fisher Scientific), HSC4는 Minimum Essential Medium/Earle’s Balanced Salt Solution (Thermo Fisher Scientific) 배양액을 사용하였고, 모 든 배양액에는 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin– streptomycin이 첨가되었으며, 37℃, 5% 이산화탄소(CO₂)가 포함된 배양기에서 배양하였다. 본 연구에서 사용한 시약인 cudraxanthone D는 10 mM 농도로 이메틸 일산화황(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹여 4℃에 보관하며, 필요 시마다 희석하여 사용하였다.

2. 세포생존율 측정(cell viability assay)

사람구강편평상피암종세포의 세포생존율은 3-[4,5-dimethylthiazol- 2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석법으로 측정되었다. 96-well plate에 세포를 분주하고 cudraxanthone D 약 물을 각각 0, 10, 25, 100 μM 농도로 배양액에 희석하여 100 μL씩 24시간 동안 접종하였다. 시약 처리 종료 후, 각각의 well에 있던 배 양액을 제거하고, 100 μL의 MTT 시약(500 mg/mL)을 각각의 well 에 처리하여 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. MTT 시약에 의해 형 성된 formazan crystal은 DMSO (200 μL/well)에 녹이고 10분 동 안 shaker 위에 올려두었다. 변화된 색은 620 nm 파장으로 ELISA reader (Tecan, Männedorf, Switzerland)에 의해 측정된 흡광도로 정량화되었고, 세포생존율은 대조군과 비교하여 백분율로 결정되었다.

3. 세포증식 및 이동능 측정(wound healing assay)

Wound healing assay는 구강암세포의 증식 및 이동능을 측정하고 자 진행하였다. 세포는 6-well plate의 80–90% 면적에 달하도록 배 양되었다. 1 mm 피펫 팁을 이용하여 well의 한가운데 wound를 형성 하고, 세포잔사는 phosphate-buffered saline (PBS) 용액으로 2회 수세하였다. 그 후 각 군의 조건에 맞는 시약을 24시간 동안 처리하였 고, wound 형성 직후와 24시간 후 wound 영역 안으로 증식 및 이주 된 세포들의 양을 비교하였고, 이미지는 도립현미경(Sigma, St. Louis, MO, USA)의 200배율 렌즈로 관찰 및 획득하였다.

4. 종양세포 이동 및 전이능(migration & invasion assay)

세포 이주능 및 전이능 측정은 8.0 μm 크기의 pore polycarbonate membrane으로 구성된 trans well (Corning Costar, Cambridge, MA, USA)을 이용하였다. 전이능 측정은 trans well membrane 상방 에 200 μg/mL로 희석된 matrigel을 40 μL 코팅하고 2시간 동안 경화 시킨 뒤 실험을 진행하였다. 다음으로, 각 well에 분주된 구강암세포주 들은 각각 3-Methyladenine (3MA), resveratrol, cudraxanthone D 에 의해 지시된 농도 및 시간만큼 처리되었다. Trans well membrane 의 상부에는 serum free 배지로 채우고, 하부에는 10% FBS가 포함된 배지를 800 μL 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 환경에서 배양하였다. 시약 처리가 종료된 세포들은 메탄올로 고정하여 30분 동안 헤마톡실린-에 오신 염색을 진행하였고, 그 후 도립현미경으로 관찰하였다(Olympus, Tokyo, Japan).

5. 면역형광염색(immunofluorescent staining)

3MA, resveratrol, cudraxanthone D에 처리된 각각의 구강암세 포군은 Lab-Tek^TM II Chamber Slide (Nunc; Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA)에서 배양되었다. 24시간 후, 세포들은 acridine orange (AO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 1 μg/ mL 농도로 염색되었다. 이미지는 Zeiss LSM 750 레이저 다초점 형광 현미경(Zeiss, Göttingen, Germany)을 이용하여 스캔하였다.

6. 단백질 전기영동(Western blot assay)

각 군의 구강암세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후, scrape라는 도구를 이용하여 배양접시 바닥에 붙어있는 세포를 긁어 모아 8,000 rpm, 10분 동안 원심분리 하였다. 수집한 세포들은 150 μL 세포용 해 용액(RIPA buffer, 2 mM PMSF, protease inhibitor cocktail)으 로 4℃에서 1시간 이상 용해시켰고, 그 후 13,200 rpm에서 30분 동 안 원심분리 하였다. 세포용해액에서 단백질만 포함되어 있는 상층액 을 분리한 후 추출된 각 군의 단백질 양은 Bradford (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) 정량법으로 측정하였다. 20 μg의 전체 단백질을 10% SDS/PAGE gel로 변성 분리하여 polyvinylidene fluoride 막 (Millipore, Billerica, MA, USA)에 전이시켰다. 그리고 membrane 을 5% nonfat milk가 함유된 TNE 용액으로 상온에서 1시간 동안 반 응시켜 1차 항체의 비특이적 반응을 blocking하였다. 본 실험에서 확 인하고자 하는 단백질 발현을 측정하기 위해 해당되는 1차 항체를 4℃ 에서 20시간 동안 반응시켰다. 이어서 TNE 용액으로 10분 간격, 6 회 세척한 다음 2차 항체를 실온에서 1시간 반응시키고, 다시 TNE 용액으로 10분 간격, 6회 세척하였다. 단백질 발현량의 최종 확인은 Chemiluminescent HRP Substrate Kit (Millipore)와 SuperSignal West Femto substrate (Pierce, Rockford, IL, USA)를 반응시킨 후 Image Quant LAS 500 (GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Sweden) 기기를 이용하여 시행하였다.

7. 통계 처리(statistical analysis)

본 실험에 대한 모든 결과는 3회 실험하여 얻어진 평균 및 그 표준편 차로 표기하였다. 그룹 간 통계적 차이는 student t-test와 one-way ANOVA (Dunnett’s multiple comparison test)를 적용하여 분석하 였고, 대조군과 비교하여 p ＜ 0.05인 경우 통계적 유의성을 가지는 것 으로 판정하였다.

Results

1. Cudraxanthone D가 사람구강편평상피암종세포주의 세포 생존율에 미치는 영향

Cudraxanthone D의 적절한 농도를 찾아내기 위해, 사람구강편평 상피세포암종 세포주인 SCC25, HSC4, CAL27 3가지 세포주를 이 용하였고, 0, 10, 25, 50, 100 μM 농도로 24시간 동안 각각 처리하 였다. 처리 후 세포생존율은 MTT 분석법으로 흡광도를 측정하여 백 분율로 계산하였다. Cudraxanthone D는 이들 oral squamous cell carcinoma (OSCC) 세포에 대해 100 μM 이상의 농도에서 세포독성 을 가지는 것을 확인하였다(Fig. 1). 그중에서 특히 SCC25 세포가 cudranxanthone D에 가장 민감하게 반응하였고 25 μM 이상의 농도에 서부터 농도의존적으로 세포생존율이 감소함을 보였다. 따라서, 뒤따르 는 실험에서는 SCC25 세포만 사용하여 진행하였다.

2. SCC25 세포에 대한 cudraxanthone D의 상피간엽이행 억제효과

Cudraxanthone D가 SCC25 세포의 전이능에 영향을 미치는지 확 인하기 위하여, wound healing assay, invasion assay 기법을 이 용한 실험을 진행하였다. 세포의 증식 및 이주능은 wound healing assay를 이용하여 확인하였다. Wound healing assay 결과, 대조군 (non-treated)의 scratch wound 영역은 증식한 세포로 wound 형성 직후 대비 약 55% 정도 회복되었다. 반면, cudraxanthone D 50 μM 처리 그룹은 scratch wound 영역으로 증식된 세포의 비율이 wound 형성 직후 대비 약 11%로 나타났다(Fig. 2A).

세포의 침윤능을 확인하기 위하여 transwell membrane 상부에 matrigel을 적용한 invasion assay 실험을 진행하였다. SCC25 세포 의 cudraxanthone D 50 μM 처리그룹에서는 대조군과 비교하여 세포 의 matrigel 및 membrane 침윤능이 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2B). 그러므로 cudraxanthone D는 SCC25 세포에서 세 포의 이동 및 침윤능을 효과적으로 감소시키는 데 기여하는 것을 확인 하였다.

3. Resveratrol이 유도하는 SCC25의 자가포식작용에 대한 cudraxanthone D의 억제효과가 상피간엽이행에 미치는 영향

많은 선행연구에서 자가포식작용을 유도하는 것이 여러 종류의 종 양세포의 epithelial–mesenchymal transition (EMT) 진행과 관련 있다는 결과를 발표한 바 있다[5,11]. 그에 기반하여, 본 연구에서는 cudraxanthone D가 억제하는 EMT의 메커니즘을 조사하고자 실험 을 진행하였다. 자가포식작용 유도제에는 여러 가지 종류가 있는데, 최 근 resveratrol이라는 천연 물질이 많은 주목을 받고 있다[17-20]. 본 연구진의 선행연구에서, resveratrol이 OSCC 세포에서 자가포식작용 을 유도하는 것을 확인하였다[21]. 따라서, 본 연구에서 사용한 자가포 식작용 유도체는 resveratrol이며, 이 현상을 확인하기 위해 AO 염색과 western blot 실험을 진행하였다. 그 결과, resveratrol은 AO에 염색 이 된 자가포식소체가 다수 발견되었고, 흔히 알려져 있는 자가포식작 용 억제제인 3MA가 이 현상을 감소시키는 것을 확인하였다. Cudraxanthone D를 처리한 그룹에서는 resveratrol로 유도한 AO 염색소체 들이 3MA 처리군과 비슷한 수준으로 현저히 감소되는 현상을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). 또한 western blot 분석법으로 자가포식작용 관련 단백질인 ATG5, p62, LC3B의 발현을 확인하였고, resveratrol에 의해 발현량이 증가된 단백질들은 3MA와 cudraxanthone D 처리에 의해 억제되는 현상이 관찰되었다. 그리고 3MA와 cudraxanthone D 약물 을 병행 처리하였을 때는 각각의 약물을 단독으로 처리하는 것보다 훨 씬 큰 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다(Fig. 3B and 3C). 이러한 결과는 cudraxanthone D가 자가포식작용 억제제로 작용하는 것을 의 미하며, 3MA와 cudraxanthone D의 병행 처리는 더욱 효과적으로 자 가포식작용을 억제하는 것을 확인하였다.

선행연구를 바탕으로 본 연구진은 cudraxanthone D와 3MA가 억제 하는 자가포식작용이 SCC25 세포의 EMT 및 전이에 영향을 미칠 것이 라는 가설을 설정하였다. 가설 검증을 위하여, wound healing assay 와 invasion assay가 수행되었다. 실험 결과 resveratrol 처리 그룹의 scratch wound 영역은 형성 직후로부터 24시간 경과 후 증식된 세포 들로 거의 가득 찬 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 3MA와 cudraxanthone D 단독 처리 그룹의 scratch wound 영역은 대조군과 resveratrol로 자가포식작용을 유도한 그룹과 비교하여 형성 직후로부터 거의 변화가 없는 것을 관찰하였다(Fig. 4). 위의 결과와 유사하게, 같은 그룹 으로 세포 침투능을 확인한 결과 resveratrol 처리에 의해 증가된 세포 의 이동은 3MA와 cudraxanthone D에 의해 억제되는 것을 확인하였 다(Fig. 5). 다음으로, cudraxanthone D의 자가포식작용 억제효과가 SCC25 세포의 이동을 억제하는 것과의 관련성을 확립하기 위해 EMT 관련 단백질 발현 변화를 western blot으로 확인하였다. Resveratrol, cudraxanthone D, 그리고 3MA의 단독 처리 또는 병용 처리는 간엽 층 표지자인 상피표지자인 E-cadherin의 변화를 보여주지 못했다. 또 한 snail은 resveratrol에 의해 증가하였고, 3MA와 cudraxanthone D의 단독 처리만으로도 현저하게 감소되는 것을 확인하였다. 그러나 Slug의 경우는 reseveratrol 처리에 감소하는 경향을 보였고, 마찬가지 로 3MA와 cudraxanthone D의 단독 처리만으로도 현저하게 감소되 는 것을 확인하였다(Fig. 6). 3MA와 cudraxanthone D의 병행 처리는 단독 처리와 비교하여 EMT 관련 단백질 중 slug의 발현 억제에 더욱 효과적이었다.

Discussion

지난 수십 년 동안, 셀 수없이 많은 식물 추출 천연 항암제가 개발 및 사용되어 왔고, 선행연구에도 천연물질 기반 항암제의 이점에 대해 수 많은 보고를 하고 있지만 여전히 구강암환자의 5년 생존율은 약 50% 이하로 낮은 수치를 유지하고 있다[22-24]. 식물에서 추출한 여러 물질 중에서도, cudraxanthone D는 꾸지뽕나무 껍질에 포함된 성분으로 현재까지 사람 종양에 대해 연구된 바는 거의 전무한 실정이다. 이 식물 에 포함된 성분 중 하나인 cudraxanthone H는 OSCC 세포의 성장을 억제하고 세포자멸사를 유도하는 효과를 가진다고 보고된 바 있다[13]. 유사하게 cudraxanthone I는 백혈병세포인 CCRF-CEM 세포에서 caspase 단백질 경로를 통한 세포자멸사를 유도한다는 보고가 있었다 [25]. 또한, 이 식물에 포함된 xanthone 성분은 간 보호기능이 있는 것 으로 보고된 바 있다[26]. Xanthone 계열의 수많은 물질들은 여러 연 구에서 다양한 생물학적 활성을 가지는 것으로 보고된 바 있다[22,27- 30]. 그러나 꾸지뽕나무의 다양한 추출물 중에서도 cudraxanthone D 에 대한 연구와 구강암세포의 전이에 관한 연구는 진행된 바가 없다. 따 라서 본 연구에서는, 처음으로 사람구강암세포에 대한 cudraxanthone D의 전이능 억제 효과에 초점을 맞추어 추후 항암치료제로서의 가능성 을 제시하고자 하였다.

첫 번째로, cudraxanthone D의 세포독성 효과를 확인하기 위하여 3 종류의 구강암세포주에 0부터 100 μM까지의 농도로 24시간 처리하였 고, 시간농도의존적으로 세포 성장이 저해되거나 혹은 세포생존율이 감 소하는 것을 확인할 수 있었다. 3가지 세포 중 cudraxanthone D에 가 장 민감하게 반응한 SCC25 세포를 선택하여 이어지는 전이능 실험을 진행하였다. 암의 재발과 사망률은 거의 종양세포의 전이에 많은 영향 을 받는다. 특히 구강암의 경우 주로 경부림프절을 통한 전이가 일어나 예후가 좋지 않은 것으로 알려져 있다[31-33]. 이에 근거하여 종양세포 의 전이능을 확인할 수 있는 wound healing assay를 진행하고, EMT 관련 단백질 발현을 확인한 결과 cudraxanthone D는 SCC25 세포의 EMT를 억제하는 방향의 실험 결과를 도출하였다. 이러한 결과로 cudraxanthone D가 억제하는 EMT의 메커니즘을 찾기 위하여 또 다른 가 설을 설정하였다.

최근 많은 연구에서 종양세포의 이동 및 침윤능과 자가포식작용이 밀 접한 연관성을 가진다는 보고가 발표되고 있다. 그 예로 한 선행연구에 서 압축력이 자가포식작용을 증대시키고, 이 현상은 HeLa 세포의 이주 를 강화시킨다는 결과가 있었다[34]. 또한, Gao 등[35]의 연구에서는 glycochenodeoxycholate이라는 물질이 HCC 세포의 자가포식작용 을 활성화 시킴으로써 침윤능 및 이동능을 증가시킨다는 보고가 있었으 며, chloroquine을 이용한 자가포식작용 억제 시 human non-small lung adenocarcinoma A549 세포의 전이능을 약화시킨다는 것이 보 고된 바 있다[5]. 이러한 이유들로, cudraxanthone D의 SCC25 세포 EMT를 억제하는 것이 자가포식작용과 연관이 있을 것이라는 가설을 설정하고 추후 실험을 진행하였고, 자가포식작용 유도제로는 다양한 선 행연구에 근거하여 resveratrol을 사용하였다[19,36-38]. 본 연구진 의 선행연구에서 세포독성을 유발하지 않고 자가포식작용을 유도하는 resveratrol의 농도를 확인한 바 있으며[21], 본 연구에서는 25 μM 농 도로 자가포식작용을 유도하여 다음 단계를 진행하였다.

예측대로 resveratrol은 자가포식작용을 유도하였으며, 흔히 알려진 자가포식작용 억제제인 3MA는 resveratrol이 유도하는 자가포식작용 을 억제하였다. Cudraxanthone D 또한 resveratrol이 유도하는 자가 포식작용을 억제하는 방향으로 작용하였다. 이러한 작용의 기전을 증 명하기 위하여, wound healing assay, invasion assay, western blot assay를 Fig. 4, 5 그리고 6에 지시된 조건으로 수행하였다. 결과 적으로 자가포식작용을 유도하는 것은 세포 증식 및 이동을 증대시키고 EMT 관련 단백질들의 발현도 EMT가 촉진되는 방향으로 조절하는 것 을 확인하였다. 3MA를 통한 자가포식작용 억제는 SCC25 세포의 이 동성을 억제하고 EMT가 저해되는 방향으로 단백질 발현을 유도한다는 것을 알 수 있었다. 자가포식작용억제로 인해 발생하는 EMT 저해현상 은 3MA보다 cudraxanthone D에 의한 것이 훨씬 효과적이었으며, 단 독 처리보다는 3MA와 cudraxanthone D 두 가지 저해제를 병행 처리 하는 것이 더욱 효과적이었다.

지금까지의 실험결과를 조합해 본 결과 cudraxanthone D는 사람구 강암편평세피암종세포인 SCC25 세포의 자가포식작용을 억제함으로 써 상피간엽이행 현상을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 본 연 구는 in vitro에 그쳐 추후 동물모델에서의 검증까지 진행된다면, cudraxanthone D는 추후 구강암의 전이를 조절할 수 있는 새로운 치료제 로 개발될 것이라 생각한다.

Acknowledgements

This research was supported by the National Research Foundation of Korea (NRF) grant funded by the Korea government (NRF-2019R1A2C108405712) and 2020 BK21 FOUR Program of Pusan National University.

Figure

Fig. 1.

The effect of cudraxanthone D (CD) on cell viability in oral sqamous carcinoma cell (OSCC) cells. OSCC cells (SCC25, HSC4, and CAL27) were treated with CD (0–100 μM) for 24 hours. Each experiment was performed in triplicate. Error bars denote mean ± standard deviation.

^*p < 0.05 versus untreated cell, respectively.

Fig. 2.

Cudraxanthone D (CD) suppressed SCC25 cell metastasis properties. Cells were treated with 50 μM CD for 24 hours. Photographs of (A) wound area and (B) invaded cell were observed under an inverted microscopy. Representative images and bar graphs of SCC25 cells healing wound area treated with CD for 24 hours. Representative images and bar graphs of SCC25 cells healing wound area treated with CD for 24 hours. Error bars represent mean ± standard deviation. 100× magnification.